基于HPLC法測(cè)定醬鹵肉制品中山梨酸含量的不確定度分析評(píng)定

王銘海 張亦凡 龍嬌 李丹

摘 要：本文依據(jù)《國(guó)家計(jì)量技術(shù)規(guī)范 測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）對(duì)基于HPLC法測(cè)定醬鹵肉制品中山梨酸含量的不確定度進(jìn)行了綜合分析評(píng)定。結(jié)果表明，山梨酸含量為0.029 0 g·kg-1，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.041，擴(kuò)展不確定度為0.002 4 g·kg-1（p=95%，k=2）。該測(cè)定方法中標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、儀器測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制對(duì)不確定度的影響較大，其他因素則影響較小。

關(guān)鍵詞：不確定度；醬鹵肉；山梨酸；液相色譜法

Analysis and Evaluation of Uncertainty in the Determination of Sorbic Acid in Pot-Stewed Meat by HPLC

WANG Minghai1，2， ZHANG Yifan3， LONG Jiao1，2， LI Dan1，2

（1.Xixiang County Food & Drug Inspection and Testing Center， Xixiang 723500， China;

2.Xixiang County Quality Technical Supervision and Testing Center， Xixiang 723500， China;

3.Hanzhong Food & Drug Supervision and Testing Center， Hanzhong 723000， China）

Abstract： According to the provision of JJF 1059.1—2012， the uncertainty of the method in the determination of pot-stewed meat by HPLC was analyzed and evaluated comprehensively in this article. The results showed that the content of sorbic acid was 0.029 0 g·kg-1， the relative standard uncertainty was 0.041， and the expansion of uncertainty was 0.002 4 g·kg-1（p=95%， k=2）. In this determination method， the standard curve fitting， the instrumental determination and the preparation of standard series solutions have a significant influence on the uncertainty， other components have a little effect on the uncertainty.

Keywords： uncertainty; pot-stewed meat; sorbic acid; liquid chromatography

山梨酸，化學(xué)式C6H8O2，又稱涼茶酸，2，4-己二烯酸，是被聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）共同推薦的安全性高、適用性強(qiáng)的食品防腐保鮮劑之一，以其安全、經(jīng)濟(jì)、高效等諸多優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于延緩醬鹵肉、糕點(diǎn)、飲料等食品腐敗變質(zhì)，保持其營(yíng)養(yǎng)成分及口感風(fēng)味等方面[1]。本文按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB 5009.28—2016）中第一法液相色譜法，依據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）建立醬鹵肉中山梨酸測(cè)定的不確定度評(píng)定方法[2]，分析評(píng)定對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較大的不確定度分量因素，從而為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)操作、提升數(shù)據(jù)質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為1 000 mg·L-1，北京海岸鴻蒙）；甲醇（色譜純，美國(guó)費(fèi)希爾）；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅（分析純，成都科隆）；乙酸銨（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)）；實(shí)驗(yàn)用水符合《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》（GB/T 6682—2008）規(guī)定的一級(jí)水要求。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1260高效液相色譜儀（紫外-可見光檢測(cè)器）；色譜柱；分析天平（感量0.1 mg），梅特勒-托利多（上海）；移液器（10～100 μL、100～1 000 μL和500～5 000 μL）；容量瓶（10 mL和50 mL）；高速臺(tái)式離心機(jī)；渦旋振蕩器與超聲波提取機(jī)。

1.3 試樣制備及處理

依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB 5009.28—2016）中第一法液相色譜法[3]進(jìn)行試樣制備及處理，具體步驟如下。準(zhǔn)確稱取約2 g經(jīng)粉碎均勻處理后的醬鹵肉試樣于50 mL具塞離心管中，加入約25 mL水，渦旋混勻后進(jìn)行超聲提取（50 ℃，20 min），自然冷卻至室溫，再分別加入蛋白沉淀劑（106 g·L-1亞鐵氰化鉀溶液和220 g·L-1乙酸鋅溶液）各2 mL，充分振蕩混勻，第一次離心處理（8 000 r·min-1，5 min），轉(zhuǎn)移上清液至50 mL容量瓶中，加水約20 mL于下層殘?jiān)校瑴u旋混勻后超聲提取5 min，第二次離心處理（條件同前次），同樣轉(zhuǎn)移上清液至以上容量瓶中，用水定容并充分混勻。取適量上清液過濾膜（0.22 μm，水相），供液相色譜檢測(cè)用。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

