NADPH氧化酶4在心血管損傷中的作用機(jī)制

石丹丹 寧梓淇 劉美霞 劉劍剛

【摘要】心血管結(jié)構(gòu)和功能損傷是許多心血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，許多研究表明氧化應(yīng)激在缺血性心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等諸多病理性心血管損傷中發(fā)揮重要作用。NADPH氧化酶（Nox）是調(diào)控氧化還原信號(hào)的關(guān)鍵酶，而血管內(nèi)的活性氧主要來(lái)源于Nox4。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)Nox4在不同階段或不同刺激下會(huì)發(fā)揮不同甚至截然相反的作用，如雙向調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展、雙向作用影響血壓等。現(xiàn)總結(jié)Nox4在不同心血管損傷中的不同影響及作用機(jī)制，為后續(xù)的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】NADPH氧化酶4；活性氧；心血管損傷

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.02.000

Mechanism of the Role of Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Oxidase?4 in Cardiovascular Injury

SHI Dandan1，2，NING Ziqi1，2，LIU Meixia1，LIU Jiangang1

（1.Xiyuan Hospital，Chinese Academy of Chinese Medical Sciences，Institute of Geriatrics of Chinese Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100091，China; 2. Graduate School of China Academy of Chinese Medicial Sciences，Beijing 100700，China）

【Abstract】The damage of cardiovascular structure and function is an important pathological basis of many cardiovascular diseases. Many studies have shown that oxidative stress plays an important role in many pathological cardiovascular injuries，such as ischemic heart disease，atherosclerosis，hypertension，etc. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase （Nox）?is a key enzyme in the regulation of redox signaling，and intravascular reactive oxygen species are mainly originated from Nox4.With the deepening of the research，it has been found that Nox4 plays different or even opposite roles at different stages or under different stimuli，such as bidirectional regulation of atherosclerosis progression，bidirectional effects affecting blood pressure，etc. This article summarizes the different roles and mechanisms of Nox4 in different cardiovascular injuries，providing a theoretical basis for subsequent research.

【Keywords】Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4; Reactive oxygen species; Cardiovascular injury

據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，心血管疾病每年導(dǎo)致近1?790萬(wàn)的死亡，是全球死亡的主要原因，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康[1]。眾多研究結(jié)果證實(shí)，氧化應(yīng)激損傷在其中扮演關(guān)鍵角色。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用紊亂（更傾向于氧化），導(dǎo)致產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）在體內(nèi)蓄積，進(jìn)而損傷核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子。在心血管疾病中，氧化應(yīng)激是重要的介導(dǎo)者。

ROS的來(lái)源眾多，主要包括線粒體呼吸鏈以及NADPH氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，Nox），其中Nox4是血管內(nèi)ROS的主要來(lái)源[2]。Nox4參與心血管的各種生理病理過(guò)程，對(duì)維持心血管結(jié)構(gòu)和功能起著關(guān)鍵作用。多種研究表明，在心肌梗死、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的不同階段或不同刺激下，Nox4所發(fā)揮的作用也不同。現(xiàn)主要從以下幾個(gè)方面闡明Nox4在心血管損傷中的雙向作用。

1??Nox4的結(jié)構(gòu)和功能

Nox是特殊的產(chǎn)生ROS的酶類家族，由胞膜成分、細(xì)胞色素b558[gp91phox和p22phox，其中g(shù)p91phox有NADPH、黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）潛在結(jié)合位點(diǎn)]、3種胞質(zhì)蛋白（p67phox、p47phox和p40phox）及小G蛋白R(shí)ac組成，其主要生物學(xué)功能是產(chǎn)生ROS，以維持細(xì)胞正常的生理活動(dòng)。但是在異常情況下，Nox家族蛋白出現(xiàn)異常表達(dá)或激活，不僅導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS過(guò)量產(chǎn)生和蓄積，還會(huì)作用于線粒體及其他ROS相關(guān)酶系統(tǒng)（如線粒體電子傳遞鏈）導(dǎo)致其功能異常，繼而引發(fā)ROS的繼發(fā)性蓄積，最終形成惡性循環(huán)，持續(xù)不斷地對(duì)組織造成損傷[3]。目前已經(jīng)鑒定出Nox的七個(gè)亞型，包括Nox1-5和雙重氧化酶（dual oxidase，DUOX）1及DUOX2，其中Nox1、Nox2、Nox4和Nox5在血管系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)，而在血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell，EC）中，Nox4的表達(dá)則高于其他Nox亞型[4]，被認(rèn)為是血管內(nèi)ROS的主要來(lái)源[2]。

