馬鈴薯野生近緣種抗PVY種質(zhì)資源分子標(biāo)記輔助篩選

于韶瑋 張劍峰 楊元軍 遲勝起

關(guān)鍵詞：馬鈴薯野生近緣種；馬鈴薯Y病毒；病毒抗性；分子標(biāo)記輔助選擇

馬鈴薯是茄科一年生草本雙子葉植物，起源于南美洲安第斯山脈、加勒比地區(qū)及北美洲南部的墨西哥]，是重要的糧菜兼用作物。生產(chǎn)中馬鈴薯以無性繁殖為主，易造成種薯病毒積累而導(dǎo)致種性退化，而且當(dāng)季病毒侵染亦可造成產(chǎn)量損失和品質(zhì)變劣。研究表明病毒病可引起馬鈴薯減產(chǎn)30%～60%，復(fù)合侵染可減產(chǎn)80%。馬鈴薯易感多種病毒，其中馬鈴薯Y病毒（potato vi-rus Y，PVY）導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失最大且毒株繁雜多變，自1931年首次報(bào)道至今，已有PVY0、PVYC、PVYN、PVYNTN、PVYNN、PVYN：0等多種變異或重組株系。莖尖脫毒可有效緩解病毒導(dǎo)致的馬鈴薯種性退化問題，但脫毒種薯培育程序繁瑣，成本居高不下，而且若病毒檢測(cè)不到位，則難以保證質(zhì)量，還易被再次侵染。選育和種植抗病毒品種是防治馬鈴薯病毒病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。

馬鈴薯四倍體（2n= 4x=48）普通栽培種（So-lanum tuberosum L．）中PVY抗源相對(duì)匱乏，但其野生近緣種中含有多種來源的PVY抗性基因Ry，如果將Ry基因轉(zhuǎn)入普通栽培種中，則可以有效提高栽培種的PVY抗性。目前已經(jīng)報(bào)道的Ry基因主要有Ry dg、Ry和Ry其中，Ry來源于馬鈴薯栽培種安第斯亞種（S．tuberosumssp. andigena），與之連鎖的分子標(biāo)記為RY-SC3源自葡枝薯（S．stoloniferumSchlechtdal），與之連鎖的分子標(biāo)記為YES3-3A；Ry源自恰柯薯（S．chacoense Bitter），與之連鎖的分子標(biāo)記為Ry364。為有效利用PVY抗源，本研究應(yīng)用上述3個(gè)Ry基因的分子標(biāo)記對(duì)56份馬鈴薯野生近緣種進(jìn)行篩選，獲得了含有PVY抗性分子標(biāo)記的種質(zhì)資源，可用于抗PVY馬鈴薯品種的選育。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試植物材料為56份馬鈴薯野生近緣種的試管苗。這56份近緣種來自14個(gè)種，其中二倍體（2n=2x=24）種質(zhì)資源23份，四倍體（2n=4x=48）種質(zhì)資源14份，六倍體（2n=6x=72）種質(zhì)資源15份，未確定倍性的種質(zhì)資源4份（表1）。這些種質(zhì)資源主要來自南美洲安第斯山區(qū)及墨西哥等馬鈴薯起源地，少數(shù)來自荷蘭、美國、俄羅斯，以及山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所利用野生種創(chuàng)制的新種質(zhì)材料。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1試管苗擴(kuò)繁與保存 將帶有一個(gè)腋芽的馬鈴薯野生近緣種試管苗莖段接種至含有MS培養(yǎng)基的試管中，于培養(yǎng)室中2000lx、22～25℃、光／暗周期為14h/10h條件下培養(yǎng)。

1.2.2DNA提取與檢測(cè)參考Edwards等的方法，稍加改動(dòng)。用鑷子取0.1g馬鈴薯試管苗莖葉至1.5mL無菌Eppendorf離心管中，加入400uL提取液（200mmol/L、pH 7.5的Tris-HCl，250mmol/LNaCl， 25mmol/L EDTA， 0.5%SDS），用研棒充分研磨至糊狀，漩渦振蕩5s，室溫靜置1～2h；Eppendorf Centrifuge 5810R‘離心機(jī)13000×g離心1min;取300uL上清至新的無菌離心管中，加入300uL異丙醇，室溫靜置2min；13000xg離心5min，棄上清，將沉淀室溫干燥后溶解在100uL1xTE溶液中，-20℃冰箱保存。提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳、BIO-RAD Gel Doc EZ Im-ager凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)質(zhì)量。