100 mg·L-1山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：準(zhǔn)確吸取1 mL山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg·L-1）至10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，作標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液使用。

山梨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制：分別準(zhǔn)確吸取上述山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL和5.0 mL，加水定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg·L-1、5.00 mg·L-1、10.00 mg·L-1、20.00 mg·L-1和50.00 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.5 色譜條件

色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙酸銨溶液（20 mol·L-1）+甲醇=95+5；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：20 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 計(jì)算公式

醬鹵肉試樣中山梨酸含量計(jì)算公式為

2.2 不確定度分量的來源分析

綜合考慮樣品檢測(cè)過程和數(shù)據(jù)分析模型各影響因素可知，山梨酸含量測(cè)定不確定度主要來源于樣品稱量、試樣前處理、標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制、儀器測(cè)定、測(cè)量重復(fù)性、加標(biāo)回收試驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合等分量因素的影響。

2.3 不確定度分量的分析評(píng)定

2.3.1 樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（m）

準(zhǔn)確稱取試樣2.001 6 g，查閱《電子天平檢定規(guī)程》（JJG 1036—2022）[4]及天平檢定證書可知，該天平最大允差為±0.5 mg，按均勻分布考慮，取k=，屬B類評(píng)定，則其帶來的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.2 試樣前處理引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（q）

（1）量器校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel1（q）。試樣前處理過程中，對(duì)測(cè)定結(jié)果有直接影響的量器為容量瓶，經(jīng)查《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[5]及檢定證書可知，50 mL A級(jí)容量瓶容量允差為d=±0.05 mL，按均勻（矩形）分布考慮，取k=，屬B類評(píng)定，則由此帶來的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel2（q）。本次測(cè)定在室溫（20±5）℃條件下進(jìn)行，該條件下溶液（純水）的體積膨脹影響遠(yuǎn)大于量器的體積膨脹，故此處量器體積膨脹可不作考慮。經(jīng)查得20 ℃時(shí)純水的體積膨脹系數(shù)a=0.000 21 ℃-1[6]，按均勻（矩形）分布考慮，取k=，屬B類評(píng)定，則由溫度影響產(chǎn)生的體積變化為±（50×5×0.000 21）mL。于是，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

綜上，由試樣前處理引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（p）

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel1（p）。經(jīng)查廠家提供的山梨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書可得，山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（BW 100170-1）濃度為1 000 mg·L-1，Urel=3.0%（k=2），則由此引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

（2）量器校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel2（p）。

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過程中使用到的量器有移液器和容量瓶，移液器（100～1 000 ?L、500～5 000 ?L）的相對(duì)擴(kuò)展不確定度Urel及k值可通過校準(zhǔn)證書查得，計(jì)算公式為，而使用到的10 mL容量瓶不確定度的計(jì)算公式同上文2.3.2（1）為，則各不確定度來源及評(píng)定結(jié)果詳見表1。

于是，其合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（3）溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel3（p）。因?qū)嶒?yàn)室環(huán)境溫度變化引起的不確定度計(jì)算方法同2.3.2（2），此處不再重述，各操作步驟的不確定度來源及評(píng)定結(jié)果詳見表2所示。將表2中各不確定度分量進(jìn)行合成，則其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

綜合以上分量可得，由標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.4 液相色譜儀測(cè)定引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（y）

儀器測(cè)定引入的不確定度主要包括儀器檢測(cè)系統(tǒng)引入的不確定度和峰面積重復(fù)測(cè)量引入的不確定度。

（1）儀器檢測(cè)系統(tǒng)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel1（y）。經(jīng)查儀器檢定證書可得，儀器檢測(cè)器定量重復(fù)性允許誤差為3.0%，按均勻（矩形）分布考慮，取k=，屬B類評(píng)定，則其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

