磷肥用量對紅壤區(qū)稻田土壤磷酸酶活性及解磷菌分布的影響

黎穎惠 邢肖毅 仇旭 許仕榮 倪緋 趙煉 楊賢均

關(guān)鍵詞：磷肥；磷活化；稻田土壤；有效磷；磷酸酶；phoD；解磷菌

磷素是植物生長必需的大量元素之一，我國農(nóng)田土壤普遍缺磷。一般認(rèn)為，有效磷含量低于10mg/kg的土壤即為缺磷土壤。而我國湖南、江西、廣西、云南等典型紅壤區(qū)，土壤有效磷含量多在5mg/kg左右，遠(yuǎn)低于世界平均水平。施用磷肥是提高土壤有效磷含量的重要途徑，紅壤區(qū)磷肥投入水平往往較高。然而，紅壤富含鐵鋁礦物，對磷素具有極強(qiáng)的結(jié)合固定能力，研究顯示約有80%的磷肥進(jìn)入紅壤后，通過吸附、共沉淀等過程被土壤顆粒快速固定，成為難以被作物吸收利用的固定形態(tài)，導(dǎo)致土壤中固定態(tài)磷大量蓄積。因此，紅壤中存在著有效磷不足與固定態(tài)磷盈余的雙重問題?；罨寥懒讕?，開發(fā)和有效利用被土壤固定的磷，提高土壤磷素利用效率，是解決上述矛盾的關(guān)鍵。有研究表明，適量施用磷肥不僅可以補(bǔ)充外源速效磷，還可降低土壤對磷酸根的吸附量，甚至促進(jìn)土壤本底磷的礦化，提高土壤供磷能力。Bauke等對磷肥施用條件下土壤本底磷釋放能力的研究結(jié)果表明，相較于不施磷肥，適量施用磷肥更有利于底層土壤固定態(tài)磷的釋放。

土壤中分布著大量的解磷菌，是土壤磷活化的主要驅(qū)動(dòng)者，可通過分泌磷酸酶促進(jìn)有機(jī)磷的活化。解磷菌在自然狀態(tài)下，多處于休眠或潛在活躍狀態(tài)，解磷效率較低。適當(dāng)施用磷肥可刺激解磷菌的生長，激發(fā)土壤本底無效磷的釋放。李春越等基于分離培養(yǎng)法研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)施用磷肥[60kg/（hm2·a）]可提高黃土區(qū)農(nóng)田土壤有機(jī)磷和無機(jī)磷細(xì)菌豐度，且有機(jī)磷細(xì)菌對磷肥更為敏感，最終促進(jìn)有機(jī)磷礦化。微生物對有機(jī)磷的活化主要指磷酸酶的礦化作用，其中堿性磷酸酶幾乎特異性地來源于微生物，因此被認(rèn)為是有機(jī)磷微生物活化過程的重要驅(qū)動(dòng)者。堿性磷酸酶的編碼基因phoD由于分布廣泛，活性強(qiáng)、多樣性高，被廣泛應(yīng)用于土壤有機(jī)磷轉(zhuǎn)化過程的研究。已有研究表明，當(dāng)土壤適量施用化學(xué)磷肥時(shí)，可提高含phoD基因的解磷菌豐度及某些特定類群的相對豐度，繼而增加磷酸酶活性，提高土壤有效磷含量。例如，當(dāng)土壤中施人50mg/kg的磷素時(shí)，相較于不施磷肥和200mg/kg的施磷處理，其phoD基因豐度最高，且不同用量磷肥施用條件下，解磷菌的組成不同。然而，當(dāng)化學(xué)磷肥施用量較大時(shí)，會(huì)抑制解磷菌的生長和磷酸酶的合成。盡管目前關(guān)于磷活化的研究已經(jīng)較多，但是對于紅壤區(qū)磷肥施用量對土壤磷活化及解磷菌群落結(jié)構(gòu)影響的研究還比較少見，解磷菌在磷活化中的作用尚不明確。為此，本研究以紅壤區(qū)稻田土壤為材料，對比分析磷肥不同施用量處理下，土壤有效磷含量、磷酸酶活性的變化，以及含phoD基因解磷菌的群落特征，明確磷肥施用對土壤磷活化的影響及其微生物驅(qū)動(dòng)機(jī)制，以期為紅壤區(qū)磷肥高效利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試土壤和培養(yǎng)方法

