輻射合成的溫敏材料上兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)

王 偉,張鵬飛,陳春霞,錢 莉,陳建蘇

0 引言

角膜病是世界范圍內(nèi)的嚴(yán)重致盲眼病之一。角膜移植手術(shù)是角膜盲的主要治療手段。但是,由于供體來源的匱乏,制約了角膜移植術(shù)的廣泛開展[1]。應(yīng)用組織工程角膜為供體進(jìn)行分層和全層角膜移植將是解決供體缺乏的理想途徑[2-3]。但是,由于培養(yǎng)細(xì)胞和生物材料在體內(nèi)的存活、轉(zhuǎn)歸和降解、體內(nèi)炎性和排斥反應(yīng)等問題,迄今仍未獲得滿意的結(jié)果。如何解決以上問題,已成為國際上眼科和組織工程學(xué)領(lǐng)域的研究重點。因此,必須用新的研究手段突破這些難題。有研究發(fā)現(xiàn)具有溫度敏感特性的聚異丙基丙烯酰胺凝膠(PNIPAAm)的獨特特性,當(dāng)環(huán)境溫度稍稍高于PNIPAAm的最低臨界溶解溫度(low critical solution temperature, LCST)時,其體積會突然劇烈收縮,此時其表面是疏水的,由于細(xì)胞膜的親脂性,細(xì)胞可以黏附生長,此時接種細(xì)胞,可以進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及其增殖。當(dāng)細(xì)胞生長匯合成片后,降低溫度到LCST以下,使水凝膠表面親水,這樣細(xì)胞就脫離水凝膠,從而整個細(xì)胞片以及其下面的細(xì)胞外基質(zhì)都會自動脫落,而不必傳統(tǒng)的酶消化,所以很好地保持了細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)以及功能[4]。本實驗通過與佛山塑料股份有限公司合作,使用電子加速器輻射合成了PNIPAAm水凝膠及接枝了PNIPAAm水凝膠的溫敏培養(yǎng)皿。本課題對智能型溫敏材料進(jìn)行了系統(tǒng)研究,并用其作為載體培養(yǎng)細(xì)胞,觀察細(xì)胞在其表面的生物活性和生長條件,降低溫度獲得了不含任何載體的細(xì)胞片。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康清潔級新西蘭白兔4只,體質(zhì)量約2.0-2.5 kg,廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供,本研究已通過暨南大學(xué)動物倫理委員會審查。

1.1.2主要試劑N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm,上海物競科技有限公司);異丙醇(廣州化學(xué)試劑廠);亞丙基丙烯酰胺(N,N’-Methylene bisacrylamide, MBA)(上海物競科技有限公司);DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胎牛血清(fetal bovineserum,FBS)(杭州四季清);胰蛋白酶(美國Amresco公司);乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(美國Amresco公司);Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司);苯乙烯培養(yǎng)皿(tissue culture polystyrene, TCP)(Corning公司,美國)。

1.2方法

1.2.1輻射交聯(lián)合成PNIPAAm水凝膠的溫敏培養(yǎng)皿配制55%的NIPAAm和0.5% MBA的異丙醇溶液,取70 μL單體溶液于35 mm的TCP培養(yǎng)皿中,電子加速器單次給予50 kgy輻射,輻射總量給予250 kgy輻照。

1.2.2PNIPAAm水凝膠的表征及測試傅立葉紅外分析合成的水凝膠官能團(tuán),從而確定是否合成PNIPAAm;掃描電鏡及原子力顯微鏡研究溫敏材料的表面結(jié)構(gòu)及形貌特征。

