3-甲基腺嘌呤對轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)大鼠肝臟星形細胞株HSC-T6活化及自噬的影響觀察

惠瑜，安紅梅，竇嵐，曹可

新疆第二醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，新疆 克拉瑪依 834000

肝纖維化是一種傷口愈合反應(yīng)，是由于持續(xù)的肝損傷和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix， ECM）不斷積累［1］，可干擾正常肝功能，最終發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。在反復(fù)的肝損傷過程中，肝臟星狀細胞（Hepatic Stellate Cell， HSC）被激活，促進了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展［2］。因此，預(yù)防HSC活化被認為是抗纖維化治療的關(guān)鍵策略［3］。近期的研究［4］表明，自噬可促進造血干細胞的激活和肝纖維化的形成。自噬是新發(fā)現(xiàn)的參與HSC活化和肝纖維化進程的一種機制，它通過輸送甘油三酯等組分為HSC的活化提供能量。研究［5］顯示，隨著自噬水平的升高，HSC被激活。3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA）是最常用的自噬抑制劑之一，可通過抑制Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶（PI-3K）來阻斷自噬［6］，但是3-MA在HSC活化中的作用尚未確定。2023年3—8月，我們觀察了3-MA對轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）誘導(dǎo)的大鼠肝臟星形細胞株HSC-T6活化及自噬的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、儀器和試劑 大鼠肝臟星形細胞株HSC-T6細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫，具有短串聯(lián)重復(fù)序列鑒定報告。超凈工作臺購自蘇州智凈凈化公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國賽默飛公司，倒置熒光顯微鏡購自德國徠卡公司，研磨儀購自武漢賽維爾生物科技有限公司，純水儀購自重慶艾科浦公司，冷凍離心機購自中國heal force公司，電泳儀購自北京六一公司，熒光定量PDR儀購自美國賽默飛公司，紫外分光光度計購自上?，F(xiàn)科儀器有限公司，逆轉(zhuǎn)錄儀購自美國賽洛捷克公司，脫色搖床、電泳儀購自北京六一儀器廠，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自中國賽默飛世爾科技有限公司，TRIzol購自中國索萊寶科技有限公司，氯仿、異丙醇、無水乙醇購自國藥集團藥業(yè)股份有限公司，RIPA裂解液、磷酸化蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，LC3、Beclin-1、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、TGF-β1、Atg-5抗體購自美國Jackson公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 將凍存的HSC-T6細胞從液氮罐中取出后，移至37 ℃水浴鍋中，使細胞在1 min內(nèi)迅速融化。待凍存液完全融化后，將細胞懸液吸至離心管中，加入2 mL完全培養(yǎng)基，400 g離心5 min，棄上清，細胞重新懸浮于1 mL培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入4 mL完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細胞隔兩天換一次液，待細胞生長融合度達到80%左右，使用1 mL 0.25%胰酶消化收集細胞，按照1∶2進行傳代培養(yǎng)，收集生長狀況良好且處于對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 細胞分組及3-MA給予 取生長狀況良好且處于對數(shù)生長期的HSC-T6細胞分為空白組、TGF-β+PBS組、TGF-β+3-MA組。TGF-β+3-MA組細胞加入濃度為2 ng/mL TGF-β培養(yǎng)72 h后加入3-MA（0.5 mg/mL）處理24 h，TGF-β+PBS組細胞加入濃度為2 ng/mL TGF-β培養(yǎng)72 h后加入等量PBS處理24 h，空白組加入等量PBS處理。

1.4 各組細胞活化標(biāo)志物α-SMA、TGF-β檢測

1.4.1 各組細胞活化標(biāo)志物α-SMA、TGF-β mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法。取各組細胞，TRIzol法提取總RNA，經(jīng)純度及完整性鑒定后反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR檢測，引物序列如下：α-SMA上游引物5′-GGATCAGCGCCTTCAGTTCT-3′，下游引物5′-AGGGCTAGAAGGGTAGCACA-3′；TGF-β上游引物為5′-AGTGCTGAGGAGAAACCGTG-3′，下游引物5′-TTTGTGCATCGGCTGAAAGC-3′；內(nèi)參基因GAPDH上游引物5′-ACTCTACCCACGGCAAGTTC-3′，下游引物5′-TGGGTTTCCCGTTGATGACC-3′。建立20 μL PCR擴增體系：qPCR SuperMix 10 μL，α-SMA或TGF-β上下引物各2 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。擴增條件：94 ℃、2 min，94 ℃、5 s，60 ℃、30 s 45個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示細胞中受檢基因mRNA的相對表達量。