2020年10月在湖南省邵陽市紅壤區(qū)采集稻田0～20cm土層土壤，土壤有效磷含量為11.39mg/kg。土樣風(fēng)干過2 mm篩后，調(diào)節(jié)土壤水分為25%孔隙充水度（25% WFPS），25℃培養(yǎng)一周以恢復(fù)微生物活性。以磷酸二氫鉀形式施入磷肥，磷素設(shè)置20（P20）、50（P50）、80 mg/kg（P80）3個(gè)水平，調(diào)節(jié)土壤水分為60%田間持水量，每個(gè)處理稱取50g土壤，于100mL玻璃培養(yǎng)缽中進(jìn)行好氧培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次，在25℃下培養(yǎng)一周。

1.2樣品采集、測定項(xiàng)目及方法

培養(yǎng)結(jié)束后，充分混勻培養(yǎng)缽中的土壤樣品，取約10g樣品置于-80℃條件下保存，用于測定含phoD基因解磷菌群落結(jié)構(gòu)，其余樣品于4℃保存，用于測定土壤有效磷含量和磷酸酶活性。

土壤總DNA的提取采用mobio試劑盒，含phoD基因解磷菌的擴(kuò)增引物為ALPS-730F（CAGTGGGACGACCACGAGGT）和ALPS-110IR（GAGGCCGATCGGCATGTCG）。擴(kuò)增條件為95℃5min;95℃30s，58℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)：72℃10min。高通量測序平臺(tái)為Illumi-na，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，測序數(shù)據(jù)按97%序列相似度劃分OTU。土壤有效磷含量采用鉬藍(lán)比色法測定，土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法，酸性、中性、堿性磷酸酶的緩沖液分別為醋酸、檸檬酸和硼酸緩沖液。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2017整理數(shù)據(jù)，用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。a多樣性指數(shù)中，Ace和Chaol指數(shù)用來估計(jì)樣本中OTU數(shù)目，Simp-son和Shannon指數(shù)用來估計(jì)樣本中微生物的多樣性。土壤有效磷含量、磷酸酶活性以及含phoD解磷菌a多樣性的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），Duncan's法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（P<0.05）。采用主成分分析法（PCA）分析土壤解磷菌群落結(jié)構(gòu)，數(shù)據(jù)可視化采用Canoco4.5軟件進(jìn)行。將OTU代表序列運(yùn)用BLAST進(jìn)行序列對比（ https：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/），明確分類信息。

2結(jié)果與分析

2.1不同磷肥用量對稻田土壤有效磷含量的影響

磷肥施用量顯著影響土壤有效磷含量（圖1）。供試土壤原始有效磷含量為11.39mg/kg，施加20、50、80mg/kg磷素后，土壤有效磷含量分別升至15.92、24.04、37.08mg/kg，僅分別增加4.53．12.65、25.69mg/kg。可見施入土壤中的磷肥被大量固定，只有小部分轉(zhuǎn)化為有效磷。三種施肥量條件下，土壤磷有效性指數(shù)（土壤有效磷增加量占施磷量的百分比）分別為22.65%、25.30%和32.11%，表明隨著磷肥施用量的增加，有更高比例的磷素轉(zhuǎn)化為土壤有效磷。

2.2不同磷肥用量對稻田土壤磷酸酶活性的影響

由圖2可見，整體而言，土壤酸性磷酸酶活性高于中性磷酸酶，堿性磷酸酶活性最低，表明土壤酸性磷酸酶對磷肥的響應(yīng)更為強(qiáng)烈。隨磷肥施用量的增加，土壤酸性磷酸酶活性呈先增加后降低趨勢，P50處理?xiàng)l件下活性最高，達(dá)4.06mg·g-1．d-1，顯著高于P20和P80處理，而后二者間無顯著差異。中性磷酸酶和堿性磷酸酶活性也表現(xiàn)為P50處理最高，但3個(gè)施肥處理間差異較小，均未達(dá)顯著水平。

2.3不同磷肥用量對稻田土壤解磷茵a多樣性的影響

土壤中含phoD基因解磷菌的Ace、Chaol和Shannon指數(shù)均隨磷肥施用量的增加而顯著降低，而Simpson則呈現(xiàn)相反趨勢（表1）。與P20處理相比，P50、P80處理下解磷菌Ace、Chaol指數(shù)和Shannon指數(shù)分別降低14.9%、30.3%、15.0%、27.7%和13.1%、25.0%。Simpson指數(shù)則以P20處理最低，與P50和P80處理差異達(dá)顯著水平，但后兩者無顯著差異。綜上可知，施用磷肥導(dǎo)致土壤解磷菌的豐富度和多樣性顯著降低，且施肥量越大，降幅越大。

