不同種植年限苜蓿地球囊霉素相關土壤蛋白含量及其影響因素

高 瑞，牛伊寧，何仁元，張耀全，海 龍，羅珠珠,

（1.甘肅農業(yè)大學資源與環(huán)境學院, 甘肅 蘭州 730070；2.省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室, 甘肅 蘭州 730070）

隸屬于球囊菌門(Glomeromycota)的有益微生物叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhiza fungi，AMF)能與陸地上80%的植物互惠共生形成叢枝菌根[1]。AMF 對土壤理化性質變化響應敏感，通過根外菌絲將植物根系與土壤密切聯(lián)系起來[2]，以叢枝和泡囊的結構存在于植物根系中，以菌絲網和孢子的形式分布在植物根圍土壤中[3]，菌絲可延伸至與根系沒有接觸的土壤中拓展植物根系的吸收面積，促進植物對氮、磷、鉀及其他養(yǎng)分和水分的吸收[4-5]，增強植物抗逆性[6]。球囊霉素相關土壤蛋白(glomalin related soil protein，GRSP)是由AMF 所在的菌絲和孢子壁代謝的，隨菌絲和孢子的降解進入土壤中內含有金屬離子的耐熱糖蛋白[7]，對維護AMF 自身的生理功能格外重要。GRSP 含量占土壤碳庫的4%～5%，對土壤碳庫的貢獻不容忽視[8]，對土壤總氮最大貢獻率達到5%，是土壤氮素的一個重要來源[9]。同時，GRSP 被譽為“超級膠水”，其獨特的黏附能力可以促進微團聚體形成大團聚體并有利于維持團粒結構穩(wěn)定性，提高土壤抗侵蝕能力[10]。土壤有機碳和團聚體也存在相互作用，有機碳膠結土壤顆粒促進團聚體的形成，團聚體的形成又在一定程度上有利于土壤固碳[11]。因此，通過研究GRSP 含量可進一步明確AMF 在促進營養(yǎng)物質循環(huán)、維持土壤結構中的作用機理。

紫花苜蓿(Medicago sativa)是一種多年生優(yōu)良豆科牧草，由于其抗旱、抗寒、耐鹽堿、耐瘠薄、生長適應性強[12]，常常被作為黃土高原區(qū)域退耕還林還草的主要草種[13]。持續(xù)多年種植紫花苜蓿后促進土壤碳氮含量提高，但其過度消耗土壤水分和磷素，使得苜蓿產量下降，并制約后續(xù)作物生長。有研究表明，為了提高土壤磷利用率，植物與AMF 形成共生結構以增加磷的吸收[14]。GRSP 是由AMF 代謝的結構相對穩(wěn)定的產物[15]，常作為指標分析AMF 對生態(tài)系統(tǒng)物質循環(huán)的影響[16]。有研究表明，GRSP 含量和有機碳、全氮和速效磷含量正相關[17]；但也有研究發(fā)現(xiàn)，隨施磷水平提高，GRSP 含量先升后降[18]，這說明土壤GRSP 含量與組成受土壤性質、植物種類、環(huán)境因子等多種因素的影響。黃土高原半干旱區(qū)苜蓿長期種植后，GRSP 含量是如何響應這樣一種低磷土壤環(huán)境呢？以往研究大多集中于土壤水分、養(yǎng)分和微生物[19-21]等方面，針對GRSP含量在紫花苜蓿栽培草地的分布狀況及其與土壤性質關系鮮見報道。

因此，本研究通過測定紫花苜蓿不同種植年限AMF 豐度和GRSP 含量，評估其對土壤有機碳庫和團聚體穩(wěn)定性的貢獻，并結合土壤理化因子明確GRSP 含量的主要影響因素，為區(qū)域紫花苜蓿栽培草地可持續(xù)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本研究基于布設在定西市甘肅農業(yè)大學旱作農業(yè)綜合試驗站(104°44′ E, 35°28′ N)的長期定位試驗進行。試區(qū)為雨養(yǎng)農業(yè)區(qū)，土壤為黃綿土，海拔2 000 m，干燥度2.53，無霜期140 d，年均日照時數(shù)2 476.6 h，年均降水量390 mm，年蒸發(fā)量1 531 mm，年均氣溫為6.4 ℃，年均太陽輻射量為592.9 kJ·cm-2[13]。