1.4.2 各組細胞活化標(biāo)志物α-SMA、TGF-β蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組細胞，RIPA細胞裂解液提取各組細胞總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度；取相同質(zhì)量的蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏乙烯（PVDF）膜；將轉(zhuǎn)好的膜于室溫下脫色搖床上用5%的脫脂牛奶封閉1 h。α-SMA（1∶2000稀釋）、TGF-β（1∶2000稀釋）、GAPDH（1∶5000稀釋），一抗按照相應(yīng)稀釋比例溶解于5%脫脂牛奶，4 ℃孵育過夜。用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5 min；再用二抗室溫下孵育30 min后，用TBST室溫下脫色搖床洗脫三次，采用ECL化學(xué)發(fā)光法進行曝光顯影。使用Image J v1.80測量條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)部參考蛋白，計算目的蛋白的相對表達量。

1.5 各組細胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3、Beclin-1、Atg5檢測

1.5.1 各組細胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3、Beclin-1、Atg5 mRNA檢測 檢測方法參照“1.4.1”，其中目的基因LC3上游引物5′-TGTTAAGCCCCTACCAAGGC-3′，下游引物5'-CATGGCACTCAGTTTCTGGC-3'；Beclin-1上游引物為5'-CTCGTCAAGGCGTCACTTCT-3'，下游引物5'-CCTCCATTCTTTAGGCCCCG-3′；Atg5上游引物5'-CTCAGCTCTGCCTTGGAACA-3'，下游引物5'-CATCCAGAGCTGCTTGTGGT-3'。

1.5.2 各組細胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3、Beclin-1、Atg5蛋白檢測 檢測方法參照“1.4.2”，其中LC3以1∶2000稀釋、Beclin-1以1∶500稀釋、Atg5以1∶2000稀釋。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件。計量資料呈正態(tài)分布時以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞活化標(biāo)志物α-SMA、TGF-β表達比較

2.1.1 各組細胞活化標(biāo)志物α-SMA、TGF-β mRNA相對表達量比較 空白組、TGF-β+PBS組、TGF-β+3-MA組細胞中α-SMA mRNA相對表達量分別為1.00 ± 0.00、6.37 ± 0.24、3.39 ± 0.09，組間相比，P均＜0.05；空白組、TGF-β+PBS組、TGF-β+3-MA組細胞中TGF-β mRNA相對表達量分別為1.00 ± 0.00、9.24 ± 0.23、4.13 ± 0.08，組間相比，P均＜0.05。

2.1.2 各組細胞活化標(biāo)志物α-SMA、TGF-β蛋白相對表達量比較 空白組、TGF-β+PBS組、TGF-β+3-MA組細胞中α-SMA蛋白相對表達量分別為0.05 ±0.01、0.55 ± 0.19、0.30 ± 0.07，組間相比，P均＜0.05；空白組、TGF-β+PBS組、TGF-β+3-MA組細胞中TGF-β蛋白相對表達量分別為0.03 ± 0.00、0.44 ±0.07、0.27 ± 0.02，組間相比，P均＜0.05。

2.2 各組細胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B、Beclin-1、Atg5表達比較

2.2.1 各組細胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3、Beclin-1、Atg5 mRNA相對表達量比較 空白組、TGF-β+PBS組、TGF-β+3-MA組細胞中LC3 mRNA相對表達量分別為1.00 ± 0.00、5.77 ± 0.15、2.11 ± 0.07，組間相比，P均＜0.05；空白組、TGF-β+PBS組、TGF-β+3-MA組細胞中Beclin-1 mRNA相對表達量分別為1.00 ±0.00、4.45 ± 0.18、1.99 ± 0.08，組間相比，P均＜0.05；空白組、TGF-β+PBS組、TGF-β+3-MA組細胞中Atg5 mRNA相對表達量分別為1.00 ± 0.00、5.77 ±0.90、2.06 ± 0.03，組間相比，P均＜0.05。

2.2.2 各組細胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3、Beclin-1、Atg5蛋白相對表達量比較 空白組、TGF-β+PBS組、TGF-β+3-MA組細胞中LC3蛋白相對表達量分別為0.16 ±0.03、0.99 ± 0.13、0.40 ± 0.08，組間相比，P均＜0.05；空白組、TGF-β+PBS組、TGF-β+3-MA組細胞中Beclin-1蛋白相對表達量分別為0.36 ± 0.08、0.69 ± 0.06、0.33 ± 0.02，組間相比，P均＜0.05；空白組、TGF-β+PBS組、TGF-β+3-MA組細胞中Atg5蛋白相對表達量分別為0.05 ± 0.01、0.55 ± 0.19、0.30 ± 0.07，組間相比，P均＜0.05。

