藜麥CqAMSlike基因的克隆與功能分析

張玉敏 林春 劉正杰 林彤 董玉梅 毛自朝

摘 要 為探究藜麥（Chenopodium quinoa，Willd.）花粉發(fā)育的分子機(jī)制，基于基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，經(jīng)同源比對(duì)及RT-qPCR表達(dá)分析等，預(yù)測(cè)藜麥中AMS候選基因并克隆其編碼序列，隨后經(jīng)病毒介導(dǎo)的基因沉默（VIGS）及雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）法進(jìn)行候選基因的功能驗(yàn)證。結(jié)果顯示，藜麥中有 ?CqAMSlike1和 ?CqAMSlike2 兩個(gè)基因，其中 ?CqAMSlike1的CDS長(zhǎng)1 929 bp，而 ?CqAMSlike2的CDS長(zhǎng)1 920 bp，兩基因均在不同發(fā)育時(shí)期的圓錐花序中表達(dá)。與 ?CqAMSlike2相比， ?CqAMSlike1的表達(dá)更與AMS的表達(dá)模式相一致，而被進(jìn)一步用于基因的功能驗(yàn)證。與對(duì)照相比，基于煙草脆裂病毒（TRV）沉默 ?CqAMSlike1的藜麥兩性花出現(xiàn)部分花絲縮短、花藥不裂，花粉敗育，單株種子少，種子空癟率增加的表型。BIFC結(jié)果顯示CqAMSlike1自身，與 CqTDF1和CqMYB80均有互作，預(yù)示CqAMSlike1可形成同源或異源聚體調(diào)控藜麥絨氈層發(fā)育基因的表達(dá)。

關(guān)鍵詞 藜麥；AMS；病毒介導(dǎo)的基因沉默；花粉發(fā)育；蛋白互作

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.，2n=? 4x=36）是莧科藜屬1 a生雙子葉植物，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]，并對(duì)多種非生物逆境脅迫具有較強(qiáng)的抗性，近年來備受關(guān)注[2-5]。然而藜麥花器官結(jié)構(gòu)復(fù)雜、尺寸小，同一植株的花由大小不同的雌花和兩性花組成，比例受到遺傳和環(huán)境的影響，導(dǎo)致人工去雄難，雜交育種困難[6]。目前在自然界中很難找到藜麥的自然突變的雄性不育材料，因而研究其花粉發(fā)育相關(guān)基因是創(chuàng)制人工雄性不育材料的基礎(chǔ)。

花粉的敗育與絨氈層的發(fā)育密切相關(guān)，絨氈層的缺陷會(huì)直接影響植物花粉的育性[7]。目前，花藥發(fā)育的分子機(jī)制已在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）等模式植物中開展了大量的研究[8]。在擬南芥中AMS（aborted microspores）基因一個(gè)編碼特殊bHLH家族的MYC2型的轉(zhuǎn)錄因子[9]，其表達(dá)異常會(huì)造成絨氈層異?？张莼⑿℃咦油嘶痆10]。AMS的表達(dá)受上游基因TDF1（defective in tapetal development and function 1）的調(diào)控[11-12]。TDF1基因編碼一個(gè)R2R3 YMB轉(zhuǎn)錄因子[13]，TDF1通過結(jié)合AACCT順式元件調(diào)控AMS的表達(dá)，并與AMS發(fā)生互作形成復(fù)合物調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)[14]；而AMS則可通過結(jié)合Ebox調(diào)節(jié)下游MYB80基因[15]。MYB80與TDF1均編碼一個(gè)R2R3 YMB轉(zhuǎn)錄因子[16]，YMB80也可以與AMS形成復(fù)合物而最終促進(jìn)孢子發(fā)育[17]。在擬南芥中已闡明絨氈層發(fā)育后期的轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑[DYT1-TDF1（MYB35）-AMS-MS188（MYB80）-MS1][18]。

2017公布了高質(zhì)量參藜麥考基因組[19]，為其基因發(fā)掘和利用創(chuàng)造了良好的基礎(chǔ)，但由于藜麥中較難建立遺傳轉(zhuǎn)化體系，基因功能驗(yàn)證工作難以推進(jìn)。目前病毒誘導(dǎo)基因沉默（Virusinduced gene silencing VIGS） 的方法已在茄科[20]和禾本科[21]的基因功能研究中得到廣泛應(yīng)用，但在藜麥的研究中應(yīng)用甚少。本研究為挖掘藜麥中AMS基因及其表達(dá)作用來闡明CqAMSlike基因在藜麥花藥發(fā)育過程中的作用，為藜麥雄性不育種質(zhì)創(chuàng)制等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、質(zhì)粒、菌種

