基于高通量測序的北柴胡根轉(zhuǎn)錄組SSR位點信息分析

王彬彬 高妍夏 郭欣慰 紀宏亮 王敬 王暉

摘 要 以北柴胡根為試材，采用高通量轉(zhuǎn)錄組測序方法，獲得uingene序列信息，研究分析SSR分布、基元特征，設(shè)計、驗證EST-SSR引物的有效性，為開發(fā)、豐富EST-SSR分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明：從北柴胡根轉(zhuǎn)錄組中共篩選到31 176個SSR位點，分布于21 732條unigenes，出現(xiàn)的頻率為20.08%，分布密度為3.20個/10 kb，主要重復(fù)基元類型以二核苷酸最為豐富，共21 056個，占SSR位點總數(shù)的67.54%；其次是單核苷酸和三核苷酸，分別占總SSR的19.05%和12.07%；四核苷酸～六核苷酸重復(fù)基元數(shù)量均較少。不同核苷酸基序類型共有131種基元，重復(fù)基元次數(shù)在5～11次的數(shù)量最多，占SSR總數(shù)的91.7%，且長度基本小于15 bp，其中AT/AT和AC/GT這兩種基元在二核苷酸中出現(xiàn)頻率最高。2 064條和1 004條含有SSR位點的unigenes分別注釋到GO和KEGG通路，獲得注釋的基因功能主要與基礎(chǔ)代謝相關(guān)。從 22 090對具有潛在多態(tài)性的EST-SSR引物中，隨機挑選20對引物對3個北柴胡種質(zhì)DNA進行PCR擴增，擴增成功率最高達85%。北柴胡根轉(zhuǎn)錄組SSR位點豐富、可用性較強，將促進柴胡的種質(zhì)資源評價及分子標(biāo)記輔助育種等? 工作。

關(guān)鍵詞 北柴胡；根；轉(zhuǎn)錄組；SSR；位點信息

北柴胡（Bupleurum chinense DC.）屬于傘形科柴胡屬多年生草本植物。目前全世界分布的柴胡屬植物有200余種，中國有42種、17變種、7變型，占全世界種類的1/5以上［1］。柴胡以根部入藥，有疏散退熱、疏肝解郁、升陽舉氣的功效，用于治療感冒發(fā)熱、寒熱往來、胸脅脹痛、月經(jīng)不調(diào)、子宮脫垂、脫肛等癥狀［2］。近幾年，由于無序性采挖及生態(tài)環(huán)境破壞，野生柴胡已不能滿足市場需求，栽培柴胡已成為最主要的市場供應(yīng)來源。由于栽培柴胡種質(zhì)混雜、異地調(diào)種、種植地域廣，造成其種源混亂、藥材質(zhì)量參差不齊［3-5］，迫切需要對柴胡不同種質(zhì)進行區(qū)分和鑒別，建立統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準，消除柴胡臨床用藥帶來的安全隱患。目前關(guān)于柴胡藥材化學(xué)成分［6-7］、藥理藥效［8-9］等方面的研究較多，柴胡種質(zhì)資源遺傳多樣性評價、分子標(biāo)記輔助育種的研究則較少。

簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）? 標(biāo)記是一類長度一般不超過200 bp、由? 1～6個核苷酸為重復(fù)單位組成的一類短串聯(lián)重復(fù)序列，因其具有多態(tài)性高、共顯性和重復(fù)性好以及屬間和屬內(nèi)種間保守性的特點，使其成為目前常用的分子標(biāo)記之一［10］。目前，SSR標(biāo)記已應(yīng)用在多種藥用植物如黃地老虎 ［11］、多花黃精［12］、半夏［13］、黃連［14］、杜仲［15］等的遺傳多樣性研究。雖然在柴胡屬植物中已開發(fā)出一些SSR標(biāo)記［16-20］，但目前可利用的SSR標(biāo)記仍較少，不能滿足當(dāng)前在柴胡屬植物間進行親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析等方面的需要。

