烏梅提取物對(duì)納米細(xì)菌致大鼠腎結(jié)石形成的影響及機(jī)制探討

劉淼，谷江，張永春，夏劍鋒，楊錦春，董安濤

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴陽550004)

腎結(jié)石是一種以間歇性腎絞痛和血尿?yàn)橹饕憩F(xiàn)的疾病，發(fā)病率、復(fù)發(fā)率高，對(duì)腎功能危害大，嚴(yán)重危害人群健康。從腎結(jié)石成分來看，腎結(jié)石主要以含鈣結(jié)石為主，其中又以草酸鈣結(jié)石最多。既往研究認(rèn)為，鈣鹽沉積、腎鈣斑沉積可能與腎結(jié)石的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，納米細(xì)菌(NB)在95%的腎結(jié)石患者血液中檢測(cè)到，是腎結(jié)石形成的起始核心[2]。在人體內(nèi)，NB可利用機(jī)體血液中的鈣源發(fā)揮生物礦化作用，與炎性介質(zhì)、基質(zhì)蛋白一起形成早期腎結(jié)石的晶核，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)石的形成[3]。烏梅是由薔薇科植物梅的干燥近成熟果實(shí)加工而成，其主要化學(xué)成分為有機(jī)酸、黃酮、萜類、甾醇等[4]，其中高富含量的檸檬酸、蘋果酸、丁二酸等，對(duì)泌尿系結(jié)石的形成具有有效拮抗作用[5,6]。但烏梅對(duì)NB導(dǎo)致腎結(jié)石形成的影響及作用機(jī)制尚不明確。2015年2月～2016年9月，我們采用NB建立了大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型，探討烏梅提取物對(duì)NB所致腎草酸鈣結(jié)石形成的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 8周齡雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量200～250 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。烏梅提取物購自西安賽奧生物技術(shù)有限公司；8-羥基脫氧鳥苷(8-OHDG)測(cè)試盒、丙二醛(MDA)試劑盒、檸檬酸試劑盒購自南京建成生物工程研究所；PCR擴(kuò)增試劑盒及引物由上海生工生物工程有限公司提供。

1.2 NB分離、培養(yǎng)及制備

1.2.1 標(biāo)本采集 選擇2015年2月～2016年6月于我院泌尿外科行開放手術(shù)取石的腎結(jié)石患者16例，男9例、女7例，年齡32～49歲，排除感染、內(nèi)分泌疾病、多系統(tǒng)結(jié)石等患者。術(shù)中無菌采集結(jié)石標(biāo)本，并保存于-80 ℃低溫冰箱。將結(jié)石放置于1 mol/L HCl中去礦物質(zhì)處理，然后PBS中和、洗滌，碾碎成粉末狀，20 000 r/min離心40 min后，經(jīng)0.22 μm的濾頭加壓過濾，收集濾過液。

1.2.2 NB的培養(yǎng)及制備 取處理后的結(jié)石濾過液1 mL，加入含10%熱滅活γ-胎牛血清(γ-FBS)的PMBI1640，30 d換液一次，培養(yǎng)條件為37 ℃、pH 7.4、5%CO2、95%空氣。培養(yǎng)4周后，培養(yǎng)管底部出現(xiàn)白色菌群沉淀，棄去培養(yǎng)管中的培養(yǎng)液，留取管底部分，徹底混勻后，移入離心管中，加入適量生理鹽水，4 ℃離心40 min，去上清。沉淀中加入1 mol/L HCl 0.5 mL混勻，37 ℃放置30 min；加入Tris中和，4 ℃離心40 min，留沉淀，配制為NB混懸液備用。經(jīng)RT-PCR反應(yīng)鑒定NB中16s rRNA基因，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳可見1 409 bp處出現(xiàn)目的片段，確定NB培養(yǎng)成功。

1.3 動(dòng)物分組及模型建立 30只大鼠隨機(jī)分為A、B、C、D、E組各6只。A組第1天以尾靜脈一次性注射生理鹽水1 mL作為正常對(duì)照，B、C、D、E組均于第1天以尾靜脈一次性注射NB混懸液1 mL制備大鼠腎結(jié)石模型。

1.4 干預(yù)方法 A、B組第2天起均以生理鹽水2 mL/d灌胃，C、D、E組第2天起分別以0.05、0.10、0.15 g/mL烏梅提取物2 mL/d灌胃。各組大鼠均灌胃干預(yù)4周。

1.5 尿液草酸(Ox)、鈣(Ca2+)、檸檬酸、8-OHDG水平測(cè)定 各組干預(yù)4周后，用代謝籠收集24 h尿液，應(yīng)用高錳酸鉀褪色法測(cè)定尿液Ox 水平，全自動(dòng)生化儀測(cè)定尿液Ca2+水平，檸檬酸試劑盒測(cè)定尿液檸檬酸水平，8-OHDG測(cè)試盒以及酶標(biāo)儀測(cè)定尿液8-OHDG水平。