以白藜麥（BW25）為材料，種植于22 ℃，光照時(shí)間16 h/8 h（光照/黑暗）的溫室環(huán)境。大腸桿菌 DH5α及農(nóng)桿菌 GV3101宿主菌系均為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)特色小宗作物研究所保存；VIGS構(gòu)建所用到的載體pTRV1、pTRV2 由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院李凡老師惠贈(zèng)；蛋白質(zhì)互作的雙分子熒光表達(dá)載體pBRVC、pAgVN由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)特色小宗作物研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 藜麥RNA提取及cDNA第一鏈合成 參閱試劑盒說明書，利用京艾德萊生物科技有限公司的EASYspin Plus試劑盒提取RNA，然后用全式金公司的TransScript Onestep gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒完成cDNA第一鏈的合成。

1.2.2 CqAMSlike1/2、CqTDF1和CqMYB80like1/2的生物信息分析 從NCBI下載藜麥及其二倍體（Chenopodium pallidicaule、Chenopodium suecium）的全基因組、蛋白質(zhì)序列（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/datahub/assembly/GCF_001683475.1），以擬南芥bHLH和MYB家族為參照[22-23]構(gòu)建藜麥以及藜麥二倍體的bHLH和MYB的系統(tǒng)進(jìn)化樹。擬南芥bHLH和MYB家族的信息來自于Tair（https：//www.arabidopsis.org/），通過比對(duì)擬南芥AtAMS基因（AT2G16910.1）、 AtTDF1基因（AT3G28470.1）和AtMYB80基因（AT5G56110.1），預(yù)測(cè)藜麥AMS、TDF1和MYB80的同源基因。然后將藜麥以及二倍體藜麥同源基因與菠菜（Spinacia oleracea）、甜菜（Beta vulgaris）等物種已知確定功能的AMS、TDF1與MYB80用MEGA 10（https：//www.megasoftware.net/）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。用ExPASy Proteomics ServerProtparam（http：//www.expasy.ch/tools/ protparam.htm1） 預(yù)測(cè)候選蛋白的理化性質(zhì)，SignalP（http：// http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行蛋白質(zhì)的信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，CellPLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/CellPLoc2/）進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位部位預(yù)測(cè)。

1.2.3 CqAMSlike、CqTDF1like和CqMYB80like基因的克隆 用SnapGene（https：//www.snapgene.cn/）軟件設(shè)計(jì)預(yù)測(cè) ?CqAMSlike1/2、CqTDF1和CqMYB80like1/2的克隆引物（表1，用藜麥花序總RNA 反轉(zhuǎn)錄cDNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段與pUC57T Vector連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選后送測(cè)序公司進(jìn)行鑒定，分別將所獲質(zhì)粒命名為pC57CqAMSlike1、pUC57CqAMSlike2、pUC57CqTDF1、pUC57CqMYB80like1 和 pUC57 CqMYB80like2。

1.2.4 CqAMSlike的表達(dá)模式分析 提取藜麥（顯序期、開花初期、盛花期、開花末期）花序和不同藜麥器官部位（根、葉、花）的RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，以藜麥的actin基因作為內(nèi)參基因[24]進(jìn)行qRTPCR擴(kuò)增后，采用2-△△Ct的方法[24]分析 ?CqAMSlike1和 ?CqAMSlike2基因在藜麥不同發(fā)育期和不同器官部位的表達(dá)情況。

1.2.5 pTRV2CqPDS和pTRV2CqAMSlike1載體的構(gòu)建 以藜麥葉片RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴(kuò)增，上下游引物分別添加BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)（表2），擴(kuò)增長(zhǎng)度為461 bp的CqPDS；以質(zhì)粒pC57CqAMSlike1為模板擴(kuò)增長(zhǎng)度為498 bp的 ?CqAMSlike1的片段。將純化的CqPDS、 ?CqAMSlike1片段與pTRV2載體同時(shí)用BamHI和EcoRI雙酶切，連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，提取陽(yáng)性菌株質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證后獲得重組質(zhì)粒TRV2CqPDS和TRV2CqAMS。采用電穿孔法（2 500 V）分別將重組質(zhì)粒pTRV2CqPDS和TRV2CqAMS轉(zhuǎn)染到農(nóng)桿菌GV3101中進(jìn)行選擇培養(yǎng)，挑選單菌落進(jìn)行PCR，挑選陽(yáng)性菌株。

