血清Hcy、Cys C聯(lián)合尿足細(xì)胞檢測對2型糖尿病腎病的早期診斷價(jià)值

劉倩，王彥，胡三強(qiáng)，楊伏猛

(1連云港市第二人民醫(yī)院，江蘇連云港222006；2連云港市第三人民醫(yī)院)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)患者最主要的慢性微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因，因此早期診斷DN顯得尤為重要[1]。目前，DN的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，其早期的診斷也缺乏統(tǒng)一的指標(biāo)。研究表明，DN的發(fā)生與氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等有一定關(guān)聯(lián)[2]。同型半胱氨酸(Hcy)、胱抑素C(Cys C)與機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)，而足細(xì)胞是構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障的主要細(xì)胞。因此，本研究旨在檢測DN患者血清Hcy、 Cys C和尿足細(xì)胞等指標(biāo)，評(píng)估其對DN的早期診斷價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)告如下。

anomalies over the western Pacific Ocean warm pool and its possible mechanism

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年3月～2016年3月于連云港市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的2型糖尿病(T2DM)患者130例，依據(jù)1999年WHO的糖尿病診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)確診。其中男64例、女66例，年齡(56.1±7.5)歲；排除原發(fā)性腎小球疾病、腎小管間質(zhì)性疾病、急慢性心血管疾病、尿路感染及近期腎毒性藥物使用等。根據(jù)DN診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，參照尿白蛋白/尿肌酐比值(UACR)分為3組，即正常白蛋白尿組(NA組，UACR<30 mg/g)42例、 微量白蛋白尿組(MA組，UACR 30～<300 mg/g)45例和大量白蛋白尿組(LA組，UACR≥300 mg/g)43例。同時(shí)選取體檢中心體檢健康者40例作為對照組，其中男19例、女21例，年齡(55.8±6.9)歲。本研究經(jīng)連云港市第二人民醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 血清Hcy、 Cys C水平檢測 采集空腹靜脈血5 mL，常溫3 000 r/min離心10 min，分離出血清。采用貝克曼AU5800全自動(dòng)生化分析儀檢測血清Hcy、 Cys C水平，Hcy檢測試劑盒購自北京九強(qiáng)公司，Cys C檢測試劑盒購自上海藍(lán)怡公司，均按試劑盒說明書操作。

1.3 尿足細(xì)胞檢測方法[4]留取新鮮晨尿10 mL，離心5 min，棄去上清液，尿沉渣用PBS洗3次；沉渣中加入1 mL PBS重懸并平均分配至2個(gè)試管，第1管加入PE標(biāo)記鼠抗人足盂蛋白(PCX)單克隆熒光抗體(美國R&D公司)50 μL作為試驗(yàn)管，第2管加入PBS 50 μL作為對照管，均在4 ℃孵育45 min；離心5 min，用PBS洗3次；沉渣中加入2 mL PBS重懸，并全部轉(zhuǎn)移至BD絕對計(jì)數(shù)管；置于振蕩器上進(jìn)行充分混勻后，選擇中速上BD FACS Calibur 流式細(xì)胞儀(美國BD公司)進(jìn)行檢測。以試驗(yàn)管計(jì)數(shù)減去對照管計(jì)數(shù)絕對細(xì)胞數(shù)。絕對細(xì)胞數(shù)=(熒光標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)×已知熒光小球總數(shù)×稀釋倍數(shù))/(熒光小球計(jì)數(shù)×樣本總體積)。

2.3 血清Hcy、Cys C和尿足細(xì)胞對DN的早期診斷價(jià)值 將對照組和NA組患者作為研究對象，以腎小球?yàn)V過率(GFR)<90 mL/min作為DN診斷切點(diǎn)。運(yùn)用ROC分析顯示，血清Hcy、Cys C水平和尿足細(xì)胞數(shù)量診斷DN的最佳切點(diǎn)分別為8.75 μmol/L、0.76 mg/L和0.73 個(gè)/μL，其對應(yīng)的曲線下面積分別為0.74、0.79和0.76。三個(gè)指標(biāo)聯(lián)合診斷DN的最佳切點(diǎn)為81%，曲線下面積為0.92。3個(gè)指標(biāo)診斷敏感性Cys C>足細(xì)胞>Hcy，且三者聯(lián)合檢測可以顯著提高診斷敏感性(P均<0.05)。見表2。

2.1 各組血清Hcy、Cys C水平及尿足細(xì)胞數(shù)量比較 NA、MA、LA組血清Hcy、Cys C水平及尿足細(xì)胞數(shù)量均高于對照組(P均<0.05)；并且，隨著DN的進(jìn)展，血清Hcy、Cys C水平及尿足細(xì)胞數(shù)量逐漸增加(P均<0.05)。見表1。

