基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及實驗探究益癸方湯防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用及機(jī)制

單珊 王佳晨 陳怡潔 徐哲昀 李伊伊 盛祝梅 黃飛翔 孟麗麗 張治芬

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是以骨量減少和骨微細(xì)結(jié)構(gòu)紊亂為特征的系統(tǒng)代謝性疾病[1]，其對老年婦女和絕經(jīng)后婦女的影響尤為嚴(yán)重，大約一半的女性在絕經(jīng)后至少經(jīng)歷過一次骨質(zhì)疏松性骨折[2]。更年期女性隨著卵巢功能的下降，雌激素產(chǎn)生減少，同時卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）水平增加，導(dǎo)致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）的發(fā)生、發(fā)展[3]。目前PMOP 治療仍以口服藥物為主，但長期藥物治療可能會導(dǎo)致耐藥和不良反應(yīng)。而中草藥療法因不良反應(yīng)小易被患者接受。益癸方湯是臨床經(jīng)驗方，本課題組前期研究結(jié)果表明益癸方湯可改善更年期女性圍絕經(jīng)期癥狀，降低FSH 和LDL 水平，提高雌二醇（estradiol，E2）水平[4]。但該方對于骨量保護(hù)是否有作用尚缺乏相關(guān)研究，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和實驗探究該方防治PMOP 的作用及機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 8 周齡SPF 級雌性SD 大鼠25 只，體質(zhì)量200～250 g，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，動物許可證號：SYXK（浙）2021-0012。大鼠飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，室溫22～26 ℃，相對濕度50%～60%，自由進(jìn)食水，12 h 間隔照明。本研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物管理與倫理委員會審查通過（批準(zhǔn)文號：IACUC-20221121-15）。

1.2 藥品、試劑和儀器 益癸方湯組方為枸杞、旱蓮草各10 g，紅景天6 g，阿膠9 g，黃精、當(dāng)歸各10 g，茯苓15 g，黑大豆10 g，丹參、首烏藤各15 g，郁金10 g，由杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院中藥房煎煮，濃縮成100 mL/袋，4 ℃冰箱保存。戊酸雌二醇片（批號：727A，規(guī)格：1 mg/片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司）；戊巴比妥鈉（批號：57-33-0，杭州馨然公司）；HE 染色試劑（批號：G1120、G1821，北京索萊寶公司）；EDTA 脫鈣液（批號：BL616B，安徽合肥白鯊公司；4%多聚甲醛（批號：BL539A，安徽合肥白鯊公司）；Ⅰ型前膠原N 端前肽（procollagen type ⅠN-terminal propeptide，PINP）、抗酒石酸酸性磷酸酶5b（tartrate resistant acid phosphatase 5b，TR-ACP-5b）、E2、FSH ELISA 試劑盒（批 號：RX302968R、RX300578R、RXJ302812R、RXJ302805R，武漢睿信生物公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0012S，上海碧云天公司）；RIPA 裂解液（批號：P0013B，上海碧云天公司）；分子量標(biāo)志物Marker（批號：GF6616，上海積福公司）；信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、Janus 激酶（janus kinase，JAK）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體（批號：YT4443、YT2424、YT0185，蘇州Immunoway 公司）；正置顯微鏡（型號：MoticAE 2000，廈門麥克奧迪）；全自動脫水機(jī)（型號：Excelsior AS，美國賽默飛公司）；切片機(jī)（型號：Leica RM2255，德國萊卡公司）、包埋機(jī)（型號：Arcadia H，德國萊卡公司）、染色機(jī)（型號：Gemini AS，美國賽默公司）、自動封片機(jī)（型號：ClearVue，美國賽默飛公司）；微型計算機(jī)斷層掃描（micro-computed tomography，Micro-CT）儀（型號：skyscan1276，美國bruker 公司）；電泳儀（型號：1658001，北京伯樂公司）；蛋白掃膜儀（型號：FluorChem Q，美國Proteinsimple 公司）。

1.3 方法

1.3.1 藥物活性成分的獲取 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺搜索益癸方所含藥物，設(shè)置口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18，搜索單味中藥相關(guān)的藥物活性成分。對于上述數(shù)據(jù)庫未收錄藥物，通過本草組鑒數(shù)據(jù)庫（http://herb.ac.cn/）及相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行補(bǔ)充。

