小麥miRNA靶基因的體外實驗驗證

房春豪 陳志浩 王開 汪曉璐 徐文競 祁廣 馬朋濤 韓冉 劉成

關(guān)鍵詞：小麥miRNA;靶基因；Tae-miR9666a; GFP；本氏煙草

miRNA是一類內(nèi)源非編碼單鏈小RNA，廣泛存在于動植物體內(nèi)，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平實現(xiàn)對特定基因表達的調(diào)控，從而參與細胞分化、生長和發(fā)育等多種生物學調(diào)控。在植物中，miRNA在RNA聚合酶Ⅱ作用下轉(zhuǎn)錄形成較長的pri-miRNA，隨后在結(jié)合蛋白DAWDLE（DDL）、鋅指蛋白（SE）等作用下，形成雙鏈miRNA（ miRNA：miRNA*）；雙鏈miRNA在miRNA甲基轉(zhuǎn)移酶HENI的作用下進行甲基化修飾，并被轉(zhuǎn)運蛋白HASTY運送到細胞質(zhì)中：成熟的miRNA通過與Argonaute（AGO）蛋白結(jié)合形成RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）來發(fā)揮作用。miRBase數(shù)據(jù)庫（Release 22.1，March2018，http：//www.mirbase.org）中登記注冊的重要作物miRNA共計2863條，其中小麥成熟的miR-NA共有125條，由122個前體編碼。

miRNA控制靶基因的方式主要是通過切割靶基因或者是抑制靶基因表達。miRNA切割目標基因是使與其互補配對區(qū)域的某兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵發(fā)生斷裂，而磷酸二酯鍵的斷裂主要由具有核酸內(nèi)切酶活性的AG01蛋白介導。識別miRNA的靶基因并判斷兩者之間相互作用的機制，有利于分析研究miRNA及其靶基因的功能。

前期我們通過sRNA測序篩選到一條新miR-NA，將其命名為Tae-miR9666a。保守性分析發(fā)現(xiàn)該miRNA為小麥所特有的，僅在小麥籽粒中表達，且表達量隨籽粒發(fā)育逐漸升高。本研究團隊利用大麥條斑花葉病毒對Tae-miR9666a的功能進行研究，發(fā)現(xiàn)過表達此miRNA可使小麥籽粒大小發(fā)生變化。生物信息預測及降解組測序發(fā)現(xiàn)Tae-miR9666a的靶基因為Rpbl，該基因編碼RNA聚合酶Ⅱ的大亞基。

本研究利用體外實驗，通過合成Tae-miR9666a前體及前體突變體，構(gòu)建含有GFP標記的Rpbl過表達載體，并共轉(zhuǎn)化煙草，通過觀察GFP的熒光亮度來判斷靶基因的切割情況，以驗證Tae-miR9666a與靶基因Rpbl的相互作用。

1材料與方法

1.1實驗材料

小麥品種中國春（Chinese Spring，CS），表達載體pBI221-GFP、pAMBI1300，均由山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所小麥細胞遺傳學實驗室保存。

1.2實驗方法

1.2.1Tae-miR9666a靶基因切割位點的預測利用在線軟件psRNA Target（http：//plantgrn. no-ble.org/psRNATarget/）對Tae-miR9666a的革巴基因切割位點進行預測。

1.2.2pre-miR9666和pre-TmiR9666的合成miR9666的前體序列pre-miR9666及其改造后的pre-TmiR9666序列見圖1，其中紅色畫線部分堿基為替換堿基，以使其形成的miRNA無法切割靶基因。這兩條序列由北京擎科生物科技股份有限公司青島分公司合成到pAMBI1300載體上，得到pAMBI1300-miR9666；陽pAMBI1300-TmiR9666.