1.2.3接枝有溫敏材料的培養(yǎng)皿培養(yǎng)前處理

1.2.3.1去離子水的浸泡通過去離子水的長期浸泡(7 d),每天更換新鮮的去離子水,可以達(dá)到去除未發(fā)生聚合反應(yīng)的單體。

1.2.3.2干燥干燥采用60 ℃的烤箱干燥6 h左右,去除水凝膠內(nèi)部的水分,有利于消毒。

1.2.3.3封口消毒及后續(xù)的血清處理使用封口機(jī)封口,封口之前貼環(huán)氧乙烷消毒標(biāo)簽,然后使用環(huán)氧乙烷消毒柜消毒,當(dāng)環(huán)氧乙烷標(biāo)簽由藍(lán)色變?yōu)榧t色提示達(dá)到消毒效果(圖1)。經(jīng)過環(huán)氧乙烷消毒的培養(yǎng)皿有一定的毒性,不利于后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)。我們選用血清長時間處理(大概4-5 d),這樣可以減少環(huán)氧乙烷消毒以及殘留的單體對后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)的負(fù)面影響。

圖1 封口、環(huán)氧乙烷消毒待用的培養(yǎng)皿。

1.2.4角膜基質(zhì)細(xì)胞在溫敏培養(yǎng)皿上的培養(yǎng)

1.2.4.1眼球來源及處理方法健康新西蘭大白兔,耳緣靜脈空氣栓塞處死,取雙側(cè)眼球,放入含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的PBS液中浸泡20 min,再用含1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、640 mg/L慶大霉素的PBS液清洗3次。

1.2.4.2角膜基質(zhì)的原代培養(yǎng)參照丁勇等[5]的膠原酶消化法培養(yǎng)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞。無菌條件下,用15°角膜刀在角膜緣做淺層小切口,虹膜恢復(fù)器水平淺層分離板層角膜組織,棄去,自角膜緣內(nèi)側(cè)1 mm剪下全層組織片,D-Hanks液沖洗2遍,解剖顯微鏡下撕去角膜后彈力層及內(nèi)皮層,將獲得的基質(zhì)片剪成碎塊,碎塊應(yīng)盡量小,加入1.5%Ⅱ型膠原酶消化液,37 ℃振蕩消化45 min,待見僅有少許組織塊剩余時,加入基質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)液終止消化,離心2次,1 000 r/min,每次5 min,制成細(xì)胞懸液,將細(xì)胞懸液(1×105/mL)種植于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。48 h后換液,以后每2 d換液一次。

1.2.4.3角膜基質(zhì)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞生長融合達(dá)70%-80%時即可傳代。吸出培養(yǎng)液,用PBS漂洗細(xì)胞,去除細(xì)胞表面的血清成分及衰老死亡細(xì)胞碎片。吸出PBS液,加入適量0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液(消化液能覆蓋瓶底或板底即可)。37 ℃消化5 min,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,見胞質(zhì)回縮,細(xì)胞間隙增大,輕輕搖動有細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)瓶底脫落時,立即滴加含血清的培養(yǎng)基終止消化,反復(fù)吹打后收集細(xì)胞懸液,1 000 r/min,5 min,離心,棄上清,PBS沖洗后加入培養(yǎng)基,混勻計數(shù),按1∶2或1∶3接種新的培養(yǎng)瓶,37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),隔日換液,每天觀察細(xì)胞的生長情況。

1.2.4.4兔角膜基質(zhì)細(xì)胞在處理過的接枝有溫敏型水凝膠的培養(yǎng)皿上的培養(yǎng)取第二代長勢良好的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞。吸出培養(yǎng)液,用PBS漂洗細(xì)胞,去除細(xì)胞表面的血清成分及衰老死亡細(xì)胞碎片。吸出PBS液,加入適量0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA混合消化液(消化液能覆蓋瓶底或板底即可)。37 ℃消化5 min,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,見胞質(zhì)回縮,細(xì)胞間隙增大,輕輕搖動有細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)瓶底脫落時,立即滴加含血清的培養(yǎng)基終止消化,反復(fù)吹打后收集細(xì)胞懸液,1 000 r/min,5 min,棄上清,PBS沖洗后加入培養(yǎng)基,混勻計數(shù),按1∶2或1∶3接種到接枝有溫敏水凝膠的培養(yǎng)皿上,37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),隔日換液,每天觀察細(xì)胞的生長情況。

1.2.5降低溫度獲得無任何載體的細(xì)胞片待接種到溫敏培養(yǎng)皿上的角膜基質(zhì)細(xì)胞長成片后,將其放入20 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)10、30 min,觀察細(xì)胞與溫敏材料的分離情況,照相記錄獲得的無任何載體的細(xì)胞片。

