免疫熒光染色質(zhì)量影響因素分析

宋瑞龍　周子彥　徐天祺　潘士鋒　劉宗平

摘要?免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的一項(xiàng)技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快和便于觀察等特點(diǎn)。影響免疫熒光染色質(zhì)量的因素多種多樣，從熒光染料、抗體、樣品前處理、染色過程等幾個(gè)重要的方面入手，就如何提高免疫熒光染色質(zhì)量，以獲得一張高分辨率的圖片做了詳細(xì)的介紹。該研究有利于提高免疫熒光染色質(zhì)量，為生命科學(xué)研究提供了有力幫助。

關(guān)鍵詞?免疫熒光染色技術(shù);抗體;影響因素

中圖分類號(hào)?Q2-33文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）16-0124-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.16.036

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Influencing?Factors?of?Quality?of?Immunofluorescent?Staining?Technology

SONG?Rui?long，ZHOU?Zi?yan，XU?Tian?qi?et?al?（College?of?Veterinary?Medicine，Yangzhou?University/Jiangsu?Co?innovation?Center?for?Prevention?and?Control?of?Important?Animal?Infectious?Diseases?and?Zoonoses，Yangzhou，Jiangsu?225009）

Abstract?As?one?of?the?most?widely?used?immunolabeling?techniques，immunofluorescence?has?several?advantages?including?high?specificity，high?sensitivity，rapid?detection?and?clear?positioning.?However，the?quality?of?immunofluorescent?staining?could?be?affected?by?multiple?factors，such?as?fluorescent?dyes，antibodies，sample?preparation?and?staining?process.Starting?with?those?vital?factors，we?introduced?how?to?improve?the?quality?of?immunofluorescent?staining?so?as?to?obtain?a?high?resolution?image?in?detail.This?study?improved?the?quality?of?immunofluorescent?staining?and?provided?powerful?help?for?life?science?research.

Key?words?Immunofluorescent?cell?staining?technology;Antibody;Influencing?factor

免疫熒光染色技術(shù)是一種以免疫學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合生物化學(xué)技術(shù)和顯微技術(shù)發(fā)展而來的蛋白等分子檢測(cè)技術(shù)。這種技術(shù)是Coons等在1941年首先建立的，尤其近三十幾年來，免疫標(biāo)記技術(shù)和檢測(cè)技術(shù)有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，其穩(wěn)定性、靈敏性和特異性都有了飛速的發(fā)展。免疫熒光染色技術(shù)作為一種科學(xué)研究的技術(shù)手段，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)、免疫學(xué)等科學(xué)研究，以及臨床診斷方面[1-5]。因此，提高免疫熒光染色質(zhì)量尤為重要。

免疫熒光技術(shù)利用了抗原與抗體高度特異性結(jié)合的原理，將某種可測(cè)定的物質(zhì)偶聯(lián)到抗體或者抗原上，通過檢測(cè)標(biāo)記物的有無和含量，對(duì)樣品中待檢抗原或抗體進(jìn)行定性、定位和定量檢測(cè)。物質(zhì)原子核外電子具有多個(gè)不同大小的能級(jí)，最低能級(jí)稱為基態(tài)。當(dāng)光子能量等于2個(gè)不同能級(jí)的能量差時(shí)，低能級(jí)電子吸收光子能量后，躍遷至高能級(jí)的激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)極不穩(wěn)定，會(huì)向低能級(jí)狀態(tài)躍遷，釋放出不同能量的光子，這些光子能夠通過熒光顯微鏡檢測(cè)到，進(jìn)而對(duì)檢測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定性、定位、定量等檢測(cè)[6]。熒光物質(zhì)在持續(xù)受到激發(fā)光激發(fā)后，由于不能夠恢復(fù)到基態(tài)，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度減弱或淬滅。免疫熒光染色技術(shù)包括試驗(yàn)準(zhǔn)備階段、染色過程和樣品拍攝，以下將從熒光染料、抗體、樣品前處理、染色過程等方面闡述如何提高免疫熒光染色的質(zhì)量，以獲得高清晰度的圖片。

1?試驗(yàn)準(zhǔn)備

1.1?免疫熒光染色方法的選擇

免疫熒光染色技術(shù)分為直接法和間接法。直接法是將熒光標(biāo)記物偶聯(lián)在抗原/抗體上，直接與相應(yīng)的抗體/抗原反應(yīng);間接法是先用未標(biāo)記的一抗與抗原充分反應(yīng)后，再利用熒光標(biāo)記的二抗與已經(jīng)結(jié)合在抗原上的一抗結(jié)合，達(dá)到檢測(cè)抗原的目的[1]。直接法操作簡(jiǎn)單、特異性高，非特異性染色少，便于相同宿主來源的不同蛋白的共定位，但是其靈敏性相對(duì)比間接法低。間接法相對(duì)直接法操作復(fù)雜，特異性稍低，但靈敏度高，染色更加靈活，成本低。一般情況下，間接法因上述特點(diǎn)應(yīng)用更加廣泛，而直接法主要應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù)或者無法購(gòu)買到不同宿主來源的一抗時(shí)而進(jìn)行的蛋白共定位檢測(cè)試驗(yàn)中。