1.2 試驗設計

研究對象為不同建植年限[2019 年(L2019)、2012年(L2012)、2003 年(L2003)]紫花苜蓿地，對照為玉米(Zea mays)農田，小區(qū)面積均為3 m × 7 m，3 次重復，隨機區(qū)組排列。苜蓿品種均為‘隴東苜蓿’，采用條播方式播種，播量為22.5 kg·hm-2，在建植當年施P2O5105 kg·hm-2、純氮 105 kg·hm-2，苜蓿生長期間未采取施肥措施，每年6 月、10 月刈割兩次。農田自 2013 年開始連續(xù)每年播種該地主栽作物玉米，品種為‘先玉335’，每年播前施P2O5105 kg·hm-2、純N 200 kg·hm-2, 種植密度5.25 萬株·hm-2。試驗期間未施肥灌水，各處理田間管理保持一致。

1.3 土樣采集

用土鉆使用對角線五點法于2021 年6 月苜蓿第1 茬盛花期收集苜蓿和農田玉米土壤(0－20 cm)，混合成一個樣品，每個處理3 次重復，剔除土樣中的各種雜物，將土樣充分混勻后帶回實驗室。部分土樣過篩(2 mm)于4 ℃冰箱保存用于土壤硝態(tài)氮測定，其余土樣風干后過1、2 和0.25 mm 篩，用于土壤其他理化指標及菌絲密度的測定；在每個小區(qū)采集0－30 cm 土層土壤裝盒帶回，在室內風干過程中沿土壤自然縫隙將土壤掰成小于1 cm 的小塊用于土壤團聚體測定。將苜蓿根系挖出，干冰保存帶回實驗室，挑選細根洗凈后剪成1 cm 左右的根段保存，用于測定根系菌根侵染率。

1.4 土壤相關指標測定

測定方法參考《土壤農化分析》[22]。土壤容重使用環(huán)刀法；全氮使用凱氏定氮法；有機碳使用濃硫酸－重鉻酸鉀外加熱法；全磷使用高氯酸－濃硫酸－鉬銻抗比色法；速效磷使用碳酸氫鈉－鉬銻抗比色法；速效鉀使用醋酸銨－火焰光度法；硝態(tài)氮使用2 mol·L-1氯化鉀浸提全自動化學間斷分析儀測定；pH 使用pH 計；土壤微生物生物量碳熏蒸后用硫酸鉀浸提碳氮聯(lián)合分析儀測定。

土壤團粒結構采用濕篩法[23]。用干篩法得到各粒徑團聚體，按比例配成濕篩法所需土樣，裝入孔徑自上而下為5、2、1、0.5、0.25 mm 的團聚體分析套于水桶內，加蒸餾水沒過土壤(振動頻率為30次·min-1，時間為5 min)。之后用烘干法測得每個粒級土壤質量。土壤水穩(wěn)性團粒結構特征用平均重量直徑(mean weight diameter， MWD)、大團聚體所占比重R0.25表示。MWD 指團聚體分布評估的綜合指標，值越大即大粒徑團聚體含量越高，兩者代表團聚體結構穩(wěn)定性和抗侵蝕能力。

式中：dˉi為各級土壤團聚體的平均直徑；wi為各粒級土壤團聚體占總試樣的百分比。

AMF 侵染率采用墨水醋染色法測定[24]。菌絲密度采用真空泵抽濾法測定[25]。參考Wright 和Upadhyaya[26]方法測定GRSP 含量。稱取1 g 過2 mm篩土壤樣品，易提取球囊霉素相關土壤蛋白(easily extractable glomalin related soil protein，EE-GRSP)含量 用20 mmol·L-1檸 檬 酸 鈉 溶 液(pH 7.0)在121 ℃下提取30 min，5 000 r·min-1離心20 min 后收集上清液；總提取球囊素相關土壤蛋白(total glomalin related soil protein，T-GRSP)含量用50 mmol·L-1檸檬酸鈉溶液、pH 8.0 在121 ℃下提取60 min，5 000 r·min-1離心20 min 后收集上清液，重復以上步驟直到上清液失去紅棕色。提取后在紫外－可見光分光光度計(UV-2450，日本島津)在595 nm 波長下比色。