2 結(jié)果

DN是最常見的DM慢性微血管并發(fā)癥，其病理特征表現(xiàn)為腎小球硬化，一旦出現(xiàn)臨床蛋白尿，腎功能將出現(xiàn)不可逆的損傷，是DM患者致死的主要原因之一[5]。Hcy屬于含硫氨基酸，是甲硫氨酸循環(huán)的代謝產(chǎn)物，是一類具有微血管損傷作用的氨基酸。其能對血管內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷，促進(jìn)脂蛋白氧化、平滑肌細(xì)胞增生和血小板聚集，影響腎血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小球基底膜功能。DM患者體內(nèi)糖脂代謝異常會(huì)導(dǎo)致Hcy生成過多，進(jìn)而誘導(dǎo)氧自由基生成，導(dǎo)致微血管氧化應(yīng)激損傷[6,7]。Wang等[8]研究顯示，DN患者血清Hcy水平顯著高于正常人群，并伴隨著疾病的加重而升高，并認(rèn)為Hcy是一個(gè)可用于預(yù)測早期DN的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Mao等[6]研究也表明，Hcy能夠預(yù)測DN的發(fā)生和進(jìn)展。DN患者體內(nèi)Hcy升高的原因可能包括：①由于腎功能受損，其催化Hcy轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼岷挺?丁酮酸的代謝途徑減弱，從而表現(xiàn)為腎臟清除Hcy能力不足；②DN患者體內(nèi)含硫氨基酸的代謝和Hcy再次甲基化能力不足，導(dǎo)致體內(nèi)Hcy產(chǎn)生過多[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，伴隨DM患者尿蛋白的增加血清Hcy水平不斷增高，表明血清Hcy對DN的早期診斷和病情判斷具有一定的價(jià)值。

使用AMOS進(jìn)行結(jié)構(gòu)方程建模及分析，以找出船員疲勞與疲勞影響因子之間的聯(lián)系，船員的負(fù)荷矩陣見表5，基本研究方法見圖2。

表1 各組血清Hcy、Cys C和尿足細(xì)胞檢測結(jié)果比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與NA組比較，bP<0.05；與MA組比較，cP<0.05。

表2 血清Hcy、Cys C、尿足細(xì)胞檢測對DN診斷價(jià)值(%)

3 討論

2.2 血清Hcy、Cys C和尿足細(xì)胞與UACR的關(guān)系 血清Hcy、Cys C水平、尿足細(xì)胞數(shù)量均與UACR呈正相關(guān)(r分別為0.83、0.83、0.84，P均<0.05)。

那些所謂的，不甘心、憤怒、悲傷，在我一天天的閱讀時(shí)光里消失殆盡。當(dāng)我合上書本，痊愈之后，我開始了，我最璀璨的生活……□

Cys C是一種由所有有核細(xì)胞產(chǎn)生的低分子量蛋白，具有半胱氨酸蛋白酶抑制劑效應(yīng)，能夠自由通過腎小球?yàn)V過并被腎小管上皮細(xì)胞所重吸收。其生成速度恒定，不受腎臟因素、炎癥、感染、肝臟疾病、飲食等因素影響，是反映腎小球?yàn)V過率變化的內(nèi)源性標(biāo)志物，同時(shí)可反映腎小球和腎小管損傷[10]。Javanmardi等[11]研究發(fā)現(xiàn)，血清Cys C是監(jiān)測早期DN理想的生物標(biāo)志物，但不能用于判斷疾病治療后的轉(zhuǎn)歸。Jeon等[12]研究顯示，血清Cys C水平的升高同時(shí)反映腎小球?yàn)V過率的下降和UACR的升高，可作為預(yù)測DN早期診斷的指標(biāo)。Jeon等[13]也發(fā)現(xiàn)，在DM正常蛋白尿階段，Cys C水平即出現(xiàn)了升高，因此可作為一個(gè)潛力的標(biāo)志物用于判斷腎功能的異常。本研究發(fā)現(xiàn)，在DM正常蛋白尿階段，血清Cys C水平即出現(xiàn)升高，且伴隨著尿蛋白的增加而升高。

歐洲法院也指出，雖然通常具有管轄權(quán)的法院不得對另一成員法院適用的實(shí)體法進(jìn)行比較分析，但可以對其他成員國適用的取證規(guī)則、訴訟語言、判決送達(dá)期限等程序性規(guī)則進(jìn)行評(píng)估⑤Case C 428/15，27 October 2016，para.57.。

在DN早期階段，腎臟病理學(xué)表現(xiàn)為腎小球基底膜增厚和系膜基質(zhì)擴(kuò)張，足細(xì)胞參與構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障，對大分子物質(zhì)滲透性起決定性作用。足細(xì)胞表面主要標(biāo)志蛋白(PCX)是一種攜帶高負(fù)電荷的糖蛋白，作用是防止足突塌陷。如腎小球發(fā)生病變，脫落的足細(xì)胞可伴隨尿液排出，因此可對尿中標(biāo)記的足細(xì)胞進(jìn)行測定[4]。Dalla等[14]研究顯示，當(dāng)DM患者出現(xiàn)微量白蛋白尿時(shí)，腎臟足細(xì)胞密度出現(xiàn)減少；當(dāng)病程進(jìn)展至大量蛋白尿時(shí)，則密度降低更為明顯。Tagawa等[15]在DM動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞自噬對于保持溶酶體自穩(wěn)性發(fā)揮重要作用；當(dāng)足細(xì)胞脫落出現(xiàn)功能受損時(shí)，尿中可以檢測到大量蛋白質(zhì)。本研究結(jié)果顯示，在DM正常蛋白尿階段，已經(jīng)出現(xiàn)足細(xì)胞的脫落；且隨著疾病進(jìn)展，脫落足細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。由此可以推測，尿中足細(xì)胞測定對DN的早期預(yù)測具有一定的臨床診斷價(jià)值。

通過相關(guān)性分析還發(fā)現(xiàn)，血清Hcy、Cys C水平和尿足細(xì)胞數(shù)量與UACR呈正相關(guān)。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，3個(gè)指標(biāo)對于DN早期診斷，其診斷敏感性分別為Cys C>足細(xì)胞>Hcy，提示聯(lián)合檢測可以顯著提高診斷DN的效能。