1.2.6細(xì)胞觀察和鑒定倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況,包括細(xì)胞的形態(tài)、大小、生長狀態(tài)、生長速度及有無污染等。等細(xì)胞生長成片后,降低溫度時獲得無任何載體細(xì)胞片,并照相記錄細(xì)胞生長及細(xì)胞片的情況;HE染色觀察無任何載體細(xì)胞片的形態(tài)結(jié)構(gòu)。掃描電鏡下觀察獲得的無載體的角膜基質(zhì)細(xì)胞片結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1PNIPAAm水凝膠的表征及測試

2.1.1傅立葉紅外光譜測試加入少量交聯(lián)劑后的PNIPAAm水凝膠傅里葉紅外圖譜圖像與化學(xué)合成的PNIPAAm水凝膠的圖像一致,提示NIPAAm單體經(jīng)過電子加速器輻射聚合后產(chǎn)生的PNIPAAm水凝膠成分與化學(xué)交聯(lián)產(chǎn)生的PNIPAAm水凝膠主要成分相近。

2.1.2掃描電鏡觀察掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),接枝在培養(yǎng)皿底部的溫敏材料呈較多的微孔結(jié)構(gòu),并且各個區(qū)域孔的密度不同;整個水凝膠呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)狀(圖2)。

圖2 掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)接枝在培養(yǎng)皿底部的PNIPAAm溫敏材料呈疏松的多孔結(jié)構(gòu)。

2.1.3原子力顯微鏡觀察原子力顯微鏡觀察顯示溫敏培養(yǎng)皿的表面形貌有一定的粗糙面,而不是平滑的表面,這樣有利于后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)(圖3)。

圖3 原子力顯微鏡顯示溫敏培養(yǎng)皿的表面形貌有一定的粗糙面,而不是平滑的表面。

2.2角膜基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)特征及獲得的無載體細(xì)胞片的形態(tài)

2.2.1倒置顯微鏡觀察消化法接種培養(yǎng)原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞,細(xì)胞呈圓形,4 h后開始貼壁,細(xì)胞仍呈圓形。培養(yǎng)24 h后,細(xì)胞開始延伸變形,呈紡錘形或梭形,相對透明。此后細(xì)胞分裂增殖迅速,并向周圍延伸。形成漩渦狀或呈平行排列,培養(yǎng)5-6 d細(xì)胞達(dá)到融合狀態(tài)。

兔角膜基質(zhì)細(xì)胞接種于溫度敏感培養(yǎng)皿的第1 d,發(fā)現(xiàn)貼壁的細(xì)胞比正常的培養(yǎng)瓶(板)上的細(xì)胞要少的多,細(xì)胞呈稀疏的長梭形(圖4A)。隨著時間延長,貼壁生長的細(xì)胞越來越多,細(xì)胞密集生長,至第10 d細(xì)胞長成片。并且在培養(yǎng)皿接枝了溫敏材料的區(qū)域和沒有接枝溫敏材料的區(qū)域出現(xiàn)明顯的無細(xì)胞區(qū)(圖4B)。降低溫度培養(yǎng)10 min后,發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)皿的局部有細(xì)胞片脫離溫敏材料的表面,呈卷曲狀,隨時間的延長(30 min)發(fā)現(xiàn)脫離的細(xì)胞片越來越大,后續(xù)隨著時間繼續(xù)延長,整個細(xì)胞從溫敏培養(yǎng)皿脫離,但是最終并未形成一個完整的細(xì)胞片,而是形成相互獨立的幾個細(xì)胞片(圖5)。

圖4 兔角膜基質(zhì)細(xì)胞接種于溫度敏感培養(yǎng)皿,隨著時間延長,逐漸生長成片,并且在培養(yǎng)皿接枝了溫敏材料的區(qū)域和沒有接枝溫敏材料的區(qū)域出現(xiàn)明顯無細(xì)胞區(qū)域 A:第1 d;B:第10 d。