本研究以北柴胡根為材料進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，基于測序數(shù)據(jù)，挖掘SSR位點并分析其分布及組成特征，同時將含有SSR位點的基因在GO、KEGG數(shù)據(jù)庫進行功能注釋，為柴胡遺傳多樣性分析、優(yōu)良種質(zhì)篩選以及品種選育等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗設(shè)計

試驗于2021年8月至12月進行，供試材料為北柴胡品種‘ZC2，將種子用清水反復(fù)淘洗，除去雜質(zhì)及未成熟種子，蒸餾水浸泡12 h后撈出備用。將營養(yǎng)土撒在32孔穴盤中，壓實澆透水，每孔放入10粒種子，覆土約1 mm，蓋上透明蓋，置于人工氣候箱（溫度：25 ℃，光照度為5 000 lx，晝16 h/夜8? h），每3 d噴水1次，種子出苗后，每孔只留1株幼苗，待其進入5葉期時，進行低溫? （4 ℃）處理，在處理0 d、1 d、3 d后分別收集根部，每5株隨機混合為一個生物學(xué)重復(fù)，每個時間點收集3個生物學(xué)重復(fù)，蒸餾水清洗根部后用錫箔紙包裹，迅速投入液氮速凍并保存于-80 ℃，備用。

從北柴胡‘ZC2植株采集健康、無病蟲害葉片1～2片；從中國醫(yī)學(xué)院科學(xué)院藥用植物研究所試驗地采集陜西種質(zhì)（簡稱S′X，下同）、山西種質(zhì)（簡稱SX，下同）北柴胡植株的健康、無病蟲害葉片1～2片，上述材料均保存于-20 ℃。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序

將‘ZC2根部樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司，使用Illumina NovaSeq 6000測序儀（illumina，USA）進行轉(zhuǎn)錄組測序等工作。

1.3 SSR位點篩選

將組裝得到的unigene作為參考序列，使用MISA（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa）軟件搜索SSR位點，軟件參數(shù)設(shè)置：單、二、三、四、五、六核苷酸SSR最少重復(fù)次數(shù)依次為10、6、5、5、5、5；獲得SSR類型、出現(xiàn)頻率、分布平均距離等信息。

1.4 含SSR位點的unigene 功能分析

將unigene進行功能注釋和富集分類分析；注釋數(shù)據(jù)庫選擇KEGG （https：//www.genome.jp/kegg）和GO （http：//geneontology.org），對比參數(shù)為 e＜1×10-10。

1.5 SSR引物設(shè)計與PCR擴增

使用Primer 3.0軟件設(shè)計引物，隨機挑選20對，由北京文達通科科技有限公司合成。使用通用基因組DNA提取試劑盒（Solarbio，D2100）提取3種北柴胡種質(zhì)（ZC2、S′X、SX）葉片DNA。PCR擴增體系：1 μL 50 ng·μL-1 DNA模板，10 μL 2×Taq Master Mix，10 μmol·L-1正反向引物各1 μL，ddH2O補足至20 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 延伸30 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸? 5 min。PCR擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、分析并制表，使用Origin 2022b軟件的對應(yīng)作圖模塊繪制三維柱狀圖、二維餅狀圖、雙Y軸圖等。

2 結(jié)果與分析

2.1 北柴胡根轉(zhuǎn)錄組SSR位點數(shù)量和分布

北柴胡根部轉(zhuǎn)錄組測序組裝得到108 247條unigenes，序列總長為97 514 625? bp。共檢測到31 176個SSR位點，分布于21 732條unigenes，平均每3 128 bp出現(xiàn)1個SSR，分布密度為3.20個/10 kb，SSR位點出現(xiàn)的頻率為20.08%，其中有6 500條unigenes含有1個以上的SSR位點，含復(fù)合型 SSR 序列數(shù)為3 804個（表1）。SSR位點的分布特征表明，根轉(zhuǎn)錄組SSR位點較為豐富，其主要重復(fù)基元類型以二核苷酸為主，占SSR位點總數(shù)的67.54%，出現(xiàn)頻率為19.45%；其次是單核苷酸和三核苷酸，分別占總SSR數(shù)的19.05%和12.07%，出現(xiàn)頻率依次為5.49%和3.48%；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)基元類型數(shù)量較少，分別占總SSR數(shù)的0.89%、? 0.14%和 0.31%。不同類型SSR的平均距離則與出現(xiàn)頻率相反，二核苷酸類型平均距離最小，相距4.63 kb；五核苷酸類型平均距離最大，相距? 2 267.78 kb（表2）。