2.4不同磷肥用量對稻田土壤解磷茵群落組成的影響

對含phoD基因解磷菌的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行PCoA分析（圖3），前兩軸對總變異的累積貢獻(xiàn)率為78.2%。相同磷用量處理的土壤樣品在PCoA圖上相對聚集，而不同用量處理的樣品則明顯分開，表明施用磷肥強(qiáng)烈影響含phoD解磷菌的群落結(jié)構(gòu)。

對相對豐度大于5%的OTU繪制解磷菌群落組成圖（圖4），可以看出三種施肥量條件下土壤解磷菌組成差異明顯。總體而言，OTU769相對豐度最大．P50處理下達(dá)到近30%，其次分別是P80和P20處理，相對豐度分別為20.09%和9.76%。將其代表序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，未比對上已有序列。OTU1036同樣具有較高的豐度，尤其是P80處理相對豐度為24.93%，而P20和P50處理相對豐度均在10%左右。另外OTU975也對施肥表現(xiàn)出明顯響應(yīng)，且其相對豐度同樣以P80處理最高，為11.74%，而其他兩個(gè)處理下相對豐度均在5%左右。根據(jù)序列比對，OTU1036和OTU975可能從屬于假單胞桿菌屬（Pseudomonas）。

3討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，施用外源磷肥顯著提高土壤有效磷含量，且隨磷肥用量的增加，土壤有效磷含量升高，但土壤有效磷的增加量遠(yuǎn)低于外源補(bǔ)充的磷量。由此可見，大量的外源磷肥被土壤顆粒所固定。這是因?yàn)榧t壤富含鐵鋁礦物，對磷素具有極強(qiáng)的結(jié)合固定能力。本研究中，當(dāng)磷素施用量為20mg/kg時(shí)，土壤有效磷僅增加4.53mg/kg，約為施用量的22%。而當(dāng)施磷量增加至50、80mg/kg時(shí)，土壤有效磷增加量占施用量的比重有所提高，分別為25.30%、32.11%。即隨磷肥施用量的增加，有更高比例的磷素轉(zhuǎn)化為有效磷。向曉玲等研究也發(fā)現(xiàn)，易解吸磷隨施磷量的增加而增加。另外，較高的磷肥用量也可能促進(jìn)了土壤磷的活化。馬殿葉研究發(fā)現(xiàn)，磷素活化系數(shù)隨磷肥施用量的增加而升高。

解磷微生物分泌磷酸酶對有機(jī)磷進(jìn)行礦化是磷活化的重要途徑之一。本研究發(fā)現(xiàn)，土壤酸性、中性、堿性磷酸酶活性均表現(xiàn)為P50處理最高，其次為P20和P80處理，并且以酸性磷酸酶最為敏感。已有研究證明酸性磷酸酶在紅壤中具有較高的活性。另外，酸性磷酸酶活性易受土壤有效磷含量的影響。當(dāng)土壤本底磷含量較低時(shí)，適當(dāng)?shù)牧姿赝度霑?huì)刺激磷酸酶的表達(dá)以滿足微生物的需求，而過高的投入由于緩解了微生物的磷饑餓，磷酸酶的分泌減少。馬殿葉研究表明，當(dāng)磷肥施用量為50kg/hm2時(shí)，磷酸酶活性高于0、25、100、200kg/hm2和400kg/hm2處理。磷酸酶活性的增加可能會(huì)導(dǎo)致有機(jī)磷的礦化，從而提高土壤有效磷含量，有研究表明土壤磷酸酶活性與有效磷含量呈顯著正相關(guān)。然而，本研究中，磷酸酶活性以P50處理最高，而磷的有效性指數(shù)以P80處理最高，磷酸酶活性與有效磷的增量并未表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性，由此可見，磷酸酶活性的改變并不是磷有效性指數(shù)變化的主要因素。施用磷肥之所以提高土壤磷有效性指數(shù)，可能是因?yàn)檩^高磷肥用量降低了土壤的磷素吸附能力。有研究發(fā)現(xiàn)，隨磷肥施用量的增加，土壤中高能吸附點(diǎn)位逐漸飽和，磷的吸附轉(zhuǎn)為低能吸附，因而土壤吸附量降低，而解吸量增加。另外，本研究施用的磷肥為磷酸二氫鉀，可導(dǎo)致土壤pH值的降低，從而促進(jìn)無機(jī)磷的溶解，最終影響土壤有效磷含量。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，施用適量磷素（50mg/kg）增加了土壤磷酸酶活性，可能促成了該處理下土壤磷有效性指數(shù)的增加，而高磷施用量處理下（80mg/kg），除外源施用的磷素外，磷吸附量的降低和無機(jī)磷溶解量的增加也可能促進(jìn)了有效磷含量的增加。

