免疫親和層析高效液相色譜法對小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定

榮明華

摘 要：目的：建立測定小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的免疫親和層析高效液相色譜法。方法：小麥粉經(jīng)粉碎處理，用水提取，通過免疫親和柱上樣、凈化和洗脫后，用高效液相色譜儀測定小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量。結(jié)果：在100～5 000 ng·mL-1，方法的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 8，檢出限為48 ng·mL-1，回收率為90.1%～109.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.49%～2.20%。結(jié)論：該方法操作步驟簡便，特異性強(qiáng)，精密度高，可以作為大批量分析小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的處理方案。

關(guān)鍵詞：小麥粉；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；免疫親和柱

Abstract： Objective： To establish an immunoaffinity chromatography method for the determination of deoxynivalenol in wheat flour. Method： Wheat flour was crushed and extracted with water. After immunoaffinity column sampling， purification and elution， the content of deoxynivalenol in wheat flour was determined by HPLC. Result： In the range of 100～5 000 ng·mL-1， the linearity of the method was good， the correlation coefficient （R2） was 0.999 8， the detection limit was 48 ng·mL-1， the recovery was 90.1%～109.6%， and the relative standard deviation was 1.49%～2.20%. Conclusion： The method is simple， specific and precise， and can be used as a treatment scheme for mass analysis of deoxynivalenol content in wheat flour.

Keywords： wheat flour; deoxynivalenol; immunoaffinity columns

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），又稱嘔吐毒素，化學(xué)式為C15H20O6。它主要是由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀桿菌產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物[1]。在我國小麥赤霉病頻發(fā)地區(qū)，禾谷鐮刀菌是占比較高的致病菌種[2]。當(dāng)動(dòng)物食入含有DON的食物后，會(huì)產(chǎn)生嘔吐等急性中毒癥狀，長期低劑量攝入含DON的食物會(huì)引起厭食、生長緩慢、免疫毒性和母性毒性導(dǎo)致的生殖發(fā)育障礙[3]。我國流行病學(xué)研究表明，嘔吐毒素也可能對人類產(chǎn)生催吐作用[4]。與此同時(shí)，近幾年的研究表明人類食管癌、免疫球蛋白A腎病的患病原因可能與DON有關(guān)，嚴(yán)重威脅了人們和動(dòng)物的身體健康[5]。由于我國居民在日常生活中食用小麥粉谷物加工制品比例較高，因此受到DON毒素危害的影響更為明顯。

河南省是“中原糧倉”，是糧食產(chǎn)出、消費(fèi)及儲(chǔ)備大省。糧食安全關(guān)乎人們的切身利益及社會(huì)的穩(wěn)定發(fā)展，因此保障糧食安全是重中之重。數(shù)據(jù)顯示，2018—2019年對159份小麥粉樣品進(jìn)行檢測時(shí)，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢出率為78.0%[6]。該結(jié)果說明小麥粉中DON的檢出率極高。因此，需要更準(zhǔn)確、快速的檢測手段對小麥粉制品中存在的DON進(jìn)行檢測。免疫親和柱層析作為前處理技術(shù)，其具有操作步驟簡單、敏感度高、可以特異識(shí)別和結(jié)合抗體、有效提高樣品凈化純度的特點(diǎn)[7]。本文通過免疫親和柱層析法，使用高效液相色譜儀檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量，為處理大量小麥粉樣品提供方案。

1 材料與方法

1.1 材料

河南省省抽第一季度小麥粉陰性樣品。

1.2 試劑

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)品[GBW（E）100304，濃度為100.0 ?g·mL-1，國家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)院研究院]；甲醇（色譜純）；氯化鈉（分析純）；超純水。

1.3 儀器與設(shè)備

電子天平（ME204E，METTLER TOLEDO）；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)（湘儀）；UPR-II-10T超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；J2 Scientific PPM48正壓固相萃取凈化儀；免疫親和柱（德國r-biopharm公司）；MFV-12氮吹儀（得泰儀器）；微孔濾膜（0.22 ?m，津騰）；HD-2500多管漩渦混合儀（杭州佑寧儀器）；Venusil XBP C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 ?m，Agela Technologies）；Agilent 1260高效液相色譜儀；DHP-9032電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

吸取1 mL DON標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度線得到10 000 ng·mL-1的DON標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別吸取0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL和5.0 mL的DON中間液于10 mL容量瓶中，得到100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1、1 000 ng·mL-1、2 000 ng·mL-1和5 000 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，儲(chǔ)藏于4 ℃冰箱，保質(zhì)期為7 d。