1.3.2 活性成分作用靶點的預(yù)測及疾病靶點基因的篩選 在Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫中利用Molecule smile 預(yù)測藥物活性成分潛在作用靶點，設(shè)置篩選條件為Probability＞0.1。通過GeneCard 數(shù)據(jù)庫（https://www.Genecards.org/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/）、Drugbank 數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）、PGKB數(shù)據(jù)庫（https://www.pharmgkb.org/）、GenClip 數(shù)據(jù)庫（http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）、TTD 數(shù)據(jù)庫（https://db.id-rblab.net/ttd/）搜索“絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis）”和“更年期骨質(zhì)疏松癥（menopausal osteoporosis）”相關(guān)基因，其中GeneCard 數(shù)據(jù)庫取score≥1 的靶點。去重并集后導(dǎo)出相關(guān)基因。

1.3.3 益癸方湯-PMOP 及更年期骨質(zhì)疏松癥靶點網(wǎng)格構(gòu)建和核心靶點篩選 將中藥有效成分潛在作用靶點與疾病相關(guān)靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 中進(jìn)行藥物-疾病靶點網(wǎng)格的構(gòu)建,獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系（protein-protein interactions，PPI），并對該網(wǎng)格進(jìn)行分析，節(jié)點大小與其重要性呈正相關(guān)。將中藥成分潛在作用靶點信息與疾病相關(guān)共有靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 中分析，取度中位數(shù)、接近性中心性中位數(shù)、兩者之間中心性位數(shù)，篩選出15 個核心靶點。

1.3.4 對潛在靶點進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）可視化分析 將藥物作用于疾病的潛在靶點導(dǎo)入Metascape 平臺（https://metascape.org/gp/-index.html#/main/step1），進(jìn)行可視化處理。GO 分析包括生物過程、分子組件、分子功能，采用KEGG 分析信號通路。

1.3.5 動物模型制備、分組及給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組，每組5 只。除假手術(shù)組以外，其余組采用去卵巢手術(shù)法造模[5]，假手術(shù)組開腹后切除腹腔內(nèi)黃豆大小一塊脂肪。術(shù)后所有大鼠肌肉注射青霉素3 d，以防感染。觀察各組大鼠精神狀態(tài)及飲食情況，術(shù)后1 個月開始給藥，根據(jù)人與大鼠用藥換算系數(shù)，計算出實驗藥物劑量。益癸方湯組給予10 mL/（kg·d）益癸方湯灌胃，戊酸雌二醇組給予0.21 mg/（kg·d）戊酸雌二醇灌胃，益癸方湯+戊酸雌二醇組給予益癸方湯10 mL/（kg·d）+戊酸雌二醇0.21 mg/（kg·d）灌胃，模型組及假手術(shù)組給予10 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃，共給藥12 周。最后1次灌胃后，按照0.2 mL/100 g 的劑量注射2%戊巴比妥鈉麻醉后取主動脈血，3 000 r/min，離心15 min，獲得血清保存于-80 ℃冰箱。以頸椎脫臼法處死大鼠，取大鼠左右后肢股骨，左側(cè)股骨置于4%多聚甲醛中常溫固定；右側(cè)股骨置于高溫消毒后EP 管中，-80 ℃冰箱保存。

1.3.6 股骨組織骨微細(xì)結(jié)構(gòu)檢測 采用Micro-CT 掃描。將完整左側(cè)股骨組織在4%多聚甲醛中固定24～48 h 后取出，進(jìn)行Micro-CT 掃描，獲取股骨平面圖像，配套CTAn、CT vox 軟件進(jìn)行骨微細(xì)結(jié)構(gòu)分析，軟件分析時在Micro-CT 掃描成像圖上選擇股骨遠(yuǎn)端作為感興趣區(qū)域，包括骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume/tissue volume，BV/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁間隔（trabecular separation，Tb.Sp）。

1.3.7 骨組織病理變化情況觀察 采用HE 染色。左側(cè)股骨組織Micro-CT 掃描完畢后，置于EDTA 脫鈣液中，每周更換1 次液體，2 個月后脫鈣完全后用流動雙蒸水沖洗2 h 以上，依次進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、HE染色及封片，正置顯微鏡下觀察骨組織病理變化。

1.3.8 血清PINP、TRACP-5b、E2、FSH 水平檢測 采用ELISA 法。嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書檢測血清PINP、TRACP-5b、E2、FSH 水平。

