高效液相色譜法測定當(dāng)藥中龍膽苦苷含量

段吉平，馮 麗，張立濤

（河北省食品藥品檢驗(yàn)院，河北 石家莊 050011）

當(dāng)藥，又名紫花當(dāng)藥，為河北、內(nèi)蒙古一帶的民間草藥，中醫(yī)臨床用量較少，中藥生產(chǎn)企業(yè)主要用于當(dāng)藥片和當(dāng)飛利肝寧膠囊的生產(chǎn)。其在歷代本草中未見收載，在《內(nèi)蒙古中草藥》[1]中有收載，生于海拔500～1 600 m的山坡、林下或灌叢中，為龍膽科植物瘤毛獐牙菜 Swertia pseudochinensis Hara的干燥全草，具有清濕熱、健胃功能，用于濕熱黃疸、脅痛、痢疾腹痛、食欲不振，其有效成分為龍膽苦苷[2]?，F(xiàn)采用高效液相色譜法，對龍膽苦苷的含量測定方法進(jìn)行了研究，為更好地控制當(dāng)藥的質(zhì)量提供了可靠的方法。

1 儀器與試藥

Mettler AE 163型 Mettler AE 240型電子天平（瑞士）；Shimadzu UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì)（日本）；Waters 2695-2996型高效液相色譜儀（美國）。龍膽苦苷對照品（供含量測定用，批號為110770-200510，中國藥品生物制品檢定所）；試劑為甲醇（色譜純）；水為去離子水；當(dāng)藥（收集于安國藥市，由河北省藥品檢驗(yàn)所主任藥師牛小蓮鑒定，編號與產(chǎn)地，1號、2號、3號均為河北，4號、5號、6號均為內(nèi)蒙。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Capcell pak C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 - 水（20 ∶80）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：274 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。高效液相色譜圖見圖 1。

2.2 溶液制備

取龍膽苦苷對照品0.010 12 g，置25 mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品濃溶液。精密量取對照品濃溶液5.00 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。取當(dāng)藥藥材粉碎過3號篩，混勻，稱取粉末2 g，精密稱定，置 100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇 50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率 250 W，頻率 40 kHz）20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密量取龍膽苦苷對照品濃溶液（質(zhì)量濃度為 0.404 8 mg／mL）5 mL，置 100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得龍膽苦苷對照品稀溶液。取對照品稀溶液2，10 μL和龍膽苦苷對照品濃溶液5，10，15 μL，分別注入液相色譜儀，按擬訂的色譜條件測定，以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)、龍膽苦苷對照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=1 264 734 X+20 446.7， r=0.999 9(n=5)，結(jié)果表明，龍膽苦苷進(jìn)樣量在0.040 48～6.072 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定龍膽苦苷峰面積。結(jié)果的 RSD為0.78%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取龍膽苦苷對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀11次，前 6次間隔 1.5 h，后 5次間隔 3 h；取供試品溶液 10 μL，注入液相色譜儀9次，前5次間隔1.5 h，后4次間隔5 h，記錄龍膽苦苷峰面積積分值。結(jié)果對照品溶液的 RSD為0.92%，供試品溶液的 RSD為0.84%，表明對照品及供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（1 號）粉末 1.6，2.0，2.4 g 各 3份，精密稱定，按2.2項(xiàng)下的方法制成供試品溶液，按擬訂方法測定，樣品的平均含量為 1.549 mg／g，RSD 為 1.1% （n=9），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)[3]：精密稱取已知含量的樣品（1號，含量為1.549 mg／g）適量，共 6份，分別加入高、中、低質(zhì)量濃度的龍膽苦苷對照品溶液，按供試品溶液的制備與測定方法測定龍膽苦苷含量，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 龍膽苦苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.4 樣品含量測定

取5批當(dāng)藥，按前述2.2項(xiàng)下方法操作，制成供試品溶液，按上述檢測方法測定，計(jì)算樣品含量。結(jié)果批號分別為071203，060401，080103，080102，071204，080101 的樣品中龍膽苦苷含量分別為 0.15% ，0.27% ，0.19% ，0.18% ，0.16% ，0.17% 。

3 討論

本試驗(yàn)還采用3個(gè)廠家的色譜柱，色譜柱型號分別為：島津Shimadzu Vpodssygg（150 L ×6.0 mm），戴安Dionex Acclaim 120 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、菲羅門Phenomenex C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），考察對分離及測定的影響，結(jié)果 3 種C18色譜柱柱效、分離度均符合要求，并且含量無明顯區(qū)別，故認(rèn)為本法對C18色譜柱品牌無特定要求。

龍膽苦苷具有鎮(zhèn)痛、抗炎的作用[2]，為當(dāng)藥的有效成分，用高效液相色譜法測定當(dāng)藥中龍膽苦苷尚未見報(bào)道。本研究建立的HPLC檢測方法精密度、重現(xiàn)性好，雜質(zhì)干擾少，龍膽苦苷的峰純度、峰形、分離度均比較理想，樣品穩(wěn)定性和回收率均較高，是一種理想的測定方法。

[1]內(nèi)蒙古自治區(qū)革命委員會(huì)衛(wèi)生局.內(nèi)蒙古中草藥[M].呼和浩特：內(nèi)蒙古自治區(qū)人民出版社，1972：206－207.

[2]陳 雷，王海波，孫曉麗，等.龍膽苦苷鎮(zhèn)痛抗炎藥理作用研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008（5）：903 － 906.

[3]徐艷紅，陸 君，郭漢文，等.高效液相色譜法測定結(jié)腸消炎丸中蘆丁含量[J].中國藥業(yè)，2011，20（19）：34 － 35.