式中：C表示標準曲線值(μg)；Vt表示提取上清液體積(mL)；Vs表示測定時加樣體積(mL)；Wf表示樣品重(g)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本研究使用Excel 2016 對土壤理化性質、GRSP含量進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用SPSS 25.0 對數(shù)據(jù)進行單因素(ANOVA)方差分析、多重比較(LSD 法，P＜ 0.05)進行差異顯著性分析，結果用平均值 ± 標準誤表示。運用Origin2021 進行團粒結構特征、侵染狀況及一元線性回歸分析并繪圖，運用Canoco5軟件進行冗余分析(redundancy analysis，RDA)，用Adobe Illustrator 2020 軟件對圖表進行調整修飾。

2 結果與分析

2.1 不同種植年限苜蓿地土壤基本性質

土壤基本性質表明(表1)，土壤有機碳、全氮和微生物生物量碳隨苜蓿種植年限增加而提高，且L2003處理顯著高于農田(P＜ 0.05)；土壤全磷、速效磷和硝態(tài)氮表現(xiàn)為農田顯著高于苜蓿地(P＜ 0.05)，且全磷和速效磷隨苜蓿種植年限增加而降低；土壤水穩(wěn)性團聚體結構特征表明，平均重量直徑、大團聚體所占比重(R0.25)均隨苜蓿種植年限的增加而提高，且L2003處理顯著高于其他處理(P＜ 0.05)；土壤容重、速效鉀和pH 各處理間未表現(xiàn)出明顯差異。

表1 不同處理土壤基本性質Table 1 Soil properties under different treatments

2.2 不同種植年限苜蓿地土壤AMF 豐度

根系菌根侵染率和菌絲密度均隨苜蓿種植年限增加而提高(圖1)，其中菌根侵染率表現(xiàn)為L2003(74%)處理顯著高于其他處理(P＜ 0.05)，菌絲密度表現(xiàn)為L2003和L2012顯著高于L2019和農田(P＜ 0.05)。

圖1 不同處理AMF 侵染率和菌絲密度Figure 1 Colonization rate and hypha density of arbuscular mycorrhizal fungi under different treatments

2.3 不同種植年限苜蓿地球囊霉素相關土壤蛋白

T-GRSP 和EE-GRSP 含量均表現(xiàn)為隨苜蓿種植年限增加而提高(表2)，且L2003處理顯著高于其他處理(P＜ 0.05)。EE-GRSP/T-GRSP 在處理間無明顯差異，T-GRSP/SOC 隨苜蓿種植年限增加而提高，L2003處理顯著高于農田(P＜ 0.05)。線性回歸分析結果表明(圖2)，土壤有機碳和微生物量碳與T-GRSP顯著正相關(P＜ 0.05)，R0.25和MWD 與T-GRSP 和EE-GRSP 之間均顯著正相關(P＜ 0.05)。

圖2 球囊霉素相關土壤蛋白與土壤有機碳、微生物生物量碳及團聚體結構特征的關系Figure 2 Relationship between glomalin-related soil proteins with Soil organic carbon, microbial biomass carbon, and aggregate characteristics

表2 不同處理球囊霉素相關土壤蛋白含量及相關比例Table 2 Glomalin Related Soil Protein and correlation proportions under different treatments

2.4 土壤AMF 指標與土壤基本性質關系

RDA 分析結果表明，RDA1 和RDA2 共解釋了總方差的87.14% (圖3)。蒙特卡洛檢驗進一步表明(表3)，土壤速效磷(avail phosphorous，AP)和微生物量碳(microbial biomass carbon，MBC)是主導AMF豐度和GRSP 的主要環(huán)境因子(P＜ 0.01)，其中GRSP 與速效磷極顯著負相關(P= 0.002)，與微生物量碳極顯著正相關(P= 0.002)。

圖3 土壤AMF 豐度和GRSP 與土壤基本性質冗余分析Figure 3 Redundancy analysis (RDA) of soil AMF Abundance, GRSP, and soil properties

表3 土壤基本性質對AMF 豐度和GRSP 的影響Table 3 The effects of soil properties on AMF Abundance and GRSP