1.3.9 股骨組織中STAT3、JAK、Akt 蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot 法。將右側(cè)股骨組織剪成綠豆大小，液氮下研磨，加入適量裂解液，冰上裂解30 min，再放入組織研磨器中研磨，4 ℃12 000 r/min，離心15 min，收集上清液。BCA 法測定蛋白濃度，計算20 μg 的總蛋白進(jìn)行上樣，電泳儀將凝膠膜上蛋白轉(zhuǎn)移至纖維膜上，配制5%脫脂牛奶封閉1 h，洗膜3 次，將對應(yīng)目的蛋白和內(nèi)參條帶放于STAT3、JAK、Akt、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗中4 ℃搖床上孵育過夜，次日吸掉一抗，洗膜3 次，加入二抗，室溫?fù)u床上孵育1 h，洗膜3 次，加入顯影劑進(jìn)行顯影攝片。使用Image J 軟件對顯影圖像進(jìn)行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSDt檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 益癸方湯防治PMOP 及更年期骨質(zhì)疏松癥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 益癸方湯活性成分及相應(yīng)靶點獲取 益癸方湯中含有157 種有效活性成分，319 個靶點，主要活性成分有槲皮素、木犀草素、丹參酮、柚皮素、谷甾醇等，見圖1（插頁）。

圖1 益癸方湯活性成分和PMOP 靶點

2.1.2 益癸方湯靶點基因的預(yù)測及PMOP、更年期骨質(zhì)疏松癥靶點基因的篩選 利用數(shù)據(jù)庫篩選出更年期骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點1 405 個，PMOP 相關(guān)靶點1 199 個，兩者并集靶點去重后為1 775 個。

2.1.3 益癸方湯有效成分和PMOP 靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Cytoscape 3.7.1 構(gòu)建獲得活性成分與疾病共有靶點145 個，核心靶點包括絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、Akt1、IL-1β、TNF、TP53 等，見圖2。

圖2 15 個核心靶點

2.1.4 GO 和KEGG 分析結(jié)果 GO 與KEGG 分析結(jié)果顯示，生物過程涉及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、對激素的反應(yīng)、對肽類的反應(yīng)、細(xì)胞對有機(jī)氮化合物反應(yīng)等，分子組件涉及受體、質(zhì)膜、囊腔等，分子功能涉及氧化還原酶活性、核受體活性、配體活化轉(zhuǎn)錄因子活性等，可能作用途徑有癌癥途徑、高級糖基化終末產(chǎn)物-受體信號通路、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3，PI3K）/Akt 信號通路、MAPK 信號通路等。

2.2 實驗結(jié)果

2.2.1 各組大鼠股骨組織BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp比較 各組大鼠股骨組織BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=79.568、9.070、10.368、11.256，均P＜0.001）。與假手術(shù)組比較，模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織BV/TV、Tb.Th、Tb.N 均下降，Tb.Sp 均增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。與模型組比較，益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織BV/TV、Tb.Th 均增加；戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織Tb.N 均增加，Tb.Sp 均下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3。從Micro-CT 二維圖和三維圖可見，與模型組比較，益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織Tb.N 增多、致密，見圖4。

圖3 各組大鼠股骨組織BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp 比較（A：BV/TV 比較；B：Tb.Th 比較；C：Tb.N 比較；D：Tb.Sp 比較）

圖4 各組大鼠股骨Micro-CT 二維圖、三維圖

2.2.2 各組大鼠股骨組織病理變化情況比較 與假手術(shù)組比較，模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織中骨小梁減少、變細(xì)；與模型組比較，益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織中骨小梁增加、變粗，見圖5。

圖5 各組大鼠股骨組織HE 染色圖（A：假手術(shù)組；B：模型組；C：益癸方湯組；D：戊酸雌二醇組；E：益癸方湯+戊酸雌二醇組）

2.2.3 各組大鼠血清PINP、TRACP-5b 水平比較 各組大鼠血清PINP、TRACP-5b 水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=25.242、9.508，均P＜0.001）。與假手術(shù)組比較，模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠血清PINP 水平均降低，模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組大鼠血清TRACP-5b 水平均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與模型組比較，益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠血清PINP 水平均升高，戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠血清TRACP-5b 水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖6。