2.2 北柴胡根轉(zhuǎn)錄組SSR基序重復(fù)類型和頻率特征

北柴胡根轉(zhuǎn)錄組不同類型SSR重復(fù)次數(shù)出現(xiàn)的頻率差異較大，隨著各基元重復(fù)次數(shù)的增加SSR 位點數(shù)量逐漸降低（表3；圖1）。SSR位點重復(fù)基元次數(shù)在5～11次的數(shù)量最多，占SSR總數(shù)的91.7%，其中，重復(fù)次數(shù)6次的SSR位點數(shù)（6 171個）最多，占總數(shù)的19.79%；其次是重復(fù)次數(shù)為10次（5 314個），占SSR總數(shù)的17.05%。單核苷酸重復(fù)次數(shù)均大于10次，所占比例為? 19.05%，其中重復(fù)次數(shù)10～14次的頻率較高；二核苷酸重復(fù)次數(shù)的變化范圍均大于6次，所占比例為67.54%，其中重復(fù)次數(shù)6～12次的頻率較高；三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)次數(shù)的變化范圍均大于4次，占SSR總數(shù)的比例分別為12.07%、0.89%、0.14%和0.31%，其中三核苷酸重復(fù)次數(shù)5～10次的頻率最高，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)次數(shù)較少，重復(fù)次數(shù)5～7次的頻率均最高。

2.3 北柴胡根轉(zhuǎn)錄組SSR位點基序類型分析

北柴胡根轉(zhuǎn)錄組SSR位點中共有131種基元，每種核苷酸含有多種基序類型（表4，圖2）。單核苷酸基序類型以A/T為主，有5 799個，占SSR總數(shù)的18.60%，基序C/G出現(xiàn)頻率很低；二核苷酸基序類型有4種，以AT/AT為主，有? 12 517個，占SSR總數(shù)的40.15%，占二核苷酸基序類型的59.40%，其次為AC/GT（6 339個）、AG/CT（2 141個）和CG/CG（59個），分別占SSR總數(shù)的20.33%、6.87%和0.19%。三核苷酸基序類型有10種，以ATC/ATG（686個）為主，占SSR總數(shù)的2.20%。四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸基序的重復(fù)類型比較多，依次有26、30和59種，但其重復(fù)基元的個數(shù)在總數(shù)中所占比例較小，以ACAT/ATGT、AAAAT/ATTTT、ACTGGC/AGTGCC為主，分別占SSR總數(shù)的0.36%、0.01%和0.02%。

2.4 北柴胡根轉(zhuǎn)錄組SSR的可用性評價

研究表明，SSR位點的基序長度≥20 bp 時，其多態(tài)性較高；長度為12～19 bp時，SSR多態(tài)性明顯下降；長度<12 bp時，其多態(tài)性極低［20］。北柴胡根轉(zhuǎn)錄組SSR基序長度分布范圍在10～360 bp，其中，基序長度在10～11 bp的低多態(tài)性SSR位點有3 223個，占11.77%；長度在12～19 bp之間的中度多態(tài)性SSR位點有14 632個，占? 53.45%；長度≥20 bp的高度多態(tài)性SSR位點有? 9 518個，占34.77%，說明可以從該轉(zhuǎn)錄組中開發(fā)出具有高度多態(tài)性的SSR引物；當(dāng)基序長度≥12 bp時，SSR分布頻率隨著基序長度的增加呈現(xiàn)下降趨勢（圖3）。