1.6 腎組織草酸鈣結(jié)晶形態(tài)觀察及結(jié)晶量分級(jí)評(píng)分 收集尿液次日，乙醚麻醉大鼠，縱向剖開雙腎，取左側(cè)腎臟，用10%甲醛固定，石蠟包埋，3 mm切片，行HE染色觀察腎組織草酸鈣結(jié)晶形態(tài)。計(jì)數(shù)平均每個(gè)高倍視野內(nèi)大鼠左腎草酸鈣結(jié)晶數(shù)量。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為腎臟剖面結(jié)晶量分級(jí)：0級(jí)為無結(jié)石、結(jié)晶形成；1級(jí)為少量結(jié)石、結(jié)晶形成，每個(gè)視野3個(gè)以下；2級(jí)為較多結(jié)石、結(jié)晶形成，每個(gè)視野3～5個(gè)；3級(jí)為較多結(jié)石、結(jié)晶形成，每個(gè)視野6～10個(gè)；4級(jí)為大量結(jié)石、結(jié)晶形成，每個(gè)視野10個(gè)以上，甚至結(jié)石、結(jié)晶成團(tuán)，堵塞腎小管。將0～4級(jí)分別記為 1、2、3、4、5分。

1.7 腎組織MDA水平檢測(cè) 采用硫代巴比妥酸法。取右腎皮質(zhì)研磨制成10%的勻漿，保存于PBS中，離心取上清，應(yīng)用MDA試劑盒檢測(cè)腎組織MDA水平。

2 結(jié)果

2.1 各組尿液Ox、Ca2+、檸檬酸、8-OHDG水平比較 B組尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平均高于A組，檸檬酸水平低于A組(P均<0.05)。C、D、E組尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平均低于B組，檸檬酸水平均高于B組(P均<0.05)。D、E組尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平均低于C組，檸檬酸水平均高于C組(P均<0.05)。E組尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平均低于D組，檸檬酸水平均高于D組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組尿液Ox、Ca2+、檸檬酸、8-OHDG水平比較

注： 與A組比較，*P<0.05；與B組比較，﹟P<0.05；與C組比較，△P<0.05；與D組比較，▲P<0.05。

2.2 各組腎組織草酸鈣結(jié)晶形態(tài)及結(jié)晶量評(píng)分比較 A組無草酸鈣結(jié)晶，B組草酸鈣結(jié)晶明顯較多，C、D、E組草酸鈣結(jié)晶數(shù)量較B組明顯減少。見圖1。A、B、C、D、E組草酸鈣結(jié)晶量評(píng)分分別為(1.00±0)、(4.83±0.40)、(3.83±0.41)、(3.00±0.63)、(2.50±0.84)分，B、C、D、E組草酸鈣結(jié)晶量評(píng)分均高于A組，C、D、E組草酸鈣結(jié)晶量評(píng)分均低于B組(P均<0.05)。

圖1 各組腎組織草酸鈣結(jié)晶形態(tài)(HE染色，×200)

2.3 各組腎組織MDA水平比較 A、B、C、D、E組腎組織MDA水平分別為(3.41±0.05)、(3.95±0.15)、(3.90±0.04)、(3.68±0.10)、(3.55±0.07)分，B、C、D、E組MDA水平均高于A組，D、E組MDA水平均低于B組(P均<0.05)。

3 討論

腎結(jié)石是泌尿外科最常見的疾病之一。近年來，腎結(jié)石在我國的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，5%～15%的人一生中會(huì)罹患腎結(jié)石，其中約80%為草酸鈣腎結(jié)石。草酸鈣腎結(jié)石的形成學(xué)說有多種觀點(diǎn)，包括腎鈣斑形成、過飽和結(jié)晶、抑制物缺乏、免疫損傷等[7]。

NB為革蘭陰性菌，廣泛存在于自然界的礦物質(zhì)中和生物體內(nèi)，可耐高溫、強(qiáng)酸等。近年研究發(fā)現(xiàn)，NB具有特殊的生物礦化能力，能在菌體周圍產(chǎn)生羥磷灰石碳酸鹽結(jié)晶，從而導(dǎo)致結(jié)石的形成[6]。NB在pH7.4的生理性鈣磷水平中能形成羥基磷灰石碳酸鹽結(jié)晶，產(chǎn)生堅(jiān)硬的礦化外殼覆蓋于菌體周圍。此外，NB可聚集環(huán)境中的鈣離子并形成礦化納米顆粒，作為活性中心，黏附、侵入并破壞腎集合管的上皮細(xì)胞和腎乳頭細(xì)胞，形成磷灰石晶核，從而誘發(fā)結(jié)石形成[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，B組腎組織草酸鈣結(jié)晶量評(píng)分均高于A組，腎組織草酸鈣結(jié)晶明顯較多，提示NB能夠促進(jìn)大鼠腎草酸鈣結(jié)晶、結(jié)石的形成。因此，抑制NB的生物礦化作用，對(duì)于抑制大鼠腎草酸鈣結(jié)晶、結(jié)石的形成具有重要意義。