1.2.3DNA提取及基因克隆利用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取中國春小麥基因組DNA，提取方法參照文獻。利用小麥基因組網(wǎng)站（ht-tps：//www. wheatgenome. org/Tools-and-Resources/Wheat-Transcript-Resources）對前期預測到的Tae-miR9666a的靶基因Rpbl的部分序列進行克隆，方法參照文獻，引物序列見表1，將鑒定為陽性的單克隆送至北京擎科生物科技股份有限公司青島分公司進行測序。將測序正確的陽性菌株進行質(zhì)粒提取，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4過表達載體的構(gòu)建以提取的質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，然后參考文獻中的方法進行過表達載體構(gòu)建，所需引物見表1。經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性的單克隆菌液送至北京擎科生物科技股份有限公司青島分公司檢測，得到測序正確的表達載體pBI221-GFP-Rpbl。

1.2.5煙草瞬時轉(zhuǎn)化在培養(yǎng)箱中種植小葉煙草（Nicotiana benthamiana，俗稱本氏煙草），營養(yǎng)土盆栽；在光周期為16 h光照/8 h黑暗、溫度23～26℃條件下培養(yǎng)約一個半月，選取濃綠、厚實的葉片用于瞬時表達實驗。將pAMBI1300-miR9666、pAMBI1300-TmiR9666、pBI221-GFP-Rpbl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中，在雙抗板上生長3天后，使用一次性注射器把不同農(nóng)桿菌菌液注射至小葉煙草葉肉內(nèi)進行瞬時轉(zhuǎn)化，具體方法參考文獻；將轉(zhuǎn)化后的煙苗繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天，然后撕下注射部位的表皮，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2結(jié)果與分析

2.1Tae-miR9666a的靶基因切割位點預測結(jié)果

預測發(fā)現(xiàn)Tae-miR9666a的靶基因為TraesCS7D02G297100，切割位點共有11個（表2）。通過小麥基因組網(wǎng)站（http：//wheatomics.sdau.edu.cn）對靶基因進行分析發(fā)現(xiàn)，TraesCS7D02G297100的基因組序列長度為8772bp，編碼RNA聚合酶Ⅱ的大亞基Rpbl，共1860個aao Tae-miR9666a的切割位點位于Rpbl蛋白的C-端。

2.2Rpbl基因部分序列的克隆

為了保證擴增的靶基因部分序列連接到表達載體上能正常翻譯且不移碼，我們將引物設計在含有ATG的位置，然后利用中國春基因組進行PCR擴增，擴增片段大小為1655bp（圖2A）；之后將擴增片段連接到克隆載體上，轉(zhuǎn)化后菌落PCR鑒定結(jié)果如圖2B所示。將陽性菌落進行測序發(fā)現(xiàn)，所獲得的序列與TraesCS7D02G297100的部分序列完全一致，包含了Tae-miR9666a的所有結(jié)合位點（圖3）。

2.3Rpbl基因部分序列的表達載體pBI221-GFP-Rpbl的構(gòu)建

將含有Rpbl基因片段的質(zhì)粒擴增后，利用重組酶連接到表達載體pBI221-GFP（圖4），獲得pBI221-GFP-Rpbl。為了檢測連接產(chǎn)物的準確性，利用連接產(chǎn)物兩側(cè)的兩個酶（BamHI和SalI）對pBI221-GFP-Rpbl進行雙酶切，分別在4500bp和2000bp處出現(xiàn)兩條帶，與pBI221-GFP的大?。?530bp）和Rpbl基因片段的大?。?655bp）-致，表明pBI221-GFP-Rpbl載體構(gòu)建成功。

2.4轉(zhuǎn)化煙草及熒光鑒定結(jié)果

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒以不同方式進行組合，即pBI221-GFP-Rpb1（記為Rpbl）與pAMBI1300-miR9666等量混合（記為Rpbl+miR9666）以及pBI221-GFP-Rpbl與pAMBI1300-TmiR9666等量混合（記為RpbI+TmiR9666）。以主葉脈為分界線將煙草葉片分為兩部分，在第一片葉的兩部分分別注射Rpbl+miR9666和Rpb1，在第二片葉的兩部分分別注射RpbI+TmiR9666和Rpb1（圖5）。兩天后在激光共聚焦顯微鏡下觀察煙草轉(zhuǎn)化結(jié)果（圖6），可見Rpbl+miR9666組合的熒光強度低，幾乎無法檢測到熒光信號；Rpbl+TmiR9666組合與Rpbl的熒光強度較高，且兩者相近，表明miRNA前體的突變體未切割靶基因，導致GFP正常表達。