1.2.6 CqPDS和CqAMSlike1的VIGS沉默與表達(dá)量檢測(cè) 將目的片段載體（pTRV2CqPDS和pTRV2CqAMSlike1）、空載體pTRV2和農(nóng)桿菌接種至含50 mg·L-1卡納霉素（Kan）和 50?? mg·L-1 利福平霉素（Rif）的 YEB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩5 h，后用侵染液（1 mol·L-1 MgCl2、? 1 mol·L-1 MES貯存液、50 mmol·L-1AS貯存液、pH 5.6）進(jìn)行重新懸浮。將含有目的片段農(nóng)桿菌與含pTRV1的農(nóng)桿菌（pTRV1/GV3101）按照1∶1進(jìn)行混合，分別注射到藜麥葉片作為試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組；將沒有注射任何菌株的藜麥作為正常對(duì)照組。黑暗條件下放置48 h，轉(zhuǎn)至? 22 ℃，光照時(shí)間16 h/8 h（光照/黑暗）條件下培養(yǎng)。設(shè)計(jì)CqPDS和CqAMSlike1的TR-qPCR檢測(cè)引物（表1），用TR-qPCR檢測(cè)目的基因在不同處理中的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 花粉活力的鑒定 采用0.5% TTC（2，3，5三苯基氯化四氮唑）染色法測(cè)定藜麥花粉生活力。將同一時(shí)期正常、陽(yáng)性分別置于2 mL 的離心管中，滴加 TTC搖晃均勻后，置于37 ℃恒溫箱反應(yīng)15 min后制片，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)花粉活力，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，每次試驗(yàn)選取3 個(gè)視野。

花粉活力= 著紅色花粉數(shù) / 總花粉數(shù)×100%

1.2.8 BiFC載體構(gòu)建與互作檢測(cè) 分別設(shè)計(jì)引物下游引入不同酶切位的引物（表2）， 以質(zhì)粒pUC57 ?CqAMSlike1/2、pUC57 CqMS80like1/2和pUC57 CqTDF1為模板擴(kuò)增相應(yīng)目的全長(zhǎng)CDS片段。將擴(kuò)增的 ?CqAMSlike1/2片段分別用BamHI和SphI雙酶切，分別回收連入pAgVN載體，獲得表達(dá)CqAMSlike1、CqAMSlike2與venus蛋白N末端的融合蛋白；用SphI和EagI將需要連入的目的片段雙酶切，然后分別回收連入pBRVC載體，獲得CqAMSlike1、CqAMSlike2、CqMYB80like1和CqTDF1like與venus蛋白C末端融合表達(dá)載體?；瘜W(xué)合成的IAAL蛋白中互作的結(jié)構(gòu)域 E3和K3編碼序列，分別插入pBRVC和pAgVN載體，獲得融合表達(dá)載體pBRE3VC和pAgK3VN，用于BiFC陽(yáng)性對(duì)照[25]，以pAGVNvenus、pBRVCvenus的空白載體作為陰性對(duì)照。將構(gòu)建的BiFC載體按照濃度? 1∶1混合共同轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布于含有慶大霉素（Gen）? 50?? mg·L-1和卡那霉素（Kan）? 50 mg·L-1的LB固體培養(yǎng)基上37? ℃過夜篩選培養(yǎng)。用菌落PCR檢測(cè)單菌落，挑取陽(yáng)性共轉(zhuǎn)化菌株。共轉(zhuǎn)化菌株于37? ℃， 200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h后，? 換30? ℃，200?? r·min-1振蕩培養(yǎng)4～8 h。在載玻片上滴加少量甘油和菌液，混合后使用激光共焦聚顯微鏡（OLYMP FV 1000）觀察黃色熒光? 信號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CqAMS、CqTDF1和CqMYB80基因的篩選、克隆及其生物信息分析