3 討論

3.1 不同種植年限AMF 豐度及球囊霉素相關土壤蛋白和團聚體結構特征的關系

GRSP 是由AMF 菌絲分泌的一種含有37%的碳和3%～5%氮的理論假設糖蛋白[27]，保存在GRSP中的碳對土壤碳庫的貢獻很大，甚至其含碳量要高于土壤微生物的含碳量[28]，在土壤碳循環(huán)過程中發(fā)揮重要作用。苜蓿根系菌根侵染率和菌絲密度均隨苜蓿種植年限增加而提高，其中菌根侵染率表現(xiàn)為L2003處理顯著高于其他處理，菌絲密度表現(xiàn)為L2003和L2012處理顯著高于L2019和農田處理。相應地，T-GRSP 和EE-GRSP 含量亦表現(xiàn)為隨苜蓿種植年限增加而提高，表明持續(xù)多年種植苜蓿后由于根系AMF 豐度的增加，促使分泌更多的GRSP。大量研究證實GRSP 充當土壤中的“超級膠水”，具備增強土壤團聚體形成及穩(wěn)定性的功能[29]，可將小土壤顆粒黏結成微團聚體至粒徑稍大的團聚體，進而發(fā)展成穩(wěn)定的大團聚體( ＞ 0.25 mm)，其黏附土壤顆粒的能力比其他土壤糖類物質強3～10 倍[30]，能增加土壤團聚體穩(wěn)定性。前人研究發(fā)現(xiàn)GRSP 含量與粒徑大于2 mm 的大團聚含量和團聚體結構穩(wěn)定性指數(shù)MWD 顯著正相關[31-32]。本研究中土壤水穩(wěn)性團聚體結構特征表明，MWD、R0.25均苜蓿隨種植年限的增加而提高。線性回歸分析也表明，TGRSP 與EE-GRSP 與MWD 和R0.25顯著正相關。L2003處理中GRSP 含量最高，相對應的土壤水穩(wěn)性團粒結構特征也顯著高于其他處理，進一步表明持續(xù)多年種植苜蓿后GRSP 含量的增加有利于土壤顆粒黏結為團聚體，從而對包裹在其中的有機碳形成保護，維持有機碳的穩(wěn)定性，提高有機碳含量并改善土壤結構。

3.2 不同種植年限苜蓿地球囊霉素相關土壤蛋白影響因素

GRSP 是土壤有機質的主要組成部分，是土壤中有機碳、氮的重要來源[33]，因此，GRSP 常常被認為是AMF 對宿主植物生長環(huán)境改變的一種應答機制。大量研究證實，土壤GRSP 含量和有機碳、氮、含量正相關[34-35]；但是，GRSP 含量和土壤磷的含量關系較為復雜，高磷土壤中與土壤速效磷顯著正相關[36]，土壤缺磷情況下與土壤速效磷無顯著相關性[17]或負相關[37]。本研究中土壤速效磷含量隨苜蓿種植年限的增加而降低，微生物量碳和GRSP含量隨苜蓿種植年限增加而提高，且RDA 和蒙特卡洛檢驗結果表明GRSP 含量與速效磷含量極顯著負相關，原因可能是黃綿土區(qū)土壤磷缺乏，苜蓿種植多年并未施肥，種植年限越長速效磷含量越低，在該環(huán)境下植物更容易受到磷限制而不是氮限制，磷限制情況下植物會釋放更多的化學信號來刺激AMF 生長。L2003處理AMF 侵染率顯著高于其他處理，當土壤中的速效磷含量越低，AMF 的侵染率可能就越高，菌絲延伸吸收土壤養(yǎng)分、GRSP 隨菌絲腐解釋放于土壤，導致速效磷含量低的土壤分泌的GRSP 含量可能就越高。

4 結論

黃綿土區(qū)長期種植紫花苜蓿顯著改變了土壤基本性質，進而提高了AMF 豐度和GRSP 含量。GRSP含量與土壤有機碳及團聚體穩(wěn)定性之間顯著相關。冗余分析表明，影響土壤AMF 豐度和GRSP 含量的主要環(huán)境因子是土壤速效磷和微生物生物量碳。與農田相比，T-GRSP 含量在土壤有機碳中的比例隨苜蓿種植年限的增加而提高，說明長期種植苜蓿引起GRSP 含量增加并促進了其在土壤有機碳中的積累，提高了GRSP 含量對團聚體穩(wěn)定性和土壤有機碳的貢獻。該研究結果可為黃綿土GRSP 研究及紫花苜蓿栽培草地可持續(xù)利用提供理論依據(jù)。