24重?zé)晒鈘eal-time PCR技術(shù)在食物中毒快速檢測(cè)中的應(yīng)用

盧媛 鐘穎濤

摘 要：目的：應(yīng)用24重?zé)晒鈘eal-time PCR檢測(cè)技術(shù)快速篩檢食物中毒病原菌，結(jié)合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的培養(yǎng)法探討24重?zé)晒鈘eal-time PCR檢測(cè)技術(shù)符合性和應(yīng)用價(jià)值。方法：采用高靈敏度、高特異性的24重?zé)晒鈘eal-time PCR檢測(cè)技術(shù)作為中毒病原菌的初篩方法，國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，并對(duì)分離出的病原菌進(jìn)行生化鑒定。結(jié)果：5份食物中毒患者肛拭子在增菌前檢出4份霍亂弧菌核酸（非O1/非O139群，24重?zé)晒鈘eal-time PCR），9份患者肛拭子在增菌后檢出5株霍亂弧菌（非O1/非O139群，國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法），其中包含4份PCR技術(shù)初篩陽(yáng)性樣品，兩個(gè)方法的符合率為80%。所有樣本均未檢出沙門(mén)氏菌、志賀菌、副溶血性弧菌、致瀉性大腸埃希菌以及金黃色葡萄球菌。結(jié)論：應(yīng)用24重?zé)晒鈘eal-time PCR檢測(cè)技術(shù)同時(shí)檢測(cè)24種常見(jiàn)致病病原菌，能高效鎖定中毒病原菌。將其與國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法相結(jié)合，對(duì)臨床治療和食物中毒快速處置能起到積極作用，值得應(yīng)用和推廣。

關(guān)鍵詞：24重?zé)晒鈘eal-time PCR技術(shù)；培養(yǎng)法；食物中毒

Abstract： Objective： To use 24-plex fluorescence real-time PCR detection technology to rapidly screen food poisoning pathogens， and to explore the compliance and application value of 24-plex fluorescence real-time PCR detection technology combined with national standard culture method. Method： The 24-plex fluorescence real-time PCR detection technology with high sensitivity and specificity was used as the primary screening method for toxic pathogens， and the bacteria were isolated and cultured by national standard method， and the isolated pathogenic bacteria were biochemically identified. Result： Four samples of Vibrio cholerae nucleic acid （non O1/non O139 group， 24-plex fluorescence real-time PCR） were detected from the anal swabs of 5 food poisoning patients before bacterial enrichment. Nine samples of patients detected five strains of Vibrio cholerae （non O1/non O139 group， national standard culture method） from their anal swabs after bacterial enrichment， including four samples that were initially screened positive by PCR technology. The compliance rate of the two methods was 80%. All samples did not detect Salmonella， Shigella， Vibrio parahaemolyticus， Escherichia coli， or Staphylococcus aureus. Conclusion： The 24-plex fluorescence real-time PCR detection technology was used to detect 24 common pathogenic bacteria at the same time， which could effectively lock the poisoning pathogens. Combining it with national standard culture method can play a positive role in clinical treatment and rapid treatment of food poisoning， which is worthy of application and promotion.

Keywords： 24-plex fluorescence real-time PCR; culture method; food poisoning

食物中毒事件大多數(shù)是突發(fā)的，涉及人員較多，中毒機(jī)制復(fù)雜，致病因子較多，單靠現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查較難推斷中毒病原體，甚至現(xiàn)場(chǎng)沒(méi)有線(xiàn)索無(wú)法判斷中毒病原體，這種情況下只能把常見(jiàn)的多種致病菌都按照國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法流程進(jìn)行增菌分離，該過(guò)程工作量大、操作煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，無(wú)法及時(shí)為事件處置提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，降低了事件處置效率，不利于臨床救治。采用24重?zé)晒鈘eal-time PCR檢測(cè)技術(shù)快速篩檢食物中毒病原菌，高效鎖定病原菌，并與國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法相結(jié)合，可為及時(shí)進(jìn)行事件處置和臨床救治提供依據(jù)。

2022年清遠(yuǎn)市發(fā)生一起食物中毒事件，主要癥狀為腹瀉、嘔吐，接報(bào)后，應(yīng)急小組趕赴現(xiàn)場(chǎng)開(kāi)展流行病學(xué)調(diào)查和采樣工作，采集樣品送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。由于致病因子不明，而24重?zé)晒鈘eal-time PCR技術(shù)同時(shí)可以檢測(cè)沙門(mén)菌、志賀菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌以及變形桿菌等24種病原體，故實(shí)驗(yàn)室直接采用24重?zé)晒鈘eal-time PCR技術(shù)對(duì)5份癥狀比較嚴(yán)重的患者肛拭子進(jìn)行初篩，以期能高效鎖定中毒病原菌，提高事件處置效率，為臨床救治贏得時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集9份患者肛拭子樣品，10份廚房環(huán)境樣品，2份水樣品，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.2 儀器與試劑