以擬南芥的bHLH和MYB家族的蛋白質(zhì)序列為參照，篩選并構(gòu)建藜麥及藜麥二倍體的相應(yīng)基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹。藜麥的bHLH基因家族分為14個(gè)亞家族（圖1-Ⅰa），而MYB基因家族分為13個(gè)亞家族（圖1-Ⅰb）。其中與擬南芥AtAMS相近的基因有11個(gè)序列，包含6個(gè)藜麥基因（AUR62013022RA、AUR62013021RA、AUR62010033RA、AUR62010034RA、AUR620-05378RA、AUR62014049RA ）；與擬南芥AtTDF1相近藜麥基因有4個(gè)序列（AUR62-026937RA、AUR62030563RA、AUR62026949RA、AUR62018324RA）；與擬南芥AtMYB80基因相近的藜麥基因有2個(gè)（AUR62017171RA和AUR62035635RA）。用Hisat2[26]對(duì)藜麥（BW25）不同發(fā)育時(shí)期花序的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與基因組序列進(jìn)行比對(duì)，用IGV（Integrative Genomics Viewer）[27]可視化展示后發(fā)現(xiàn)， AUR62013022RA和AUR62013021RA、 AUR62010033RA和AUR62010034RA之間存在分離比對(duì)，確定AUR62013022RA、AUR62013021RA在一條CDS上（圖1-Ⅲa），命名為 ?CqAMSlike1，全長(zhǎng)CDS為1 929 bp；同理，AUR62010033RA和AUR62010034RA在另一條CDS上（圖1-Ⅲb），命名為 ?CqAMSlike2，長(zhǎng)度為1 920 bp。進(jìn)一步將矯正的基因（CqAMSlike1/2）與菠菜和甜菜的AMS、TDF1和MYB80基因進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明： ?CqAMSlike1和 ?CqAMSlike2與菠菜和甜菜的AMS基因有較高的同源性，并且兩條基因編碼的氨基酸序列具有93.77%的相似性，將其作為候選基因進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，其中 ?CqAMSlike1與 ?CP022004、 CqAMSlike2和Csue 04968RA具有較高同源性（圖1-Ⅱa）。CqMYB 80like 1（AUR62017171RA）、CqMYB 80like 2（AUR62035635RA）與菠菜和甜菜的MYB80基因也具有較高的同源性，并且兩條基因編碼的氨基酸序列具有98.73%的相似性（圖1-Ⅱb）；進(jìn)一步分析確定藜麥中僅有一條CqTDF1（AUR62008324RA）與甜菜和菠菜的TDF1具有相似的同源性（圖1-Ⅱb）。

藜麥 ?CqAMSlike1基因位于17號(hào)染色體，包含有8個(gè)外顯子 （圖1-Ⅳa），編碼642個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量73.432 ku，等電點(diǎn)5.60； ?CqAMSlike2基因位于15號(hào)染色體，也包含有8個(gè)外顯子，（圖1-Ⅳb），編碼639個(gè)氨基酸，其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量73.139? ku，等電點(diǎn)5.72。CqMYB80like1、CqMYBlike2基因的CDS全長(zhǎng)951 bp（圖1-Ⅳc、d），CqMYB80like1位于2號(hào)染色體，CqMYB80like2位于1號(hào)染色，都含有3個(gè)外顯子，編碼316個(gè)氨基酸，其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量35.160 ku，等電點(diǎn)6.76。CqTDF1基因位于16號(hào)染色體上，含有3個(gè)外顯子，CDS全長(zhǎng)1086bp（圖1Ⅳ5），編碼361個(gè)氨基酸，蛋白之分子質(zhì)量為40.000 ku，等電點(diǎn)5.94。預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，這些基因都含有核定位信號(hào)，用CellPLoc 2.0預(yù)測(cè)，都定位在細(xì)胞核內(nèi)。信號(hào)肽預(yù)測(cè)顯示，這些蛋白沒有信號(hào)肽，這些特征與他們作為轉(zhuǎn)錄因子的功能相一致。

2.2 ?CqAMSlike基因在藜麥植株不同生育時(shí)期及不同組織的表達(dá)特性

如圖2所示，藜麥植株從顯序期（花序剛出現(xiàn)）到末花期 ?CqAMSlike1/2基因的表達(dá)明顯不同。其中 ?CqAMSlike1隨著花發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，基因的表達(dá)呈先升高后降低的趨勢(shì)，在初花期階段達(dá)到最高，末花期最低（圖2-Ⅰ）； ?CqAMSlike2基因的表達(dá)未發(fā)生變化，總體表達(dá)低于 ?CqAMSlike1。不同組織的表達(dá)分析表明， ?CqAMSlike1基因在藜麥花序中表達(dá)較高，在葉片和根中的表達(dá)較低，與擬南芥AMS表達(dá)模式相似，從而推測(cè)， ?CqAMSlike1可能在藜麥花粉發(fā)育中起主要調(diào)控作用，而 ?CqAMSlike2 可能作為冗余或功能或表達(dá)模式改變的重復(fù)基因，為此 ?CqAMSlike1被優(yōu)選進(jìn)行后續(xù)的功能分析。