在Nox家族中，Nox4最為特殊：（1）Nox4為構(gòu)成性活性，與穩(wěn)定的p22phox胞膜亞基結(jié)合后具有活性，其活性被聚合酶-δ相互作用蛋白2（polymerase delta-interacting protein 2，Poldip2）調(diào)節(jié)，其激活無(wú)需額外的調(diào)控亞基；（2）Nox家族其他亞基生成超氧化物自由基O2·－，O2·－自由基依次發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2，而Nox4可直接產(chǎn)生H2O2[5-6]。這是由于其獨(dú)特的內(nèi)在激活的Nox4脫氫酶結(jié)構(gòu)域。Nox4包括C端的脫氫酶結(jié)構(gòu)域（包含F(xiàn)AD和NADPH結(jié)合位點(diǎn)）和N端的6個(gè)跨越膜的α-螺旋（包括環(huán)A-E），位于協(xié)調(diào)兩個(gè)血紅素在第三和第五跨膜螺旋上。正常情況下電子從NADPH通過(guò)FAD和兩個(gè)血紅素基傳遞給O2產(chǎn)生O2-，由于Nox4上的E環(huán)上結(jié)構(gòu)，O2-被快速歧化為H2O2。見表1及圖1。

2??Nox4對(duì)心血管損傷的影響及作用機(jī)制

2.1??Nox4調(diào)控EC的定向遷移，促進(jìn)血管生成

血管的生成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，與EC密切相關(guān)。在促血管生成的刺激下，EC進(jìn)行增殖、遷移和分化，并招募血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）或周細(xì)胞來(lái)覆蓋以形成新的血管。Nox4介導(dǎo)的血管生成受多種因素如缺氧、缺血、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等的調(diào)控。當(dāng)機(jī)體處于缺氧缺血狀態(tài)時(shí)，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）隨即生成。HIF-1α一方面刺激Nox4的表達(dá)，生成ROS，另一方面，HIF-1α激活下游靶標(biāo)VEGF[11，12]。VEGF作為最有效的內(nèi)皮特異性血管生成生長(zhǎng)因子，與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2（vascular endothelial growth factor receptor 2 ，VEGFR-2）相結(jié)合，激活酪氨酸激酶途徑，促進(jìn)EC的增殖、遷移，從而加速體內(nèi)血管的形成。血管生成素2（angiopoietin2，Ang2）與VEGF相互協(xié)調(diào)促進(jìn)血管生成。VEGF可促進(jìn)Ang2的表達(dá)，破壞血管穩(wěn)定性，從而促使血管生成增加[13]。實(shí)驗(yàn)[14，15]證明，Nox4可降低VEGF和HIF-1α的水平，Nox4缺失時(shí)VEGF、VEGFR-2、Ang2的表達(dá)顯著降低。此外，Nox4的激活使得血管內(nèi)生成大量H2O2，NO增多，高水平的H2O2減少核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 ，Nrf2）的降解，促進(jìn)血紅素加氧酶-1（heme oxygenase 1，HO-1）的生成，發(fā)揮血管保護(hù)功能[16]。已有實(shí)驗(yàn)證明，股動(dòng)脈結(jié)扎的全身Nox4敲除小鼠相較于對(duì)照組來(lái)說(shuō)，其體內(nèi)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、NO及HO-1的表達(dá)降低，Nrf2蛋白水平降低，且小鼠的血流恢復(fù)顯著減弱[17]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是血管生成的另一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，在Nox4信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)[18]證明，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)的人臍靜脈EC中Nox4蛋白的表達(dá)上調(diào)，而在Nox4敲除小鼠的心臟EC中，TGF-β1誘導(dǎo)EC細(xì)胞增殖、遷移和管形成被消除；在體內(nèi)，TGF-β1誘導(dǎo)的血管生成在Nox4敲除的小鼠中顯著降低。體外實(shí)驗(yàn)[19]中使用Nox4敲除的人臍靜脈EC進(jìn)行血管生成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示血管生成顯著減少。

綜上，Nox4在血管生成中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，特別是在缺血狀態(tài)下的血運(yùn)重建中起積極作用。Nox4參與調(diào)控多種與血管生成密切相關(guān)的細(xì)胞因子如VEGF、HIF-1α、TGF-β1等的信號(hào)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)新血管的生成（見圖2）。正因?yàn)镹ox4在血管生成中的關(guān)鍵作用，它已成為治療癌癥、外周動(dòng)脈疾病、腦梗死、心肌梗死等疾病的重要靶標(biāo)之一。已有研究[20]表明Nox4與某些腫瘤，如纖維肉瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、星型膠質(zhì)瘤等的血管生成相關(guān)。因此，Nox4可能成為腫瘤治療中具有潛力的靶點(diǎn)之一，其抑制可能有助于抑制腫瘤的血管生成。