48位核酸提取儀（中國(guó)上海伯杰醫(yī)療科技有限公司）；ABI7500型real-time PCR 儀（美國(guó)ABI公司）；堿性蛋白胨水、3%堿性蛋白胨水、緩沖蛋白胨水、7.5%氯化鈉肉湯、志賀氏菌增菌液、營(yíng)養(yǎng)肉湯、弧菌顯色平板、TCBS平板、4號(hào)平板、沙門(mén)菌顯色平板、金黃色葡萄球菌顯色平板、大腸菌顯色平板，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；生化鑒定試劑盒（批號(hào)：5110416），廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司；霍亂弧菌診斷血清O1群、O139（批號(hào)：20220101），寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司；核酸提取試劑（BG001B提取程序），上海伯杰醫(yī)療科技有限公司；24種腹瀉病原體多重病原體核酸快速檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法，批號(hào)22051806/7），生凌醫(yī)療。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 24重?zé)晒鈘eal-time PCR法

吸取200 μL樣品按提取試劑要求進(jìn)行提取，吸取5 μL提取好的樣品核酸到擴(kuò)增試劑，混勻離心后上PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增（擴(kuò)增升溫程序：50 ℃保溫?15 min，95 ℃保溫 5 min，95 ℃保溫3 s，55 ℃保溫45 s，并在該階段收集熒光信號(hào)，循環(huán)45次）。共檢測(cè)沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、變形桿菌、結(jié)腸彎曲菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、大腸桿菌O157、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲菌、小腸耶爾森菌、肉毒桿菌、EPEC（bfp、escV）、輪狀病毒A型、諾如病毒（GI型、GⅡ型）、腸道腺病毒、札如病毒、星狀病毒以及腺病毒24種腹瀉病原體。

1.3.2 培養(yǎng)法

按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法檢驗(yàn)程序[1-5]要求對(duì)食源性致病菌進(jìn)行增菌培養(yǎng)、分離鑒定，采用24重?zé)晒鈘eal-time PCR技術(shù)初篩病原菌并進(jìn)行重點(diǎn)增菌培養(yǎng)[6-7]，同時(shí)將培養(yǎng)鑒定結(jié)果與24重?zé)蓃eal-time PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

采用24重?zé)晒鈘eal-time PCR技術(shù)對(duì)5份患者樣品進(jìn)行初篩，其中有4份檢出霍亂弧菌核酸，經(jīng)霍亂弧菌核酸試劑盒（O1、O139型，PCR法）確定為非O1/非O139群霍亂弧菌；采用國(guó)標(biāo)法對(duì)9份患者樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)，檢出5株霍亂弧菌（非O1/非O139群）（經(jīng)PCR技術(shù)初篩為陽(yáng)性的樣品4份以及陰性樣品1份），兩種方法檢測(cè)結(jié)果相符率為80%。2份環(huán)境樣品經(jīng)國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法檢出霍亂弧菌（非O1/非O139群），其余樣品霍亂弧菌檢測(cè)結(jié)果均為陰性。兩法均未檢出沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、致瀉性大腸埃希菌以及金黃色葡萄球菌。

2.1 24重?zé)晒鈘eal-time PCR技術(shù)檢出情況

樣品中霍亂弧菌核酸擴(kuò)增曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期即可判定為陽(yáng)性，從圖中可以看出，5份患者樣品在增菌前直接用24重?zé)蓃eal-time PCR法檢測(cè)，其中4份檢出霍亂弧菌核酸，循環(huán)數(shù)≤36。

2.2 國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法檢出情況

采用國(guó)標(biāo)法對(duì)9份患者肛拭子樣品、10份廚房環(huán)境樣品、2份水樣品進(jìn)行病原菌檢測(cè)，結(jié)果只有弧菌顯色平板上可見(jiàn)藍(lán)綠色菌落，TCBS平板上可見(jiàn)黃色菌落，4號(hào)平板可見(jiàn)中心灰色半透明可疑菌落。挑出可疑菌落進(jìn)一步分離純化，經(jīng)革蘭染色鏡檢、血清診斷、生化鑒定后確定為霍亂弧菌（非O1/非O139群）。