2.3 藜麥VIGS系統(tǒng)的構(gòu)建

含質(zhì)粒pTRV2PDS和TRV1的根癌農(nóng)桿菌侵染藜麥后，14 d的藜麥葉先從葉脈開始，隨后至葉片出現(xiàn)白化現(xiàn)象，第20天時(shí)有明顯葉片漂白現(xiàn)象（圖3-Ⅲa、圖3-Ⅲb），而空白對(duì)照（圖3-Ⅲc）和陰性對(duì)照（圖3-Ⅲd）葉片顏色表現(xiàn)正常。藜麥植株的外形，除葉片顏色外其他無明顯改變。處理25 d后，觀察50株藜麥葉片表型變化，共發(fā)現(xiàn)44株出現(xiàn)白化現(xiàn)象，其余6株葉片顏色無明顯變化，侵染效率達(dá)到88%（n=50）。進(jìn)一步觀測(cè)發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照未出現(xiàn)白化表型，僅接種空白TRV2載體的藜麥植株出現(xiàn)葉片輕微發(fā)黃現(xiàn)象，這可能與TRV接種后產(chǎn)生病癥相一致，且隨時(shí)間延長(zhǎng)該病癥逐漸減輕直至消失。

RT-qPCR檢測(cè)接種25 d的藜麥葉片基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，CqPDS表達(dá)量在接種pTRV2CqPDS藜麥中明顯下降，而在接種TVR2空載體藜麥中未檢測(cè)到變化（圖3-Ⅱ），預(yù)示在藜麥中成功構(gòu)建基于TRV的VIGS體系。

2.4 CqAMSlike1 的VIGS沉默

與空白對(duì)照相比，接種TRV2 CqAMSlike1和TRV1農(nóng)桿菌的藜麥花序中 ?CqAMSlike1基因的表達(dá)量明顯下降，而接種TRV2空載的表達(dá)量下降不明顯（圖4-Ⅱ、圖4-Ⅳ）。在開花期藜麥頂端兩性花中，接種TRV2CqAMSlike1的藜麥花相比正常植株（圖4-Ⅲa、圖4-Ⅲd）和接種TRV2空載體的藜麥（圖4-Ⅲb、圖4-Ⅲe）相比，出現(xiàn)了花絲縮短（圖4-Ⅲc），花藥不裂，花粉難釋放的表型（圖4-Ⅲf），因VIGS沉默的不穩(wěn)定性，上述表型并非每一朵頂部?jī)尚曰ǘ紩?huì)出現(xiàn)，特別是花藥不裂，只發(fā)現(xiàn)3～4枚花藥出現(xiàn)（圖4-Ⅲe）?；ǚ刍盍z測(cè)結(jié)果顯示，正常植株和接種TRV2空載體植株的花粉活力較高（圖4-Ⅲg和圖4-? Ⅲh），而VIGS沉默 ?CqAMSlike1的藜麥中部分花粉未能染色（圖4-Ⅲi），呈現(xiàn)花粉活力明顯降低（圖4-Ⅴ），藜麥部分雄性不育，從而降低藜麥的結(jié)實(shí)率并增加空癟率（圖4-Ⅴ）。

