鸚鵡熱衣原體熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測方法的建立

（中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

鸚鵡熱是由鸚鵡熱衣原體（Chlamydia psittaci）感染所引起的一種人獸共患病。鸚鵡熱衣原體是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性菌，其發(fā)育形態(tài)有兩種：一種是能二分裂增殖的網(wǎng)狀小體，另一種是有感染能力的原生小體[1]。目前已知鸚鵡熱衣原體有9 個(gè)血清型，分別為A、B、C、D、E、F、E/B、WC 和M56 型[2]。它是一種多宿主性病原微生物，能通過呼吸道或直接接觸傳播，可感染多種鳥類和人類。目前鸚鵡熱廣泛分布于世界各地，中國、美國、巴西、日本和比利時(shí)等國家都有鳥類感染鸚鵡熱衣原體的報(bào)道[3-8]。

近年來鸚鵡熱衣原體作為鳥類衣原體病和人類衣原體病的病原越來越受到重視，研究熱點(diǎn)多集中在如何防止家禽感染以及感染后的治療措施方面。對(duì)于該病的診斷大多集中在細(xì)胞培養(yǎng)、PCR或基因芯片等[9]，而受病原分離培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)室條件等的限制，很多方法在實(shí)際應(yīng)用中不能較好發(fā)揮作用。本研究基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的原理，針對(duì)鸚鵡熱衣原體23SRNA 基因序列設(shè)計(jì)通用引物，建立一種恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增鸚鵡熱衣原體的方法。該方法可用恒溫?zé)晒鈨x直接檢測熒光信號(hào)強(qiáng)度，從而減少了肉眼判讀結(jié)果的誤差，既增強(qiáng)了準(zhǔn)確性，也避免了開蓋污染產(chǎn)生假陽性。本方法的建立為鸚鵡熱衣原體病的快速診斷、實(shí)驗(yàn)室鑒定和疫情監(jiān)測提供了技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和核酸DNA 根據(jù)NCBI 中的鸚鵡熱衣原體23SRNA 基因序列，運(yùn)用DNAstar 軟件進(jìn)行同源性分析和BLAST 序列分析，篩選出23SRNA 基因高度保守序列，以篩選獲得的高度保守序列作為檢測目的基因片段，合成陽性質(zhì)粒，質(zhì)粒大小為2 781 bp，質(zhì)量濃度為32.55 ng/μL。流產(chǎn)衣原體、動(dòng)物布魯氏菌、牛結(jié)核分枝桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和臨床DNA 樣品等的核酸DNA，由本實(shí)驗(yàn)室提取并保存。

1.1.2 主要儀器和試劑 引物和質(zhì)粒，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成；DNA 提取試劑盒，購自O(shè)MEGA 公司；恒溫?zé)晒鈾z測儀Dhelix1610和DNA 恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒，購自廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和反應(yīng)條件 使用Primer Explorer V4（http://primerexplorer.jp/e/）軟件設(shè)計(jì)6 組引物組合：組合1，包括CH-1OF、CH-1OB、CH-1FIP、CH-1BIP、CH-1LF、CH-1LB；組合2，包括CH-1OF、CH-1OB、CH-2FIP、CH-1BIP、CH-1LF、CH-1LB；組合3，包括CH-1OF、CH-3OB、CH-1FIP、CH-1BIP、CH-1LF、CH-1LB；組 合4，包 括CH-1OF、CH-1OB、CH-4FIP、CH-1BIP、CH-1LF、CH-1LB；組合5，包括CH-1OF、CH-1OB、CH-1FIP、CH-5BIP、CH-1LF、CH-1LB；組合6，包括CH-6OF、CH-6OB、CH-6FIP、CH-6BIP、CH-6LF、CH-6LB（表1）。將引物進(jìn)一步通過NCBI 的BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列比對(duì)分析，比較設(shè)計(jì)的引物序列與主要病原菌（流產(chǎn)衣原體、動(dòng)物布魯氏菌、牛結(jié)核分枝桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）的序列匹配度，確定引物的特異性。

1.2.2 引物篩選 通過試驗(yàn)篩選最優(yōu)反應(yīng)條件，反應(yīng)總體系約為25 μL，其中反應(yīng)緩沖液12.5 μL、引物1 μL、聚合酶1 μL、熒光染料0.5 μL、RNase Free dH2O 8.0 μL、DNA 模板2 μL。反應(yīng)體系配好后加入甘油0.25 μL，然后63 ℃下恒溫?cái)U(kuò)增1 h。以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板陽性對(duì)照，雙蒸水作為陰性對(duì)照進(jìn)行引物篩選；陰陽對(duì)照各做2 個(gè)重復(fù)，選取反應(yīng)條件最優(yōu)的作為最優(yōu)引物。