1.2?抗體的選擇

抗原通常包含多個(gè)抗原決定簇，抗體按是否由單一抗原決定簇刺激機(jī)體產(chǎn)生而分為單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體是經(jīng)一種抗原決定簇刺激后的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)HAT培養(yǎng)基篩選，ELISA檢測(cè)效價(jià)，得到陽性克隆株，注射到動(dòng)物腹水中，收集純化得到的抗體[7-8]。多克隆抗體只需將具有多個(gè)抗原決定簇的抗原直接注射到動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行幾次免疫，ELISA測(cè)其效價(jià)合格后，收集血液離心得到上清，純化后得到多克隆抗體[9-11]。

單克隆抗體特異性高[12]，但因單克隆抗體由單一抗原決定簇抗原刺激得到，所以只能識(shí)別一個(gè)抗原表位，靈敏度相對(duì)較低，且單克隆抗體的抗原表位一旦破壞，將直接影響其與抗原的結(jié)合，導(dǎo)致免疫熒光染色的失敗[8，13]。另外，單克隆抗體制備過程復(fù)雜，價(jià)格也相對(duì)較高。而多克隆抗體制備過程簡(jiǎn)單，周期短，價(jià)格相對(duì)較低[14]。因多克隆抗體由多個(gè)抗原決定簇刺激機(jī)體得到，所以其能識(shí)別多個(gè)抗原表位，相同條件下，靈敏度更高，對(duì)于表達(dá)量較低的目標(biāo)蛋白更容易檢出。另外即使少數(shù)多克隆抗體的抗原表位破壞，免疫熒光染色的結(jié)果也不會(huì)受到影響。但是，因?yàn)槠淠茏R(shí)別多個(gè)抗原表位，所以其特異性也相對(duì)較低。

綜上所述，與目標(biāo)蛋白直接結(jié)合的一抗，在條件允許的條件下，盡量選擇相同來源的免疫原或者選擇已驗(yàn)證種屬反應(yīng)性的抗體[15]。如果進(jìn)行不同目標(biāo)蛋白的雙染或多染時(shí)，這些不同蛋白所對(duì)應(yīng)的一抗應(yīng)該來源于不同宿主。單克隆抗體與多克隆抗體、種屬免疫原、反應(yīng)性和抗體的宿主來源是抗體選擇最主要考慮的因素，其直接決定著免疫熒光染色的背景、特異性和成敗。熒光偶聯(lián)的二抗應(yīng)選擇與一抗相對(duì)應(yīng)的抗體，及抗一抗的二抗[16]。

1.3?熒光染料的選擇

隨著免疫熒光技術(shù)的不斷進(jìn)步，免疫熒光染料也得到了飛速的發(fā)展，目前市場(chǎng)上常用的熒光染料有Alexa?Fluor?系列、CFTM系列、ATTO系列、DyLight系列和Cy系列等，使用最多的是Alexa?Fluor?系列和CFTM系列[17]。

染料的選擇應(yīng)與激光共聚焦顯微鏡所配激光器的激發(fā)波長(zhǎng)相匹配（350、405、458、488、514、561、633?nm），當(dāng)需要多重?zé)晒鈽?biāo)記時(shí)，這些熒光探針的激發(fā)波長(zhǎng)或發(fā)射波長(zhǎng)盡量相差大些，可以區(qū)分開。350?nm或者405?nm激光器激發(fā)的藍(lán)色染料有CF?350、Alexa?Fluor?350、CF?405S/?CF?405?M和Alexa?Fluor?405等。488?nm激光器能夠激發(fā)綠色熒光，常用熒光染料有CF?488A、Alexa?Fluor?488、FITC、FAM、DyLight?488和Cy2等。其中FITC熒光強(qiáng)度極易受到pH影響，且易淬滅，在熒光染料選擇中，常用Alexa?Fluor488或者CF?488A替代。543～555?nm激光器能夠激發(fā)橙紅色熒光，染料有CF?543、Alexa?Fluor?546、ATTO550、Cy3、DyLight?549、Rhodamine?（TRITC）[18]。568～594?nm激光器激發(fā)紅色熒光，染料有CF?568、Alexa?Fluor568、ATTO?565、Rhodamine?Red等。620～660?nm激光器激發(fā)遠(yuǎn)紅外熒光，染料有CF?620R、LightCycler?Red?640等。680～790?nm激光器激發(fā)近紅外熒光，染料有CF?680R/680、Alexa?Fluor?680、IR?Dye?680等[19]。