1.2.3分子標(biāo)記輔助篩選抗PVY種質(zhì)資源選擇3個(gè)不同來源的PVY抗性基因Ry和Ry及其分子標(biāo)記（RYSC3、YES3-3A和Ry364）進(jìn)行抗性種質(zhì)資源篩選（表2）。PCR反應(yīng)體系按照EasyTaq

DNA Polymerase for PAGE試齊0盒操作指南進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1攜帶Ry基因分子標(biāo)記RYSC3的種質(zhì)資源篩選

對(duì)56份材料進(jìn)行PCR篩選，結(jié)果（表3、圖1）表明，含有Ry抗性基因連鎖標(biāo)記RYSC3的材料有13份，占比23.21%，包括二倍體材料3份，四倍體材料6份，六倍體材料4份。其中來自玻利維亞的二倍體腺毛薯（S．berthaultii Hawkes）莖葉生有毛狀腺體，對(duì)蚜蟲等介體傳播馬鈴薯病毒兼具物理抵御作用。

2.2攜帶基因分子標(biāo)記YES3-3A的種質(zhì)資源篩選

含有抗性基因分子標(biāo)記YES3-3A的材料有4份，占比7.14%（表3）。其中，二倍體材料1份，為球栗薯（S．bulbocastanum Dunal）；四倍體材料2份，分別為葡枝薯和無莖薯（S．a(chǎn)caule Bit-ter）；染色體倍性末確定材料1份，為葡枝薯。

2.3攜帶Ry基因分子標(biāo)記Ry364的種質(zhì)資源篩選

含有Ry抗性基因連鎖標(biāo)記Ry364的種質(zhì)資源23份，占比41.07%，包括二倍體材料6份，四倍體材料4份，六倍體材料12份，染色體倍性未知材料1份（表3、圖2）。其中，二倍體S．com-mersonii Dunal、四倍體S．a(chǎn)caule Bitter、六倍體S．a(chǎn)lbicans Ochoa的一些種質(zhì)資源攜帶抗寒基因，六倍體S．demissum Lindley的一些種質(zhì)資源含有晚疫病抗性基因，為選育同時(shí)具有PVY抗性和這些優(yōu)良性狀的優(yōu)良品種提供了種質(zhì)材料。

綜合來看，含有RYSC3、YES3-3A、Ry364中兩種及以上標(biāo)記的材料共有7份，占比12.5%，其中，二倍體材料2份，四倍體材料1份，六倍體材料4份，且僅四倍體材料OCH 14180a（S．stolo-niferum Schlechtdal）含有3種標(biāo)記（表3）。

3討論與結(jié)論

生產(chǎn)中馬鈴薯以無性繁殖為主，多季種植造成塊莖中病毒大量累積，導(dǎo)致馬鈴薯種性退化、脫毒種薯不合格。莖尖脫毒技術(shù)可有效降低病毒病的危害，但近年來利用該技術(shù)生產(chǎn)的脫毒種薯的繁殖代數(shù)越來越少，已由原來的5～6代縮短至1～2代，造成這一現(xiàn)狀的主要原因就是病毒再侵染造成的種薯退化。鑒于此，選育和栽培抗病毒品種是馬鈴薯抗病毒病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。目前馬鈴薯抗病毒育種的首要目標(biāo)是抗PVY，野生資源中含有豐富的抗性基因，利用分子標(biāo)記從野生近緣種中篩選出抗PVY的種質(zhì)資源，可以拓寬馬鈴薯的遺傳背景，為抗性育種提供適宜的抗源，提高抗病毒育種的精準(zhǔn)度。