1.2.3 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用1.2.2 中篩選出的最優(yōu)引物，以流產(chǎn)衣原體、動(dòng)物布魯氏菌、牛結(jié)核分枝桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等病原菌核酸作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，評(píng)價(jià)該方法的特異性。

1.2.4 敏感性試驗(yàn) 以標(biāo)準(zhǔn)核酸為母液，將其稀釋為1×106拷貝/μL后，再連續(xù)進(jìn)行10倍倍比稀釋，依次取100～106拷貝/μL 為模板，應(yīng)用1.2.2 中篩選出的最優(yōu)引物進(jìn)行擴(kuò)增，評(píng)價(jià)該方法的敏感性。

表1 鸚鵡熱衣原體恒溫?zé)晒饪焖贆z測引物

1.2.5 臨床樣品檢測 對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的34 份從雞咽喉和泄殖腔拭子中提取的DNA 樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 引物篩選

本研究設(shè)計(jì)了6 組引物探針組合，先經(jīng)BLAST 比對(duì)分析，并與常見病原菌（流產(chǎn)衣原體、動(dòng)物布魯氏菌、牛結(jié)核分枝桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示特異性良好。通過試驗(yàn)篩選最優(yōu)引物，結(jié)果顯示6 組引物中，組合1 起峰時(shí)間早、熒光強(qiáng)度值高、重復(fù)性和特異性最好，故組合1 最優(yōu)（圖1）。

2.2 特異性試驗(yàn)

提取流產(chǎn)衣原體、動(dòng)物布魯氏菌、牛結(jié)核分枝桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等的核酸作為模板，以標(biāo)準(zhǔn)核酸為陽性對(duì)照，對(duì)引物組合1 進(jìn)行特異性試驗(yàn)。結(jié)果（圖2）顯示，引物組合1 特異性較好。

2.3 靈敏度試驗(yàn)

取原濃度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，依次取100～106拷貝/μL 為模板，對(duì)稀釋后的各濃度梯度進(jìn)行檢測，每個(gè)梯度做2 次重復(fù)，結(jié)果顯示該方法的靈敏度為100 拷貝/μL（圖3）。

2.4 臨床樣品檢測

用建立的方法（LAMP）與QPCR 方法同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的臨床DNA樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果（圖4）顯示，34 份臨床樣品中，LAMP 和QPCR 均檢測到1 份陽性，其余為陰性，符合率為100%。

3 討論

在我國，鸚鵡熱衣原體被列為三類動(dòng)物病原微生物，其宿主廣泛，感染性強(qiáng)，可通過呼吸道或直接接觸傳播。目前實(shí)驗(yàn)室診斷常用的方法中，雞胚培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全條件要求較高，且不易分離到病原；補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和間接血凝試驗(yàn)操作步驟比較繁瑣，容易出現(xiàn)結(jié)果偏差；熒光定量PCR 和基因芯片等試驗(yàn)則需要昂貴的儀器，成本較高。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增技術(shù)、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)和膠體金等檢測方法越來越成熟，已有很多被應(yīng)用到人獸共患病的診斷中。加強(qiáng)鸚鵡熱衣原體新型診斷技術(shù)的研發(fā)與應(yīng)用，必將為該病的快速、高效診斷和防控奠定基礎(chǔ)。

LAMP 檢測方法是由日本科學(xué)家開發(fā)的[11]，也被國內(nèi)很多學(xué)者應(yīng)用到各種疫病的檢測中[12-14]。但這些方法往往需要借助肉眼觀察顏色變化以及凝膠電泳實(shí)驗(yàn)或濁度儀等判讀結(jié)果，容易出現(xiàn)結(jié)果偏差，而且無法有效避免開蓋污染產(chǎn)生的假陽性。本研究建立的基于恒溫?zé)晒饧夹g(shù)的現(xiàn)場快速檢測診斷技術(shù)，適用于基層和現(xiàn)場快速篩查病原。該技術(shù)能在63 ℃恒溫條件下1 h 內(nèi)即可顯示結(jié)果，操作簡單、快速，特異性強(qiáng)，靈敏度可達(dá)100 拷貝/μL。此外，該技術(shù)用國產(chǎn)儀器通過直接檢測熒光信號(hào)判讀結(jié)果，既增強(qiáng)了準(zhǔn)確性，也避免了開蓋污染產(chǎn)生假陽性。該方法的建立彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測技術(shù)的不足，也為實(shí)現(xiàn)鸚鵡熱衣原體的現(xiàn)場快速診斷提供了技術(shù)支持。應(yīng)用建立的LAMP 方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的臨床DNA 樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與QPCR 檢測的結(jié)果相同，說明該方法可用于臨床檢測。

圖1 衣原體6 組引物篩選結(jié)果

圖2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

圖3 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

圖4 部分臨床樣品檢測結(jié)果