3 討論與結(jié)論

本次食物中毒事件患者只出現(xiàn)了腸胃不適，沒(méi)有其他明顯癥狀，現(xiàn)場(chǎng)流調(diào)結(jié)果為致病因子暫不明確，因此實(shí)驗(yàn)室直接用24重?zé)晒鈘eal-time PCR技術(shù)進(jìn)行初篩，一次直接篩查24種病原體，整個(gè)過(guò)程僅用3 h就鎖定中毒致病菌，對(duì)查明事件原因、減輕國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法工作量、確定臨床救治方案發(fā)揮了重要作用。經(jīng)國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法驗(yàn)證，兩法符合率達(dá)80%，表明24重?zé)晒鈘eal-time PCR檢測(cè)結(jié)果具有較高的可信度，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[8]。該事件中有1份樣品經(jīng)24重?zé)晒鈘eal-time PCR技術(shù)初篩為陰性，但經(jīng)國(guó)標(biāo)法增菌培養(yǎng)后檢出霍亂弧菌（非O1/非O139群），這可能是因?yàn)樵鼍霸摌悠泛谢魜y弧菌（非O1/非O139群）核酸量低于PCR技術(shù)檢出限，建議后續(xù)檢測(cè)時(shí)可先進(jìn)行短期增菌后再應(yīng)用多重real-time PCR技術(shù)初篩，避免假陰性結(jié)果。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的核酸片段的分子生物學(xué)技術(shù)，是生物體外的特殊核酸復(fù)制，只要能提取出核酸，就能用PCR技術(shù)加以放大，進(jìn)行比對(duì)。PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的核酸大幅增加。食物中毒事件涉及人員較多，且極為復(fù)雜，現(xiàn)場(chǎng)遺留的中毒病原體可能極其微量，食物中毒事件處置過(guò)程中快速明確中毒病原體是事件定性的關(guān)鍵。僅按照國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行分離培養(yǎng)、生化鑒定等，耗時(shí)費(fèi)力，難以滿(mǎn)足高效處置事件的要求，因此建立一種準(zhǔn)確、高效、靈敏、便捷的食物中毒病原體快篩方法意義重大[9]。近幾年有關(guān)學(xué)者針對(duì)食物中毒快速檢測(cè)方法進(jìn)行了大量研究[10-12]，提出多重PCR技術(shù)是快速檢測(cè)食物中毒病原體的有效方法[13-15]。

24重?zé)晒鈘eal-time PCR技術(shù)設(shè)計(jì)了24種病原體的核酸引物，只要提取到微量核酸就可以同時(shí)排查24種病原體，具有篩查病原體多、靈敏度高、特異性強(qiáng)、速度快以及操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)[16-18]，其能在3～5 h鎖定主要目標(biāo)病原體，對(duì)常見(jiàn)的諾如病毒、輪狀病毒等腹瀉病原體也可以進(jìn)行初篩，可以檢測(cè)食物樣品、環(huán)境樣品、排泄物以及嘔吐物等多種樣品，適用于快速初篩食物中毒病原體。24重?zé)晒鈘eal-time PCR技術(shù)應(yīng)用前景廣闊：①區(qū)、縣級(jí)疾病預(yù)防控制中心基本都配備了P2實(shí)驗(yàn)室、PCR儀、提取儀等設(shè)備；②檢驗(yàn)人員接受過(guò)PCR檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn)，可以熟練操作PCR儀，如果發(fā)生食物中毒事件，區(qū)、縣實(shí)驗(yàn)室可以依靠自己的力量進(jìn)行病原體初篩檢測(cè)，有利于有效控制事件發(fā)展；③24種腹瀉病原體核酸試劑盒商品化日益成熟，試劑耗材供應(yīng)穩(wěn)定，強(qiáng)大的物流運(yùn)輸完全可以保障試劑盒全程冷鏈監(jiān)測(cè)方式送達(dá)客戶(hù)手中，確保試劑盒質(zhì)量。但該技術(shù)也存在以下不足：①基于PCR檢測(cè)技術(shù)原理為體外基因片段的擴(kuò)增，如果樣本被污染，則可能造成假陽(yáng)性結(jié)果；②對(duì)于細(xì)菌性感染事件，PCR檢測(cè)技術(shù)還未被國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)利用，使用PCR檢測(cè)技術(shù)快速鎖定一種或者幾種目標(biāo)菌，依然要結(jié)合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行驗(yàn)證；③24種腹瀉病原體PCR檢測(cè)試劑盒價(jià)格昂貴，一些實(shí)驗(yàn)室經(jīng)費(fèi)預(yù)算不足，暫時(shí)無(wú)法普及開(kāi)展。

綜上所述，將24重?zé)晒鈘eal-time PCR檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用在食物中毒事件中有助于高效鎖定病原體，可以與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)合使用，應(yīng)用前景較好，值得推廣應(yīng)用。

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作者簡(jiǎn)介：盧媛（1989—），女，廣東河源人，本科，主管技師。研究方向：衛(wèi)生檢驗(yàn)。