在進(jìn)行雙重或多重免疫熒光染色時(shí)，一般先通過ThermoFisher等網(wǎng)站上的熒光光譜查看器進(jìn)行預(yù)選擇，不同熒光的激發(fā)波長(zhǎng)或發(fā)射波長(zhǎng)盡量無交叉，防止串色，影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。熒光染料各有各的特性，Alexa?Fluor?系列熒光染料激發(fā)和發(fā)射光譜窄，且在較寬的pH范圍內(nèi)保持穩(wěn)定（pH4～10），可用于雙重或多重?zé)晒馊旧庾V重疊少[20]。ATTO?系列熒光染料具有較強(qiáng)的光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，已被應(yīng)用于STED?（stimulated?emission?depletion，受激發(fā)射損耗）?超高分辨率顯微成像技術(shù)[21]。DyLight、CF?等具有較高的激發(fā)效率、良好的光穩(wěn)定性和pH?穩(wěn)定性等，從而被廣泛應(yīng)用于組織及細(xì)胞免疫熒光染色[20]。

1.4?抗體保存

應(yīng)該防止熒光抗體失活、污染以及熒光染料的脫落和淬滅。在抗體保存過程中，適量分裝，避免反復(fù)凍融。蛋白極易被塑料等吸附，如果用塑料管分裝，抗體中應(yīng)添加BSA等。為防止污染也可以添加0.01%的硫柳汞或者0.1%的疊氮化鈉。為防止淬滅，保存熒光抗體時(shí)應(yīng)該注意避光，可以利用錫箔紙包好，或者放在避光的容器中。

1.5?培養(yǎng)載體的選擇

根據(jù)貼壁情況，細(xì)胞可分為貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。貼壁細(xì)胞一般常用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，接種細(xì)胞前放置0.17?mm玻璃細(xì)胞爬片。懸浮細(xì)胞常用6孔板培養(yǎng)，免疫熒光染色處理后，取少量加在0.17?mm玻璃細(xì)胞爬片上。最后將細(xì)胞爬片倒扣到載玻片上，封片，放4?℃保存。

2?免疫熒光染色

免疫熒光染色流程主要包括細(xì)胞固定、透膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、封片以及每一步之間的洗滌等。

2.1?細(xì)胞固定

細(xì)胞固定是為了盡可能地使細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和物質(zhì)組成保存原有狀態(tài)，防止細(xì)胞死后發(fā)生自溶或破壞，以便最大程度地反映固定前的生命活動(dòng)，同時(shí)對(duì)細(xì)胞自身也起到了一定的固定作用[22]。

免疫熒光染色常用的固定劑有甲醛、多聚甲醛、戊二醛、丙酮、乙醇、甲醇等[23]。多聚甲醛較甲醛穩(wěn)定，不易析出[24];4%的多聚甲醛在細(xì)胞免疫熒光染色中最為常用[25-28]。在進(jìn)行破骨細(xì)胞骨架免疫熒光染色試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，4%的多聚甲醛固定20?min效果顯著好于其他固定劑的固定效果。因其易分解，4%的多聚甲醛最好現(xiàn)配現(xiàn)用。丙酮的組織穿透性強(qiáng)，可使蛋白沉淀，抗原固定較好，但對(duì)核固定較差，固定效果弱于多聚甲醛，且使細(xì)胞收縮嚴(yán)重。95%乙醇脫水性強(qiáng)，但同時(shí)也易引起組織收縮、變硬，能沉淀白蛋白、核蛋白和球蛋白等，也較為常用。甲醇的固定時(shí)間快，細(xì)胞收縮小，細(xì)胞核保存較戊二醛的反應(yīng)速度快，是優(yōu)良的前固定劑，但它的滲透速度較慢。盡管如此，不同蛋白各有其適應(yīng)的固定劑。

2.2?透膜處理

Triton?X-100作為免疫熒光染色最為常用的透膜劑，其實(shí)質(zhì)是一種非離子型表面活性劑，能夠溶解脂質(zhì)，增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，便于抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[29]。如果需檢測(cè)的目的蛋白屬于胞內(nèi)蛋白或者抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)位于胞內(nèi)的跨膜蛋白，抗體孵育前需進(jìn)行透膜處理[27]。對(duì)于一些抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)位于胞外膜上的目標(biāo)蛋白，是否進(jìn)行透膜處理對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不大。