3討論與結(jié)論

miRNA在植物的生長發(fā)育和逆境脅迫應答等生物學過程和農(nóng)藝性狀控制上起著重要作用。高通量測序技術(shù)的發(fā)展使miRNA的數(shù)目飛速增長，但是已知功能的miRNA數(shù)目卻較少。小麥中已報道的miRNA為125條，但對其功能進行詳細研究的卻只有幾條，如：miR156影響小麥的分蘗和小穗發(fā)育：Tae-miR408通過調(diào)控靶基因TaTOC來控制小麥的抽穗期：miR172可導致小麥穗的形態(tài)發(fā)生變化，其表達量降低導致小穗密集，而表達量升高則導致麥穗伸長，小穗之間的距離加大：過表達Tae-miR444a可提高植物的生物量、N含量、光合效率及抗氧化酶活性。因此，還需加強對眾多miRNA功能的研究。

miRNA行使功能主要是通過切割靶基因或抑制靶基因表達進行。miRNA靶基因的識別主要是通過計算機軟件預測，目前預測miRNA靶基因的軟件主要有TargetFinder、PatScan、miRU、psRNATarget、miRGator等。這些預測軟件的算法主要依賴于miRNA與靶基因的互補潛力進行預測，并強調(diào)種子序列的重要性。但由于預測過程中允許一定程度的錯配、跳躍等情況，往往會導致許多錯誤的預測結(jié)果，因此在實際研究中，需要對預測結(jié)果進行進一步分析和驗證。目前應用最廣泛的miRNA靶基因的驗證方法包括RNA連接酶介導的cDNA末端擴增技術(shù)、RISC免疫共沉淀技術(shù)和降解組測序技術(shù)，但這些方法的實驗操作繁瑣，結(jié)果也不直觀，缺少一種快速簡便驗證miRNA靶基因的方法。

報告基因檢測系統(tǒng)是新興的驗證miRNA與靶基因互作的研究手段。當miRNA與靶基因上的作用位點結(jié)合后，能有效抑制其翻譯過程：然后將包含潛在結(jié)合位點的一部分或全部序列連接至報告基因CDS（coding sequences）的下游，并將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒導人細胞內(nèi)進行表達：同時將miRNA的模擬物或表達載體共同轉(zhuǎn)染至細胞中，經(jīng)過一段時間后檢測熒光強度或者熒光素酶的活性來判斷miRNA與靶基因的互相作用。目前該方法在動物和昆蟲相關(guān)研究中已經(jīng)開展實施，但在小麥miRNA靶基因的研究中還未見有報道。本研究通過合成小麥miRNA前體pre-miR9666及前體突變體pre-TmiR9666，連接到表達載體pAMBI1300上，并構(gòu)建含有報告基因GFP標記的靶基因過表達載體pBI221-GFP-Rpbl，將兩種載體共轉(zhuǎn)化至本氏煙草葉片中，通過觀察GFP的熒光強度來判斷靶基因的切割情況，從而驗證miRNA與靶基因的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)miRNA前體的煙草葉片的熒光強度較低，表明靶基因被miRNA切割，其后的GFP無法進行較好的表達：共轉(zhuǎn)miRNA前體突變體的煙草葉片與單轉(zhuǎn)靶基因的葉片熒光亮度相當，表明miRNA前體的突變體未切割靶基因，導致GFP正常表達。本實驗有效證明了miRNA的靶基因切割情況，表明利用煙草驗證miRNA與靶基因互作是可行的。該方法可為小麥miRNA功能研究提供技術(shù)支持。