磷肥不同施用量處理下，磷酸酶活性的改變依賴于土壤解磷微生物對施肥的響應(yīng)。就多樣性而言，隨著磷肥施用量的增加，含phoD基因解磷菌的Ace、Chaol和Shannon指數(shù)顯著降低，而Simpson則有所增加，表明磷肥施用導(dǎo)致土壤解磷菌的物種豐富度和多樣性降低。施肥對土壤微生物多樣性的影響已有很多研究。一般認(rèn)為，適量施肥，尤其是無機(jī)肥和有機(jī)肥配合施用，可為土壤微生物提供較多的能源和較全面的養(yǎng)分，促進(jìn)多種類群微生物的大量繁殖，從而提高土壤微生物的多樣性。而施肥不均衡則可能對微生物群落的多樣性產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)。本研究僅施用了磷酸二氫鉀，未提供碳氮元素，無法為微生物提供均衡的營養(yǎng)和能源，可能會(huì)導(dǎo)致對磷鉀素競爭力高的微生物類群大量繁殖，爭奪大量的能源和營養(yǎng)，而其他微生物相對減少，從而降低物種豐富度和多樣性。本研究中P50和P80處理下，OTU1036和OTU975的相對豐度顯著增加，根據(jù)序列比對，二者可能從屬于假單胞桿菌。而以往的研究發(fā)現(xiàn)假單胞桿菌對磷素具有較強(qiáng)的競爭力。一般認(rèn)為，微生物多樣性的降低會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷生態(tài)系統(tǒng)功能。本研究中，當(dāng)磷素施用量為50、80mg/kg時(shí)，有效磷的相對增量更大。這可能是因?yàn)楫?dāng)多樣性降低導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)功能受損時(shí)，微生物通過增加數(shù)量、改變組成或互作關(guān)系等進(jìn)行功能補(bǔ)償。

磷肥不同施用量處理下，土壤解磷菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著。P50處理下，OTU769的相對豐度大幅增加，達(dá)到近30%，此時(shí)磷酸酶活性也最大，因此推測該類群可能是分泌磷酸酶的主要類群，但是并未在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對到相似序列。P80處理下，OTU1306和OTU975相對豐度顯著增加，達(dá)36.7%，根據(jù)序列比對，二者可能從屬于假單胞菌。假單胞菌是紅壤中常見的一種強(qiáng)解磷細(xì)菌，且對磷肥施用敏感，其解磷機(jī)制主要是通過分泌有機(jī)酸溶解固定態(tài)無機(jī)磷。由此推測，施用磷肥可能促進(jìn)了土壤中磷的活化，但不同用量處理下，解磷菌釋放有效磷的方式可能不同，磷素用量為50mg/kg時(shí)，解磷菌主要分泌磷酸酶礦化有機(jī)磷，而磷素用量為80mg/kg時(shí)，解磷菌可能更多地通過分泌有機(jī)酸實(shí)現(xiàn)對無機(jī)磷的溶解。李春越等的研究也證明，無機(jī)解磷菌更偏好高磷環(huán)境，而有機(jī)解磷菌更偏好相對較低的磷素環(huán)境。

本研究采用差減法計(jì)算磷肥施用條件下有效磷活化量，具有一定的不準(zhǔn)確性，未來將采用同位素標(biāo)記準(zhǔn)確定量磷活化量。另外，本試驗(yàn)僅研究了磷肥施用條件下解磷菌和磷酸酶活性的變化，尚不足以闡明磷活化機(jī)制，未來的研究中將進(jìn)一步關(guān)注有機(jī)酸組分及其含量的變化，溶無機(jī)磷和解有機(jī)磷微生物的分布特征，并從mRNA的角度探索解磷菌的變化特征，以全面分析磷肥施用對土壤磷轉(zhuǎn)化過程的影響，揭示土壤有效磷激發(fā)的機(jī)制。

4結(jié)論

磷肥施用量影響土壤供磷效率，在20～80mg/kg的磷素用量范圍內(nèi)，土壤磷有效性指數(shù)逐漸增加。施用磷肥降低了土壤解磷菌的多樣性，同時(shí)改變了解磷菌的組成。磷肥不同用量條件下，有效磷增加的途徑可能不同，50mg/kg磷素用量條件下，土壤磷酸酶活性最高，同時(shí)，含phoD基因解磷菌中OTU769（種屬信息未知）相對豐度最高，推測該物種可能具有分泌磷酸酶的能力，為促進(jìn)土壤本底有機(jī)磷礦化的主要物種；80mg/kg磷素處理下，土壤磷酸酶活性較低，而假單胞屬的相對豐度大幅增加，推測假單胞菌可能是通過分泌有機(jī)酸溶解無機(jī)磷，從而增加有效磷含量。