3 討論

肝纖維化是一種傷口愈合反應(yīng)，其特征是ECM的過度沉積和積累，可在多種觸發(fā)因素下發(fā)生，這些觸發(fā)因素可導(dǎo)致不同病因的慢性肝病，如慢性炎癥、病毒性肝炎和代謝性肝?。?］。在纖維化形成過程中，HSC作為多種外界因素入侵的靶細胞，可通過上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)（epithelial mesenchymal transition，EMT）轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞并誘導(dǎo)肝纖維化。α-SMA僅存在于肝臟大血管平滑肌，在HSC向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化時，其會出現(xiàn)在肝臟內(nèi)［8］，故α-SMA被認為是HSC活化的重要標(biāo)志。TGF-β被認為是激活HSC的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［9］。TGF-β可觸發(fā)HSC反式分化，直接誘導(dǎo)應(yīng)激纖維化組織。本研究使用TGF-β誘導(dǎo)HSC-T6細胞株24 h，α-SMA、TGF-β在基因及蛋白表達水平上均顯著升高，由此表明在實驗中成功建立了體外肝星狀細胞活化模型。

肝細胞是肝臟的主要實質(zhì)細胞，對維持肝臟的功能和組織至關(guān)重要，其中HSC在肝纖維化發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用，HSC激活可促進肝纖維化的發(fā)生［10］。因此，抑制HSC活化是治療肝纖維化的潛在靶點。自噬是新發(fā)現(xiàn)的參與HSC活化和肝纖維化進程的一種機制，它通過輸送甘油三酯等組分為HSC的活化提供能量［11］。自噬涉及功能失調(diào)的大分子和受損的細胞器的降解［12］，以支持細胞能量和代謝平衡，促進細胞器的再生［13］。自噬過程受到不同自噬基因自噬相關(guān)基因（autophagy-related gene，ATG）和自噬蛋白的調(diào)控，包括LC3、Beclin-1、mTOR、P62、Atg5、Atg8等，其中Beclin-1可調(diào)節(jié)自噬活性，是參與自噬調(diào)控的重要基因［14］。在細胞內(nèi)存在兩種形式的LC3蛋白：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3蛋白在合成后其C端即被ATG4蛋白酶切割變成LC3-Ⅰ，分布于細胞漿內(nèi)。當(dāng)自噬體形成后，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine， PE）偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜，并穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合。因此，LC3-Ⅱ被用來作為自噬體的標(biāo)記，其表達水平在某種程度上反映了自噬體的數(shù)量［15］。當(dāng)自噬發(fā)生時，自噬體數(shù)量增加，自噬通量上調(diào)。Atg5是一種在自噬過程中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，其可催化形成磷脂酰乙醇胺（PE）連接的LC3（LC3-Ⅱ），并將其正確地結(jié)合到吞噬體膜上，參與自噬體的形成［16］。本研究結(jié)果顯示，TGF-β+PBS組中LC3、Bclin-1、Atg5基因及蛋白表達水平均上調(diào)，提示肝星狀細胞活化過程中存在自噬，且肝星狀細胞活化可通過自噬途徑激活。有研究［17］在使用卡維地洛干預(yù)HSC活化實驗中發(fā)現(xiàn)，卡維地洛可通過抑制自噬通量顯著降低LX-2細胞的活化。

3-MA是PI3K的特異性抑制劑，可通過PI3K/Akt/mTOR途徑抑制細胞自噬，也是目前最常使用的自噬抑制劑。3-MA能抑制LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化從而干擾或阻斷自噬體的形成［18］。本研究采用3-MA作用于HSC-T6細胞后，TGF-β+3-MA組的LC3、Beclin-1、Atg5基因及蛋白水平均低于TGF-β+PBS組，且α-SMA和TGF-β mRNA和蛋白水平也同樣顯著下降。因此，進一步驗證HSC自噬水平在維持其活化狀態(tài)中具有一定的重要性，同時也表明3-MA改善肝纖維化可以通過抑制自噬來抑制肝星狀細胞活化來實現(xiàn)。

綜上所述，體外3-MA干預(yù)能降低自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1、Atg5的表達水平，并下調(diào)HSC活化標(biāo)志蛋白α-SMA表達以及TGF-β的表達水平，這些結(jié)果表明，3-MA可抑制TGF-β誘導(dǎo)的大鼠肝臟星形細胞株HSC-T6活化及自噬，為3-MA作為開發(fā)預(yù)防和治療肝纖維化的藥物提供了一定的理論基礎(chǔ)。