圖2 ?Nox4調(diào)控血管生成的機(jī)制

2.2??Nox4雙向調(diào)節(jié)參與動(dòng)脈粥樣硬化性血管損傷的發(fā)生發(fā)展

Nox4在動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）中具有復(fù)雜作用。在AS進(jìn)展過(guò)程中，Nox4生成的ROS促進(jìn)氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）的生成和泡沫細(xì)胞的形成。同時(shí)，具有細(xì)胞毒性的ox-LDL還通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活NF-κB信號(hào)通路，降低eNOS活性，減少NO生成，同時(shí)增加炎癥因子如白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、Nod樣受體蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）等釋放，引起EC功能障礙，從而進(jìn)一步促進(jìn)AS的形成。實(shí)驗(yàn)[21]證明，在AS中可觀察到Nox4表達(dá)上調(diào)，而在全身性Nox4敲除小鼠中AS進(jìn)展緩慢。

值得注意的是，有其他學(xué)者提出Nox4對(duì)內(nèi)皮功能也有一定的保護(hù)作用。Nox4產(chǎn)生的H2O2不與NO相互作用，不會(huì)導(dǎo)致過(guò)氧亞硝酸鹽的生成，從而保護(hù)血管內(nèi)皮。在低密度脂蛋白受體缺失的小鼠中，Nox4的表達(dá)可抑制EC功能障礙和AS的發(fā)展[22]。最新研究[23]發(fā)現(xiàn)，EC的Nox4功能紊亂，可能通過(guò)增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、上調(diào)水溶性環(huán)氧化合物水解酶（soluble epoxide hydrolase，sEH）水平，從而誘導(dǎo)血管炎癥，加速AS進(jìn)程（見圖3）。

圖3 ?Nox4在AS中的作用機(jī)制

此外，關(guān)于Nox4在AS中的雙向作用，還可能與細(xì)胞類型有關(guān)。有研究者發(fā)現(xiàn)，VSMC的Nox4與EC的Nox4在AS中發(fā)揮相反的作用：VSMC的Nox4可能對(duì)AS起保護(hù)作用，EC的Nox4可能促進(jìn)AS的進(jìn)展[23]。AS是一個(gè)復(fù)雜的疾病過(guò)程，多個(gè)因素參與其中，對(duì)于Nox4在AS中的作用機(jī)制和具體調(diào)控方式仍需要更深入的研究和驗(yàn)證。

2.3??Nox4影響血管舒縮功能從而影響血壓

Nox4在高血壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。VSMC異常增殖和向內(nèi)膜遷移是高血壓發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵階段，而基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）降解VSMC的細(xì)胞外基質(zhì)是其遷移的必要步驟。Nox4可介導(dǎo)胰島素樣生長(zhǎng)因子1誘導(dǎo)的MMP-2和MMP-9的激活，從而啟動(dòng)VSMC的遷移、增殖[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[24]表明，高線粒體Nox4表達(dá)的小鼠主動(dòng)脈僵硬度顯著增加。在鹽敏感型高血壓大鼠中敲除Nox4基因，鹽敏感型大鼠模型對(duì)高鹽的血壓反應(yīng)減弱[25]。

關(guān)于Nox4在高血壓中的作用，目前還存在一些爭(zhēng)議。其他研究[26-27]發(fā)現(xiàn)高血壓患者中Nox4水平較低，過(guò)表達(dá)的Nox4可增強(qiáng)血管舒張作用，降低血壓，對(duì)心血管系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)作用。這些結(jié)果之間的矛盾可能與不同的實(shí)驗(yàn)條件、樣本來(lái)源和研究方法有關(guān)?？傮w而言，Nox4在高血壓中的作用仍處于早期階段，進(jìn)一步的研究將有助于更好地理解Nox4與高血壓之間的關(guān)系，以及發(fā)掘其在治療高血壓方面的潛在作用。