2.5 CqAMSlike1/2與CqTDF1和CqMYB80like1? 蛋白的互作

通過BiFC對(duì)CqAMSlike1/2與CqTDF1和CqMYB80like1之間互作進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明：E3與Venus的C端、K3與Venus的N端的融合表達(dá)多肽能夠互作產(chǎn)生明顯黃色熒光（圖5-Ⅱa）; Venus的C端和N端之間不能產(chǎn)生互作，未產(chǎn)生黃色熒光（圖5-Ⅱb）。CqAMSlike1與venues的N端和C端融合表蛋白能夠互作，能產(chǎn)生較弱的黃色熒光（圖5-Ⅱc），而CqAMSlike2與venues的N端和C端融合蛋白不能互作，未產(chǎn)生黃色熒光（圖5-Ⅱd），預(yù)示著CqAMSlike1而非CqAMSlike2可形成二聚體或多聚體。進(jìn)一步互作分析發(fā)現(xiàn)CqTDF1like與venues的C端融合表達(dá)蛋白能和CqAMSlike1與venues的N端融合表達(dá)蛋白形成二聚體產(chǎn)生較弱的熒光（圖5-Ⅱe）但與CqAMSlike2與venues的N端融合表達(dá)蛋白未能檢測(cè)到熒光（圖5-Ⅱf）。CqMYB80like1與venues的C端融合表達(dá)蛋白能與CqAMSlike1的venus N端融合表達(dá)蛋白產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào)（圖5-Ⅱg）而與CqAMSlike2的N端融合表達(dá)蛋白也能形成二聚體，但產(chǎn)生熒光信號(hào)較弱（圖5-Ⅱh）。這些結(jié)果與此前報(bào)道在擬南芥中MYB80會(huì)與AMS互作調(diào)控下游基因表達(dá)相一致[15]。

3 討? 論

植物雄性不育性狀受到遺傳和環(huán)境的綜合影響[28]，目前雄性不育基因應(yīng)調(diào)控功能不同可分為影響減數(shù)分裂至敗育的PSS1[29]、AM1[30]等；影響胼胝質(zhì)代謝的AtGsl5[31]等；影響絨氈層發(fā)育的AtAMS、OsTDR[7]、OsUDT[32]等;及影響花粉壁發(fā)育的CYP704B2[33]等調(diào)控基因。在這些基因中擬南芥AtDYT1、AtAMS和水稻OsTDR、OsUDT歸屬于bHLH超家族中的Ⅲ亞家族[34]。該bHLH亞家族中的成員與花藥發(fā)育中絨氈層能發(fā)育相關(guān)，根據(jù)相似性比對(duì)，擬南芥AtAMS與水稻OsTDR、擬南芥AtDYT與水稻OsUDT均屬直系同源基因[7]。在模式植物擬南芥中花粉絨氈層調(diào)控機(jī)制已被闡明，該發(fā)育過程涉及DYT1、TDF1、AMS、MYB80、MS等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這些轉(zhuǎn)錄因子因功能的重要性其突變體常敗育，在不同植物間高度保守[8]，其中歸屬于bHLH超家族的AMS在絨氈層發(fā)育調(diào)控中起到關(guān)鍵作用[35]。

藜麥基因組的注釋中將位于17、15號(hào)染色體的兩個(gè)AMS同源基因基，均裂分為兩個(gè)預(yù)測(cè)基因，本研究通過對(duì)比轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)將拆分的基因合并后重新分別命名為 ?CqAMSlike1和 ?CqAMSlike2，新預(yù)測(cè)基因的編碼區(qū)長(zhǎng)度，蛋白序列及在染色體上內(nèi)含子數(shù)量與結(jié)構(gòu)均與擬南芥AtAMS有較高的相似性[9]。AtAMS及其直系同源基因有著明顯的時(shí)空表達(dá)特型，在花藥發(fā)育的5～8期表達(dá)量最高，之后降低，該結(jié)論在番茄和辣椒中也獲得了驗(yàn)證[9，21]。基因表達(dá)分析表明，藜麥 ?CqAMSlike1的表達(dá)模式與AtAMS 更相似，預(yù)示 CqAMSlike1比 CqAMSlike2更可能是主要發(fā)揮調(diào)控藜麥花粉絨氈層發(fā)育的AMS同源體。藜麥屬于異源四倍體，由A和B亞基因組融合[19，36]，藜麥基因組中染色體共線性分析表明定位于藜麥17號(hào)、15號(hào)染色體的分別與B基因組和A基因組二倍體物種有更多的共線性模塊[27]，推測(cè)， ?CqAMSlike1和 ?CqAMSlike2的冗余可能是在該物種形成中分別獲于2倍祖先物種的AMS同源基因，但本研究中發(fā)現(xiàn) ?CqAMSlike1和 ?CqAMSlike2表達(dá)模式和基因結(jié)構(gòu)的變異，特別是功能上與CqTDFlike、CqMYB80like1互作的變化，可能源于A、B亞基因組中祖先基因的差異及進(jìn)化中 ?CqAMSlike1和 ?CqAMSlike2結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)一步異化，但具體演化機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