圖5 降低溫度培養(yǎng)不同時間,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)皿的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞成片脫離 A:培養(yǎng)10 min;B:培養(yǎng)30 min。

2.2.2HE染色HE染色顯示,可獲得單層細(xì)胞片,細(xì)胞片疊加可獲得復(fù)層細(xì)胞片。所有的細(xì)胞片基底部都未發(fā)現(xiàn)任何載體及其他材料黏附,細(xì)胞之間連接緊密(圖6)。

圖6 HE染色顯示獲得的無任何載體的細(xì)胞片 A:單層;B:多層。

2.2.3掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞向兩極拉長,呈樹枝狀,細(xì)胞間生出許多偽足互相呈網(wǎng)狀連接,細(xì)胞排列緊密成片(圖7)。

圖7 獲得的角膜基質(zhì)細(xì)胞片的細(xì)胞向兩極拉長,呈樹枝狀,細(xì)胞間生出許多偽足互相呈網(wǎng)狀連接。

3 討論

無載體細(xì)胞片的構(gòu)建是目前組織工程研究的熱點。用酶消化法可獲得組織工程細(xì)胞片,但是,其細(xì)胞表面的一些受體、表面蛋白、細(xì)胞之間的連接蛋白及離子通道等均遭到不同程度的破壞,基底細(xì)胞的極性消失[6]。而用溫敏材料構(gòu)造及分離獲得的細(xì)胞片保持了細(xì)胞表面的一些受體、表面蛋白、細(xì)胞之間的連接蛋白及離子通道等表面標(biāo)志,基底細(xì)胞的極性得到保持,從而能夠更好地保持細(xì)胞片的活性與發(fā)揮其功能[7-8]。本實驗通過輻射合成了能用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)的接枝了溫敏材料的培養(yǎng)皿。

輻射合成的溫敏培養(yǎng)皿的培養(yǎng)前處理中,首先需要去離子水的浸泡。去離子水的浸泡可以去除膠體中沒有聚合的單體和交聯(lián)劑,因為單體和交聯(lián)劑有一定的毒性,不利于后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)。離子水浸泡后,再使用60 ℃烤箱干燥水凝膠,烤箱不破壞其表面結(jié)構(gòu)。本實驗也使用過凍干處理,但是使用凍干處理后發(fā)現(xiàn),其容易破壞材料的表面結(jié)構(gòu)。干燥后,就封裝溫敏培養(yǎng)皿進(jìn)行消毒處理?？紤]溫敏培養(yǎng)皿的特點,我們選用環(huán)氧乙烷消毒。環(huán)氧乙烷具有廣譜高效的殺菌作用,但屬于有毒氣體,易吸附于溫敏培養(yǎng)皿上,從而明顯影響體外培養(yǎng)的細(xì)胞生長及形態(tài)[9]。環(huán)氧乙烷在從細(xì)菌到哺乳類細(xì)胞的有機(jī)體中是一種有效的誘變劑,其從多數(shù)材料和器械上的擴(kuò)散遵循一級動力學(xué),即隨著時間延長其濃度(殘留量)會逐漸降低[10]。因此,使用環(huán)氧乙烷消毒溫敏培養(yǎng)皿后,應(yīng)該在細(xì)胞培養(yǎng)前放置較長的一段時間,待其降解后充分浸泡沖洗后再使用。