1.4.2 樣品前處理

將大于1 kg的小麥粉樣品粉碎混合均勻分裝至樣品袋中，密封至干燥處保存，供實(shí)驗(yàn)所用。在100 mL錐形瓶中加入25 g小麥粉樣品，5 g氯化鈉，200 mL超純水混勻。置于多管漩渦混合儀上振蕩5 min，5 000 r·min-1離心5 min，經(jīng)濾紙過濾。將處于4 ℃存放的免疫親和柱置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度為25 ℃，待免疫親和柱恢復(fù)至室溫。保持實(shí)驗(yàn)室溫度在24～28 ℃，將轉(zhuǎn)向柱頂部拆下，待免疫親和柱保護(hù)液流盡，取2 mL濾液至免疫親和柱中，使用正壓固相萃取凈化儀調(diào)節(jié)濾液并保持穩(wěn)定、緩慢的速度通過免疫親和柱，確保濾液與抗體凝膠充分接觸。用10 mL超純水洗滌免疫親和柱，直到空氣進(jìn)入親和柱，確保除去殘留液體。加入2 mL 100%甲醇洗脫柱子，使用5 mL試管收集流出液。將試管嵌于氮吹儀上，在50 ℃水浴下蒸發(fā)吹干。移取1.0 mL 20%甲醇水于試管中，旋轉(zhuǎn)振蕩20 s，經(jīng)0.22 ?m濾膜過濾，用樣品瓶收集濾液待檢測分析，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 色譜檢測條件

Venusil XBP C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 ?m，Agela Technologies）；流動(dòng)相比例：甲醇∶水=20∶80；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣體積：50 ?L；檢測波長：218 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 柱容量驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取濃度為100.0 ?g·mL-1的DON標(biāo)準(zhǔn)品0.06 mL于5 mL水中，充分振蕩得到濃度為1 200 ng·mL-1的混合液，依次移取1 mL混合液至同一批次3根免疫親和柱中?；旌弦航?jīng)提取、凈化和洗脫后，在50 ℃氮?dú)庀麓蹈?，? mL試管中加入1 mL初始流動(dòng)相甲醇水（20+80），渦旋振蕩，使用高效液相色譜儀測定待測液中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量。如表1所示，同批次3根免疫親和柱過柱后，測定的DON含量的平均值為1 000 ng，回收率為83.3%。該批次免疫親和柱符合國標(biāo)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》（GB 5009.111—2016）免疫親和柱參數(shù)要求（DON≥1 000 ng，回收率≥80%），可以使用[6]。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法檢出限

依次對1.4.1系列工作液進(jìn)行檢測，以DON濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖1可知，在100～5 000 ng·mL-1，線性方程為y=0.057 08x+0.841 3（R2=0.999 8），線性關(guān)系良好。以最低濃度100 ng·mL-1的3倍信噪比作為最低檢出限，得到最低檢出限為48 ng·mL-1，低于國家標(biāo)準(zhǔn)（50 ng·mL-1），滿足日常檢測需求。

2.3 精密度試驗(yàn)

取1.4.1中500 ng·mL-1的DON標(biāo)準(zhǔn)工作液連續(xù)進(jìn)針6次，測定結(jié)果的平均相對偏差為0.86%，精密度良好，滿足國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.111—2016的要求，即在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)條件下計(jì)算得到的兩次測定值的絕對差值不高于算術(shù)平均根的23%[6]。結(jié)果見表2。

2.4 回收率試驗(yàn)

稱取3份陰性小麥粉樣品25 g進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，向其中依次添加濃度為250 ng·mL-1、500 ng·mL-1、1 000 ng·mL-1的DON標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，按1.4.2樣品前處理進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)。由表3可知，加標(biāo)回收率在90.1%～109.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.49%～2.20%，符合《合格評定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》（GB/T 27417—2017）要求。

3 結(jié)論

本文建立了免疫親和層析高效液相色譜法對小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量測定的方法。該方法的檢出限為48 ng·mL-1，平均相對偏差為0.86%。除此之外，該方法的樣品前處理過程簡單，靈敏度高，重復(fù)性良好，使用試劑較少，可以有效減少試劑配制過程中的人為誤差，可滿足日常工作中對大量小麥粉樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測。

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