VIGS沉默 ?CqAMSlike1的表型呈現(xiàn)與用VIGS降低辣椒CaAMS表達(dá)量的表型相似[21]，初步確定了 ?CqAMSlike1是藜麥中有具有功能的AtAMS直系同源基因。AMS與上游的TDF1及與下游的MS188（MYB80）形成互作網(wǎng)絡(luò)[7]。AMS基因的表達(dá)受上游轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，并且還可以與上游基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子互作形成異源二聚體，扶艷艷等[25]在蘆筍中驗(yàn)證AoTDF1與AoAMS之間存在互作，以異源二聚體的形式調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)。同樣的，AMS也可以直接結(jié)合下游基因的啟動(dòng)子中Ebox區(qū)調(diào)控其表達(dá)[37]，并與MYB80互作形成復(fù)合物，從而調(diào)控絨氈層和小孢子的發(fā)育。本研究用雙分子熒光互補(bǔ)方法初步證實(shí)CqAMSlike1與CqTDF1和CqMYB80蛋白之間均有互作（圖5-Ⅱe和5-? Ⅱg）。同時(shí)CqAMSlike1自身也發(fā)生互作反應(yīng)（圖5-Ⅱc），結(jié)果預(yù)示CqAMSlike1可能與模式植物有相似的方式調(diào)控絨氈層發(fā)育[15，16，36]。藜麥中CqAMSlike1的功能發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步預(yù)示不同物種的植物間調(diào)控絨氈層發(fā)育的模式保守的。本研究發(fā)現(xiàn)CqAMSlike2與CqAMSlike1，CqAMSlike2與CqTDF1均沒檢測(cè)到明顯的互作熒光信號(hào)（圖5），但能檢測(cè)到CqAMSlike2與CqMYB80like1的互作熒光信號(hào)，預(yù)示CqAMSlike2可能也參與花粉發(fā)育通路的調(diào)控，但該假說的驗(yàn)證及具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，藜麥 ?CqAMSlike1是藜麥中有功能的AMS同源基因，其調(diào)控絨氈層的模式可能與模式植物中AMS相似，受CqTDF1like的調(diào)控，同時(shí)其編碼產(chǎn)物又調(diào)控下游CqMYB80like1等靶基因的表達(dá)，且CqAMSlike1與CqTDF1like和CqMYB80like1可能形成復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物，調(diào)控藜麥絨氈層的發(fā)育。本研究將為闡明為藜麥花粉發(fā)育的分子機(jī)制及用于育種應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

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Cloning and Functional Analysis of CqAMSlike? in? Chenopodium quinoa

Abstract To investigate the molecular mechanism of pollen development of quinoa （Chenopodium quinoa，Willd.），CqAMS candidate genes were predicted and their coding sequences were cloned based on genomic and transcriptomic data，which included homologous alignment and RT-qPCR confirmation analysis of expression patter genes，followed by virus-indiated gene silencing （VIGS） and bimolecular fluorescence complementation （BiFC） methods to perform functional validation of the candidate genes.The results showed that quinoa had two copies of AMS homologs ，named as CqAMSlike1 and CqAMSlike2.The CDS of CqAMSlike1 has 1 929 bp，while that of CqAMSlike2 had 1 920 bp.Both genes were expressed in flowers at different developing stages of panicles，however，compared with the expression pattern of CqAMSlike2，the expression pattern of CqAMSlike1 was more consistent with the expression pattern of? AMS? gene in A.thaliana，thus the CqAMSlike1 was chosen for further function verification.Compared with the wild type，CqAMSlike1 is silenced in quinoa plants by VIGS based on tobacco rattle virus （TRV），showed phenotypes such as? partial shortened filaments，shriveled，indehiscent stamens，abortive pollens，fewer seeds and increased seed shriveling rate.Further BiFC results showed that CqAMSlike1 could interact with itself，CqTDF1 and CqMYB80，indicating that CqAMS-like1 could form homo or heteropolymers to regulate the genes expression for controlling the development of quinoa anther tapetum.The study laid a basis for elucidating the molecular mechanism of pollen tapetum development，and? creating male sterile quinoa germplasm.

Key words Chenopodiun quinoa; AMS; Virus-indiated? gene silence（VIGS）; Pollen devolpment; Protein interation