圖6 各組大鼠血清PINP、TRACP-5b 水平比較（A：PINP 水平比較；B：TRACP-5b 水平比較）

2.2.4 各組大鼠血清E2、FSH 比較 各組大鼠血清E2、FSH 水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=51.258、53.867，均P＜0.001）。與假手術(shù)組比較，模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠血清E2水平均降低，F(xiàn)SH 水平均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與模型組比較，益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組E2水平均升高，F(xiàn)SH 水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖7。

圖7 各組大鼠血清E2、FSH 水平比較（A：E2水平比較；B：FSH水平比較）

2.2.5 各組大鼠股骨組織中STAT3、JAK、Akt 蛋白表達(dá)水平比較 各組大鼠股骨組織中STAT3、JAK、Akt 蛋白表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8 021.218、1 580.567、1 744.77，均P＜0.001）。與假手術(shù)組比較，模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織中STAT3、JAK、Akt 蛋白表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與模型組比較，益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織中STAT3、JAK、Akt 蛋白表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖8。

圖8 各組大鼠股骨組織中STAT3、JAK、Akt 蛋白表達(dá)水平比較（A：蛋白表達(dá)的電泳圖；B：STAT3 蛋白表達(dá)水平比較；C：JAK 蛋白表達(dá)水平比較；D：Akt 蛋白表達(dá)水平比較）

3 討論

本研究通過實驗探究益癸方湯對去卵巢大鼠模型的骨量保護(hù)作用，結(jié)果顯示該方劑可提高大鼠體內(nèi)E2水平、降低FSH 水平，骨代謝指標(biāo)中PINP 升高、TRACP-5b 降低，以及股骨微細(xì)結(jié)構(gòu)骨量改善，驗證該方劑可預(yù)防去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松，在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基礎(chǔ)上篩選出STAT3、JAK、Akt 靶點，通過實驗進(jìn)一步驗證了益癸方湯的作用機(jī)制可能通過下調(diào)STAT3、JAK、Akt 蛋白的表達(dá)發(fā)揮作用。

PMOP 的發(fā)生與女性雌激素水平下降有關(guān)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析益癸方湯中可能含有槲皮素、木犀草素、丹參酮、柚皮素、谷甾醇等多種化合物。已有研究證實口服槲皮素能夠部分逆轉(zhuǎn)動物模型中的骨質(zhì)減少，其可能通過抗氧化、抗炎、促進(jìn)成骨細(xì)胞、抑制破骨細(xì)胞發(fā)揮作用[6]。Kim 等[7]研究表明木犀草素顯著降低了骨髓單核細(xì)胞和Raw264.7 細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化，還抑制分化破骨細(xì)胞的骨吸收活性。也有研究證明丹參酮ⅡA 沒有改變NF-κB 受體激活劑或巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體的表達(dá)，而是可能抑制NF-κB 受體激活劑配體誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化[8]。本研究篩選出MAPK3、Akt1、TNF、IL-1β、TP53 等靶點，結(jié)合KEGG 通路分析，尋找到Akt 靶點和PI3K/Akt 信號通路相關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織中JAK、STAT3、Akt 表達(dá)水平均降低，提示益癸方湯可能通過該通路影響骨量作用。PI3K/Akt 信號通路通過介導(dǎo)生長因子信號傳導(dǎo)到有機(jī)過程和關(guān)鍵細(xì)胞過程，如葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞增殖和存活[9]。細(xì)胞對雌激素的反應(yīng)由雌激素受體與雌激素反應(yīng)元件的結(jié)合和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活等非核作用介導(dǎo)，雌激素還和PI3K/Akt 信號通路有關(guān)，數(shù)據(jù)表明17-E2可通過非核作用激活子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中的PI3K/Akt 信號通路[10]。PI3K/Akt 通路還影響了氧化應(yīng)激過程，促進(jìn)氧化損傷后細(xì)胞存活中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。JAK/STAT 途徑是細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)的最重要途徑之一，它不僅參與炎癥，還與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)[12]。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)JAK/STAT 通路被激活時，可以進(jìn)一步激活MAPK 和Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 信號傳導(dǎo)并促進(jìn)成骨分化[13]。一些黃酮類化合物可以發(fā)揮成骨分化作用，如槲皮素可作用于Akt1 靶點，并通過激活PI3K/Akt 信號通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[14]。

綜上所述，益癸方湯中的槲皮素、木犀草素、丹參酮、柚皮素、谷甾醇等多種有效成分可能通過作用于PI3K/Akt、JAK/STAT 信號通路防治PMOP，為中草藥防治POMP 增加了理論基礎(chǔ)。