2.5 北柴胡根轉(zhuǎn)錄組含有SSR位點的unigene的功能注釋

將含有SSR位點的21 732條序列在GO、KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對和功能預(yù)測，分別有2 064和1 004條unigenes注釋到GO、KEGG數(shù)據(jù)庫。

GO功能注釋結(jié)果表明，含SSR的unigenes被注釋到44個功能組，分布于分子功能、細胞組分和生化過程3個類別（圖4）。在分子功能類別中，789條unigenes得到注釋，注釋結(jié)果主要包括序列特異性DNA結(jié)合，泛素-蛋白轉(zhuǎn)移酶活性，蛋白質(zhì)二聚化活性。在細胞成分類別中，558條unigenes得到注釋，注釋結(jié)果主要包括核仁和后期促成熟復(fù)合物。在生化過程類別中，717條unigenes得到注釋，注釋結(jié)果主要包括蛋白質(zhì)泛素化和DNA復(fù)制啟動。

KEGG代謝通路分析中，含SSR的unigenes被注釋到17個代謝通路，其中168條unigenes注釋到了植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，此通路注釋到的基因最多，占16.73%；其次是mRNA監(jiān)控通路、植物MAPK信號通路和NOD樣受體信號通路，分別有103條（10.26%）、97條（9.66%）和93條（9.26%）。

2.6 EST-SSR引物的設(shè)計及驗證

22 090條unigenes設(shè)計得到66 270對EST-SSR特異性引物，從中隨機篩選出20對不同SSR重復(fù)類型的引物用于引物的通用性和多態(tài)性評價（表5）。隨機挑選的20對引物在S′X、ZC2和SX中依次有14、15和17對擴增成功，擴增成功率分別為70%、75%和85%，其中13對引物在3個樣品中均擴增成功，3對引物均沒有擴增成功，其余4對引物呈現(xiàn)一定的多態(tài)性（圖6），初步表明上述SSR引物可靠性較好，且在3種北柴胡種質(zhì)之間通用。

3 結(jié)論與討論

通過北柴胡根部轉(zhuǎn)錄組測序獲得108 247條unigenes，MISA軟件共檢測到31 176個SSR位點，分布于21 732條unigenes上，平均每3.13 kb出現(xiàn)1個SSR，即平均分布距離為3.13 kb，SSR位點出現(xiàn)的頻率為20.08%，表明北柴胡轉(zhuǎn)錄組中SSR數(shù)量較為豐富。柴胡種間相比，SSR的出現(xiàn)頻率會有所差異，柴胡種子轉(zhuǎn)錄組測序獲得的244 194條unigenes中共鑒定出29 898個SSR位點，SSR的出現(xiàn)頻率為12.24%，平均分布距離為6.46 kb［19］，這種差異可能與取材器官部位、建庫軟件等因素不同有關(guān)。與其他藥用植物相比，北柴胡轉(zhuǎn)錄組SSR出現(xiàn)頻率高于黃精? （9.73%）［12］、野三七（6.99%）［21］、金釵石斛? （12.90%）［22］，低于蒙古黃芪（31.26%）［23］、黃秦艽（30.73%）［24］、萬壽菊（28.29）［25］等。SSR 出現(xiàn)的平均距離低于杜仲（1.75 kb）［15］、苦蕎（3.04 kb）［26］、萬壽菊（2.51 kb）［25］，高于膜莢黃芪（7.97 kb）［27］、太子參（14.7 kb）［28］、云黃連（9.48 kb）［14］。由此可見，不同物種轉(zhuǎn)錄組SSR位點存在明顯差異，這可能與物種自身有關(guān)，還可能與轉(zhuǎn)錄組中unigene數(shù)量和長度、SSR篩選條件等有關(guān)［29］。