Triton?X-100濃度和透膜時(shí)間并非越大或越長(zhǎng)越好，在破骨細(xì)胞骨架免疫熒光染色試驗(yàn)中，0.5%的Triton?X-100透膜處理20?min效果最佳。時(shí)間過短或濃度過低，會(huì)造成透膜不充分，抗體進(jìn)入胞內(nèi)不足，熒光強(qiáng)度低，圖像不清晰。相反，Triton?X-100濃度過高或透膜時(shí)間過長(zhǎng)都會(huì)造成細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)解離，致使顯微鏡下無法檢測(cè)到骨架結(jié)構(gòu)或只檢測(cè)到少量蛋白殘基。

2.3?樣品封閉

封閉處理的目的通常是減少抗體的非特異性結(jié)合，如非特異性抗體與內(nèi)源Fc受體（FcR）結(jié)合或與其他物質(zhì)之間的離子作用或疏水作用等[12]。最常用的封閉液有1%～5%的BSA溶液、脫脂奶粉溶液或血清溶液[30]。盡管如此，Buchwalow等[31]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性FcR在標(biāo)本固定后失去結(jié)合抗體Fc部分的能力。?同樣，也沒有發(fā)現(xiàn)任何離子作用或疏水作用的非特異性抗體結(jié)合，因此認(rèn)為傳統(tǒng)意義上的樣品封閉步驟在免疫熒光染色中是沒有必要的。

2.4?抗體孵育

抗體孵育目的是使抗體充分與目的蛋白抗原結(jié)合，其結(jié)合程度直接影響著免疫熒光染色的效果?？贵w濃度一般按照說明書推薦進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。通常37?℃孵育?1～2?h，可根據(jù)蛋白表達(dá)量的多少適當(dāng)調(diào)整時(shí)間，或者一抗4?℃過夜。一般情況下，環(huán)境溫度的升高對(duì)免疫熒光染色有明顯的影響，隨著溫度升高，熒光淬滅的可能性增大，因此適當(dāng)?shù)牡蜏丨h(huán)境對(duì)于免疫熒光染色和觀察效果更好。

2.5?洗滌

在細(xì)胞進(jìn)行固定處理前要用37?℃?PBS洗滌3遍，每遍1?min，以減少細(xì)胞的應(yīng)激和去除附著的雜質(zhì)[19]。固定后和透膜后各洗滌3遍，每遍2?min，去除其中的固定劑和Triton?X-100，封閉后的封閉液無需洗滌，只需用移液器吸凈[27]。孵育二抗前，要充分洗凈一抗，防止二抗與殘留的一抗結(jié)合，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，也可減少背景色。二抗孵育結(jié)束后，再充分洗滌殘留的二抗。

2.6?封片

封片時(shí)添加少許防淬滅劑可防止樣品淬滅。但并不是每種防淬滅劑都適合免疫熒光染色。常用甘油和PBS等量混合，因每種熒光染料適應(yīng)于不同的pH，建議封閉液使用前調(diào)整pH直至熒光染料的最適pH。目前商品化的防淬滅劑有Prolong?Gold、Mowiol、Vectashield和DABCO/NPG等。Prolong?Gold?（life?tech）含有防淬滅劑，封片后需要硬化一段時(shí)間，?可長(zhǎng)期保存;Mowiol封片后可長(zhǎng)期保存;Vectashield具有部分自發(fā)熒光，且會(huì)影響一些染料的光譜特性;而DABCO/NPG會(huì)嚴(yán)重影響某些染料的光譜特性，宜謹(jǐn)慎?使用。

2.7?pH

熒光素在溶液狀態(tài)下基本處于離子化狀態(tài)，故維持熒光素與溶劑之間的電離平衡至關(guān)重要。溶液的pH對(duì)免疫熒光強(qiáng)度影響極大，不同的熒光素標(biāo)記物都有自己適合的pH，pH改變能夠影響熒光素的熒光強(qiáng)度，在進(jìn)行免疫熒光染色時(shí)要注意熒光素標(biāo)記物適宜的pH。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2019年

3?結(jié)語

免疫熒光染色技術(shù)是生命科學(xué)研究中極其重要的工具之一，自Coons等首次使用熒光素標(biāo)記的免疫組織化學(xué)法以來，目前已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。隨著各種熒光標(biāo)記物的快速發(fā)展和超分辨激光共聚焦顯微鏡的普及，其已不再受到光的衍射原理的限制，突破了分辨率最高不超過220?nm的限制，將分辨率提高到了1個(gè)納米，為生命科學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)工具。免疫熒光染色的好壞直接關(guān)系到免疫熒光染色結(jié)果的分辨率高低和準(zhǔn)確性等。該研究詳細(xì)分析了免疫熒光染色過程中抗體選擇、染料選擇等試驗(yàn)前期準(zhǔn)備過程以及封閉、透膜、染色等染色過程中各個(gè)主要因素的影響，有利于提高免疫熒光染色的質(zhì)量，為生命科學(xué)研究提供有力幫助。

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