對于后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)實驗我們選擇角膜基質(zhì)細(xì)胞。它屬于成纖維細(xì)胞類,體外生長活躍,生命力旺盛,這樣有利于我們研究溫敏培養(yǎng)皿支持細(xì)胞生長的條件以及細(xì)胞在其表面的生物學(xué)特性。經(jīng)過研究我們發(fā)現(xiàn):(1)接種前血清浸泡處理溫敏培養(yǎng)皿十分必要,血清浸泡處理的培養(yǎng)皿表面細(xì)胞容易貼壁生長,相反未進(jìn)行血清處理的培養(yǎng)皿表面貼壁生長的細(xì)胞很少。有研究發(fā)現(xiàn)bFGF接枝的溫敏培養(yǎng)皿[11]或者血漿纖維連接蛋白處理過的溫敏培養(yǎng)皿[12]更能促進(jìn)細(xì)胞的生長及成片。(2)培養(yǎng)皿表面的水凝膠只有處于疏水狀態(tài)時才支持細(xì)胞的生長,所以接種細(xì)胞前,必須將其放37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中數(shù)十分鐘,觀察其表面呈現(xiàn)疏水狀態(tài)時也即由透明無色變?yōu)榘咨谋砻鏁r再接種細(xì)胞,相反如果在其親水狀態(tài)也就透明無色時接種細(xì)胞,第2 d觀察發(fā)現(xiàn)貼壁生長的細(xì)胞很少或基本無細(xì)胞貼壁生長;(3)換液時,必須將培養(yǎng)基放培養(yǎng)箱中放置30 min左右,這樣避免由于培養(yǎng)基直接從4 ℃冰箱中拿出來然后加入溫敏水凝膠表面,造成細(xì)胞從培養(yǎng)皿表面脫離。

通過適當(dāng)?shù)奶幚硪约鞍凑找欢ǖ膶嶒灢襟E,使用第一部分合成的溫敏培養(yǎng)皿,能夠獲得沒有任何載體的細(xì)胞片。但是溫敏培養(yǎng)皿的實驗方案仍需要改進(jìn),才能使其能夠像普通的培養(yǎng)皿一樣支持細(xì)胞的生長。后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)當(dāng)中,我們發(fā)現(xiàn)部分培養(yǎng)皿不支持細(xì)胞的生長。還有部分培養(yǎng)皿不同的區(qū)域細(xì)胞的生長狀態(tài)不同,可能是與培養(yǎng)皿表面各區(qū)域接枝的PNIPAAm水凝膠厚度不一樣有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)皿PNIPAAm水凝膠的質(zhì)量濃度在0.8-2.2 μg/cm2之間支持細(xì)胞的貼壁生長以及降低溫度能夠分離獲得細(xì)胞片,質(zhì)量濃度為1.4 μg/cm2時(厚度大約為20 nm),最有利于控制各種細(xì)胞在水凝膠的表面貼壁和分離。相反超過3.0 μg/cm2時,細(xì)胞不能貼壁生長增殖,當(dāng)?shù)陀?.8 μg/cm2時,細(xì)胞能夠貼壁生長,但是降低溫度不能脫離水凝膠[13]。同時加入的培養(yǎng)液的深度也極大地影響細(xì)胞的黏附和增殖,培養(yǎng)液深度為1.3 mm時最利于細(xì)胞的增殖,同時及時地更換培養(yǎng)液(15 h)也有利于細(xì)胞增殖,這些做法都有利于細(xì)胞獲得更多的環(huán)境中的氧氣[12]。同時眾多研究也發(fā)現(xiàn)可以通過PNIPAAm水凝膠再接枝別的基團(tuán),從而更有利于細(xì)胞的增殖[14]、降低溫度時的脫離[15]、甚至細(xì)胞的誘導(dǎo)分化[16-17]。另外,實驗中發(fā)現(xiàn)環(huán)氧乙烷消毒影響后續(xù)的細(xì)胞生長,有必要探索一種新的更好的溫敏培養(yǎng)皿消毒方法。

本實驗局限于單純的無載體細(xì)胞片的構(gòu)建,但沒有足夠的生物力學(xué)強(qiáng)度,后續(xù)是否可以使用全飛秒激光小切口微透鏡摘除術(shù)(small incision lentic extraction,SMILE)來源的角膜基質(zhì)透鏡解決這個問題值得研究。紀(jì)佳月等[18]使用纖維蛋白粘合劑將SMILE來源的雙層角膜基質(zhì)透鏡黏貼后,行板層角膜移植獲得良好效果。如果將本實驗中獲得的受體無載體的角膜上皮細(xì)胞片甚至內(nèi)皮細(xì)胞片與SMILE獲得的角膜基質(zhì)透鏡共培養(yǎng)后,再進(jìn)行移植,是否效果更明顯,值得本團(tuán)隊繼續(xù)研究。