（2）峰面積重復(fù)測(cè)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel2（y）。在本次評(píng)定中，采用10.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)得峰面積分別為556、547、555、549、552和561，峰面積的平均值為553，按A類評(píng)定，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

綜上，由液相色譜儀測(cè)定引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.5 測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（c）

按照1.3樣品處理方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)室陽(yáng)性質(zhì)控醬鹵肉樣品進(jìn)行10次重復(fù)測(cè)定，山梨酸含量檢測(cè)結(jié)果分別為0.028 8 g·kg-1、0.029 2 g·kg-1、0.029 0 g·kg-1、0.029 0 g·kg-1、0.028 6 g·kg-1、0.028 9 g·kg-1、0.029 1 g·kg-1、0.028 7 g·kg-1、0.029 4 g·kg-1和0.028 8 g·kg-1，濃度平均值為0.029 0 g·kg-1，按A類評(píng)定，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

2.3.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（h）

對(duì)無本底樣品基質(zhì)分別進(jìn)行高、中、低3個(gè)濃度加標(biāo)試驗(yàn)，9次重復(fù)測(cè)定，其回收率分別為98.2%、98.1%、98.2%、96.5%、96.6%、96.4%、95.3%、95.2%和95.2%，回收率平均值為96.6%。按A類評(píng)定，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

2.3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（s）

將上述配制的5個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)系列溶液直接上機(jī)測(cè)定，每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)測(cè)定2次，通過儀器配套數(shù)據(jù)處理軟件擬合生成線性回歸方程，可得到各校準(zhǔn)點(diǎn)C對(duì)應(yīng)的色譜峰面積A，具體測(cè)定結(jié)果如表3所示。因此，標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

式中：b為斜率，b=56.257 54；a為截距，a=-8.597 82；Ai為各濃度標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的峰面積；n為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的測(cè)定次數(shù)，n=10；為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度平均值， mg·L-1；Ci為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液對(duì)應(yīng)的濃度值；p為試樣測(cè)定次數(shù)，p=6；根據(jù)2.3.5數(shù)據(jù)，由公式（1）計(jì)算可得，試樣10次重復(fù)測(cè)量的質(zhì)量濃度平均值=1.16 mg·L-1。

通過公式（2）和（3）代入計(jì)算可得，S=3.67 mg·L-1，u（s）=0.038 mg·L-1，于是其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.4 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

綜上所述，各不確定度分量及來源如表4所示，由此可得其合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.5 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果報(bào)告

本次分析評(píng)定中，醬鹵肉試樣中山梨酸含量為0.029 0 g·kg-1，按正態(tài)分布，取k=2（置信水平95%）[7]，則其擴(kuò)展不確定度U=X×urel（X）×k=0.029 0×0.041×2=0.002 4 g·kg-1。

根據(jù)以上不確定度評(píng)定的結(jié)果，則采用高效液相色譜法測(cè)定醬鹵肉中山梨酸含量的結(jié)果報(bào)告應(yīng)報(bào)告為X=（0.029 0±0.002 4）g·kg-1，k=2。

3 結(jié)論

對(duì)各不確定度分量及來源按相對(duì)貢獻(xiàn)率大小排序分析可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、儀器測(cè)定因素和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制對(duì)醬鹵肉中山梨酸含量測(cè)定不確定度影響較大；加標(biāo)回收試驗(yàn)、測(cè)量重復(fù)性、樣品前處理、樣品稱量因素則影響較小。因此，在實(shí)際檢測(cè)工作中對(duì)關(guān)鍵影響因素進(jìn)行針對(duì)性把控則顯得尤為重要，即標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋配制應(yīng)嚴(yán)格規(guī)范操作，測(cè)量?jī)x器選配方面應(yīng)兼具儀器精密度、軟件分析性能和性價(jià)比等因素，從而提升測(cè)量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠性。

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作者簡(jiǎn)介：王銘海（1988—），男，陜西西鄉(xiāng)人，碩士，工程師。研究方向：食品安全檢驗(yàn)分析與計(jì)量技術(shù)管理。