烏梅是一種安全性高的藥食同源藥材，其藥理作用廣泛，在抑菌、抗腫瘤、抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化、治療結(jié)腸炎方面具有明顯作用。王萍等[9]研究發(fā)現(xiàn)，烏梅含有檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、天冬氨酸、熊果酸等能明顯抑制結(jié)石形成的有機(jī)酸，各有機(jī)酸的協(xié)同作用能與Ca2+螯合，降低結(jié)石形成的風(fēng)險(xiǎn)。檸檬酸是烏梅有機(jī)酸中的主要成分，占烏梅有機(jī)酸總量的19%，較Ox而言，檸檬酸能優(yōu)先螯合Ca2+形成可溶性鹽并抑制草酸鈣結(jié)晶形成[10]，有實(shí)驗(yàn)已證實(shí)檸檬酸及檸檬酸鹽在體外可抑制一水草酸鈣的形成及聚集[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，與B組相比，C、D、E組尿液腎組織草酸鈣結(jié)晶數(shù)量及評(píng)分均明顯降低，尿液檸檬酸水平均明顯增高，提示烏梅提取物可使腎結(jié)石大鼠的草酸鈣結(jié)晶明顯減少，隨著烏梅提取物干預(yù)濃度的增加，結(jié)晶結(jié)石級(jí)別逐漸下降，尿檸檬酸的排泄逐漸增加，表明烏梅能有效抑制NB的礦化作用，減少大鼠草酸鈣結(jié)晶、結(jié)石的形成。

Ox是一種簡(jiǎn)單的二羥基酸，是很多動(dòng)、植物和微生物的一種代謝終產(chǎn)物，在動(dòng)物體內(nèi)常以鹽的形式存在，在自然界中最普通的形式是草酸鈣。研究發(fā)現(xiàn)，尿液中輕微的Ox超載即比嚴(yán)重的鈣超載對(duì)草酸鈣形成的影響更明顯[11]。近期研究表明，腎小管上皮細(xì)胞暴露于Ox將會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞膜表面性質(zhì)改變、線粒體功能中斷、活性氧(ROS)形成等毒性反應(yīng)，而高Ox誘導(dǎo)的高活性氧水平進(jìn)一步導(dǎo)致氧化還原失衡、脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致腎臟炎性反應(yīng)發(fā)生、細(xì)胞膜完整性喪失以及腎上皮組織損傷，繼而利于晶體在細(xì)胞膜上黏附以及結(jié)晶在腎組織內(nèi)的聚集[12]，同時(shí)Ox超載誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞膜完整性的喪失將引起腎小管重吸收障礙，導(dǎo)致腎鈣的泄漏，表現(xiàn)為尿鈣排泄量的增多[10,13]。ROS作用于細(xì)胞核中DNA后可發(fā)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致DNA-蛋白交聯(lián)、嘌呤氧化等許多化學(xué)修飾，引起DNA氧化損傷，使羥基自由基從穩(wěn)定的生物分子如蛋白質(zhì)和代謝物中獲取電子和H+，導(dǎo)致堿基修復(fù)系統(tǒng)損傷，產(chǎn)生錯(cuò)誤的堿基配對(duì)，出現(xiàn)基因突變甚至DNA裂解，產(chǎn)生大量8-OHDG[14]。8-OHDG 是反映DNA過氧化損傷的標(biāo)記物，存在于氧化損傷的腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核[15]。而自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的氧化終產(chǎn)物為MDA。MDA可以引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性。本研究發(fā)現(xiàn)，B組尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平及腎組織MDA水平均高于A組，提示NB能夠促進(jìn)大鼠尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平增高，并促進(jìn)腎組織過氧化損傷；C、D、E組尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平均低于B組，D、E組腎組織MDA水平均低于B組，提示烏梅提取物能降低大鼠尿液Ox水平，進(jìn)而減少尿Ca2+的排泄，并對(duì)自由基有較好的清除作用，減少過氧化損傷，從而抑制草酸鈣結(jié)石的形成。

綜上所述，烏梅提取物對(duì)NB所致的大鼠腎草酸鈣結(jié)石具有明顯的抑制作用，其機(jī)制可能與降低大鼠尿液Ox水平，進(jìn)而減少尿Ca2+的排泄，減少脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)。