2.4??Nox4加重心肌缺血再灌注損傷

缺血性心肌病是心血管損傷的基礎(chǔ)和重要因素之一。Hearse[28]等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)恢復(fù)血流時(shí)心肌損傷反而加重，被稱為“再灌注損傷”。ROS是心肌缺血再灌注損傷的潛在介質(zhì)，通過(guò)介導(dǎo)線粒體功能障礙和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而損傷心肌細(xì)胞。Nox4作為心肌細(xì)胞中主要的Nox亞型，抑制Nox4衍生的ROS可防止線粒體功能障礙和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而減輕心肌缺血再灌注損傷。研究[29-30]發(fā)現(xiàn)，心臟特異性Nox4過(guò)表達(dá)小鼠在心肌缺血再灌注期間表現(xiàn)出ROS產(chǎn)生與梗死面積的增加，而心臟特異性Nox4敲除小鼠心肌損傷顯著減少。另一項(xiàng)研究[31]發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Nox4的表達(dá)后，小鼠心肌缺血再灌注后梗死面積減小。這些發(fā)現(xiàn)表明，Nox4在心肌缺血再灌注損傷中起有害作用。

2.5??Nox4可促進(jìn)心血管細(xì)胞的衰老與凋亡

年齡被認(rèn)為是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素，隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體抗氧化能力減弱，使得氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡向氧化應(yīng)激傾斜，最終導(dǎo)致心血管損傷。在主動(dòng)脈VSMC和線粒體中，Nox4的表達(dá)和ROS水平隨年齡增加而增加，老年主動(dòng)脈中Nox4 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯高于年輕主動(dòng)脈。體外實(shí)驗(yàn)[32]同樣表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ROS及其相關(guān)Nox4的表達(dá)和活性都隨著衰老而增加。血管Nox4水平與年齡呈正相關(guān)，這提示Nox4可能成為治療衰老性心血管疾病的潛在治療靶點(diǎn)。

此外，Nox4可通過(guò)多種機(jī)制觸發(fā)細(xì)胞凋亡。過(guò)表達(dá)的Nox4可活化促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑，進(jìn)而激活p53。這個(gè)過(guò)程伴隨著促凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白（B-cell lymphoma-2 related X protein，Bax）和caspace信號(hào)通路中caspace-9、caspace-3的上調(diào)，增加心肌細(xì)胞的凋亡[33]。TGF-β依賴于Nox4的上調(diào)和ROS的產(chǎn)生，通過(guò)調(diào)節(jié)p38、PTP1B/VEGFR/Akt和Notch信號(hào)通路影響EC功能[34]，誘導(dǎo)EC凋亡。此外，Nox4還可以通過(guò)引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[35]，其具體機(jī)制為Nox4與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的肌醇需求酶1α（inositol requiring enzyme 1 alpha，IRE1α）作用，募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（tumor necrosis factor receptor-associated factor?2，TRAF2），并與凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（apoptosis signal regulating kinase-1，ASK1）形成IRE1α-TRAF2-ASK1復(fù)合體，進(jìn)而激活c-Jun氨基端蛋白激酶（c-Jun N-terminal protein?kinase，JNK）的磷酸化，激活凋亡信號(hào)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。死亡受體5（death receptor 5，DR5）是外源性凋亡通路的主要組成部分，由p53依賴的轉(zhuǎn)錄激活介導(dǎo)。Nox4下調(diào)阻止了ROS/p53/DR5軸的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡[36]。此外，Nox4還會(huì)通過(guò)破壞線粒體功能導(dǎo)致細(xì)胞衰老和死亡。Nox4直接產(chǎn)生H2O2會(huì)破壞線粒體，從而導(dǎo)致線粒體功能障礙，促進(jìn)細(xì)胞的衰老和凋亡[37]（見圖4）。

圖4 ?Nox4調(diào)控細(xì)胞衰老及凋亡的作用機(jī)制

3??總結(jié)與展望

Nox4作為血管中ROS的主要來(lái)源，常常發(fā)揮雙向調(diào)控作用，在不同的心血管疾病作用不同。隨著眾多學(xué)者對(duì)Nox4研究的不斷深入，關(guān)于Nox4的幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題仍待解答。（1）Nox4功能的細(xì)胞類型特異性：目前尚不清楚Nox4在不同細(xì)胞類型中的具體功能和調(diào)控機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究；（2）Nox4的亞細(xì)胞定位和作用：Nox4被發(fā)現(xiàn)存在于多個(gè)亞細(xì)胞位置如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、核內(nèi)等，目前對(duì)于Nox4亞細(xì)胞定位的調(diào)控機(jī)制了解還比較有限，需要進(jìn)一步的研究來(lái)揭示其詳細(xì)信息；（3）如何調(diào)控Nox4的雙向作用，有賴于確定不同狀態(tài)下ROS的不同水平。了解不同狀態(tài)下ROS水平的變化以及其對(duì)細(xì)胞功能的影響，是調(diào)控Nox4雙向作用的關(guān)鍵。新的特異性Nox4抑制劑可能為AS、高血壓、冠心病等心血管性疾病的治療帶來(lái)新的前景。

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收稿日期：2023-07-26