SSR重復(fù)基元類型是轉(zhuǎn)錄組的重要特征之一。研究表明，多數(shù)植物SSR位點的重復(fù)類型主要以二核苷酸和三核苷酸為主，但不同物種中重復(fù)基元類型及所占的比例會有所差異［10］。本研究中，北柴胡根部轉(zhuǎn)錄組SSR以二核苷酸重復(fù)為主，占SSR總數(shù)的67.54%，其次是單核苷酸? （19.05%）和三核苷酸（12.07%）類型，其中二核苷酸重復(fù)基元以AT/AT（12 517個）為主，占SSR總數(shù)的40.15%；三核苷酸以ATC/ATG（686個）為主，占SSR總數(shù)的2.20%，這與三島柴胡全基因組、北柴胡種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得到的結(jié)果相一致［17，19］，即SSR位點均以二核苷酸重復(fù)為主。在不同物種中，多花黃精（53.14%）［12］、野三七? （52.52%）［21］以二核苷酸重復(fù)為主，與本研究結(jié)果相一致；而人參果（58.78%）［30］、蒙古黃芪（31.26%）［23］以單核苷酸為主；裸花紫珠［31］以單核苷酸和二核苷酸為主；蘇丹草［32］、黃地老虎［11］以單核苷酸和三核苷酸為主，藍玉簪龍膽（54.7%）［33］、亞麻（60.1%）［34］以三核苷酸為主；半夏［13］、蒙藥冷蒿［35］以二核苷酸和三核苷酸為主，上述研究結(jié)果表明，SSR位點的重復(fù)基元類型在不同物種間的分布有較大差異。此外，北柴胡轉(zhuǎn)錄組SSR位點中，長度在20 bp 以上的有9518個，占 SSR總數(shù)的34.77%，這部分多態(tài)性能比較高的 SSR 可能具有較高的應(yīng)用價值。本研究隨機挑選的20對引物，在3種北柴胡種質(zhì)中擴增成功率為70% ～85%，有13對引物在3個樣品中擴增產(chǎn)物長度與預(yù)期相符，4對引物呈現(xiàn)一定的多態(tài)性，說明開發(fā)的北柴胡基因組SSR引物具有較強的可用性。

本研究從北柴胡根轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘到大量的SSR位點，并對其基元特征、分布、出現(xiàn)頻率等進行分析，并進行了初步的可用性驗證；不僅豐富了柴胡種質(zhì)鑒定的SSR位點，同時可以為柴胡遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記開發(fā)及分子輔助育種提供一定理論參考。

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SSR Loci Analysis Using High-throughput Transcriptome Sequencing in Roots of? Bupleurum chinense

Abstract This study aimed to investigate the distribution and motif characteristic of SSR loci of unigenes in Bupleurum chinense DC by using high-throughput RNA-seq technology.Furthermore，EST-SSR primers were designed and the validity of these primers was evaluated to provide a foundation for enriching and developing? valuable molecular markers.The results indicated that a total of 31 176 SSR loci were? identified from 21 732? unigenes，with an SSR? occurrence frequency of 20.08% and an SSR density of 3.20 SSRs per 10 kb.As the predominant repeat type，di-nucleotide repeats accounted for?? 67.54% （21 056） of the? SSR loci，followed by the mono-nucleotide? and tri-nucleotide types，accounting for 19.05% and 12.07%，respectively.Tetra-nucleotide，penta-nucleotide and hexa-nucleotide repeat types had a lower proportion.One hundred and thirty-one repeat motifs were detected in? the transcriptome data.Most of the SSR repeat number （91.7%）ranged from 5 to 11，and the length was less than 15 bp.Among the di-nucleotide motif types，the AT/AT and AC/GT motifs were the most abundant-type.Moreover，2 064 and 1 004 SSR-containing unigenes were functionally annotated by using Gene Ontology and KEGG pathways，respectively.Furthermore，those unigenes were involved inbasal metabolism.Furthermore，20 pairs of primers were designed and evaluated for PCR amplification ofthree B.chinense DC.Germplasms，with an amplification success rate of 85%.Overall，these results suggest that SSR loci are abundant and versatile in B.chinense DC，and can be utilized to accelerate the process of germplasm evaluation and molecular marker-assisted breeding.

Key words Bupleurum chinense; Root; Transcriptome; SSR; Loci information