馬鈴薯染色體倍性復(fù)雜，目前全球除起源地外，生產(chǎn)上種植的主要為四倍體，但種質(zhì)資源中從單倍體（monoploid）到七倍體（hepta-ploid）均有存在，常見的有二倍體、四倍體和六倍體。高倍性的四倍體、六倍體種質(zhì)資源基因組高度雜合，在有性雜交過程中不良基因難以去除。二倍體的遺傳背景則相對(duì)簡(jiǎn)單，如果能克服自交不親和引起的衰退問題，就可以同其他二倍體茄科作物一樣，利用二倍體馬鈴薯通過多代自交剔除有害基因獲得優(yōu)良自交系，進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)育種，然后用二倍體實(shí)生種子有性繁殖代替四倍體塊莖無性繁殖，節(jié)約種薯儲(chǔ)藏和運(yùn)輸成本，避免種薯攜帶病毒：也可通過2n配子將優(yōu)良基因滲入到四倍體栽培種中，在四倍體水平育種：還可以將四倍體降為二倍體，或者誘導(dǎo)二倍體獲得單倍體，再加倍獲得純合二倍體，從而在二倍體水平上進(jìn)行優(yōu)良性狀聚合育種，也可作為轉(zhuǎn)基因或基因編輯受體材料，用于基因功能鑒定及種質(zhì)創(chuàng)新。本試驗(yàn)引進(jìn)的野生近緣種主要來自南美安第斯山區(qū)，其中部分二倍體經(jīng)過起源地多年的自然選擇，實(shí)生苗未觀察到明顯的表型分離，顯示這些種質(zhì)資源可以自交結(jié)籽且遺傳背景純合度大為提高，在純合二倍體稀缺的情況下，這些二倍體種質(zhì)資源為進(jìn)一步人工自交提高純合度提供了便利。

本試驗(yàn)利用PVY抗性分子標(biāo)記RYSC3（連鎖Ry）、YES3-3A（連鎖Ry）和Ry364（連鎖Ry），對(duì)56份馬鈴薯野生近緣種進(jìn)行篩選，從中選出含有標(biāo)記RYSC3的種質(zhì)資源13份，含有標(biāo)記YES3-3A的種質(zhì)資源4份，含有標(biāo)記Ry364的種質(zhì)資源23份，包括物理防御蚜蟲傳播病毒的二倍體腺毛薯（S. berthaultii Hawkes）、耐霜凍的二倍體S．commersonii Dunal以及攜帶晚疫病抗性基因的六倍體S．demissum Lindley；其中，有7份種質(zhì)材料含有2種標(biāo)記，有1份種質(zhì)材料即四倍體葡枝薯OCH 14180a含有3種標(biāo)記。這些種質(zhì)資源可用于馬鈴薯抗PVY育種及抗性基因挖掘。

篩選出攜帶PVY抗性分子標(biāo)記的種質(zhì)資源，還需對(duì)其后代繼續(xù)進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇及病毒抗性鑒定。通過雜交獲得實(shí)生籽家系，在鑒定單株P(guān)VY抗性過程中，除檢測(cè)分子標(biāo)記外，還需結(jié)合接種病毒對(duì)單株病毒抗性進(jìn)一步篩選。在抗PVY后代中，有些單株可以檢測(cè)到分子標(biāo)記，但田間仍然表現(xiàn)PVY感染的癥狀，推測(cè)可能是染色體片段發(fā)生了交換，致使原來連鎖的標(biāo)記和抗性基因發(fā)生了分離。另外，可能存在分子標(biāo)記無法檢測(cè)到的新PVY抗源。本試驗(yàn)選用的種質(zhì)資源中有些檢測(cè)不到RYSC3、YES3-3A和Ry364分子標(biāo)記，但植株在接種病毒或田間開放條件下仍然表現(xiàn)出抗PVY的特性，需要進(jìn)一步深入分析其原因，明確是因?yàn)閿y帶新的PVY抗性基因，還是累積了病毒但未表現(xiàn)出典型的PVY感病癥狀，如果是后者則需剔除，避免成為傳播PVY的毒源。