光照強(qiáng)度對近視豚鼠的眼生物學(xué)參數(shù)、視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)及鞏膜組織lumican和MMP-2表達(dá)水平的影響

符俊達(dá), 朱海萍, 楊婉晨, 賈 娜, 孫軼軍

近視已成為全球公共衛(wèi)生問題,近年來,其發(fā)病呈低齡化,且高度近視發(fā)病率呈增長趨勢,不僅影響患者日常生活,而且會增加眼底病變風(fēng)險,是致盲的主要危險因素之一[1-2]。因此,在各級醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)全面開展近視的科學(xué)防控工作迫在眉睫。研究表明,光照不足和(或)戶外活動減少與近視的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系,戶外高強(qiáng)度光照可能具有延緩眼軸增長,控制近視進(jìn)展的作用[3],但高強(qiáng)度光照延緩近視進(jìn)展的效果和具體機(jī)制尚不清楚。據(jù)報道,鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)合成與降解失調(diào)可引起鞏膜組織重塑,鞏膜進(jìn)行性變薄,眼軸增長,最終導(dǎo)致近視進(jìn)展[4]。本研究通過透鏡誘導(dǎo)方法構(gòu)建光學(xué)離焦性近視豚鼠模型,模擬人眼近視的發(fā)展過程,旨在觀察不同光照強(qiáng)度對近視豚鼠眼生物學(xué)參數(shù)、視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)以及鞏膜膠原合成與降解的標(biāo)志物光蛋白聚糖(lumican)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選擇健康英國種三色豚鼠80只,3周齡,雌雄不限,體重180～210 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。將豚鼠飼養(yǎng)于透明塑料籠內(nèi),設(shè)置溫度21～24 ℃,相對濕度40%～60%,光照度300 lux,每12 h晝夜交替。所有豚鼠自由飲水?dāng)z食,給予富含維生素的飼料,并補(bǔ)充新鮮蔬菜。本研究獲秦皇島市第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批號：S20220128)。

1.2主要試劑與儀器 (1)主要試劑：過碘酸雪夫染液、末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)細(xì)胞凋亡試劑盒、RIPA裂解液、電化學(xué)發(fā)光試劑購自北京索萊寶科技有限公司。Trizol試劑購自美國Sigma公司。lumican、MMP-2及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光染料試劑盒購自上海羅氏制藥有限公司。兔抗lumican、兔抗MMP-2、鼠抗β-actin蛋白一抗購自美國Abcam公司。過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/鼠IgG蛋白二抗購自上海澤葉生物科技有限公司。(2)主要儀器：眼科A型超聲儀購自法國光太公司。BX53型正置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。HT7700型透射電子顯微鏡購自日本日立公司。實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀購自美國BioRad公司。

1.3光學(xué)離焦性近視豚鼠模型的建立[5]采用凹透鏡誘導(dǎo)方法：用10寸白色不透明氣球套住豚鼠頭部,裁剪露出豚鼠左眼、口鼻、耳朵,將-10.0 D透鏡固定于右眼處,制成誘導(dǎo)頭套,所有豚鼠佩戴該頭套造模,左眼暴露不戴鏡作自身對照,共誘導(dǎo)3～5周。每日檢查頭套2次,避免移位或脫落。定期測定豚鼠右眼屈光度。同批次80只豚鼠造模,有74只屈光度符合要求(-1～-4 D),成功率為92.50%,隨機(jī)選取60只模型豚鼠進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4實驗動物分組與處理 將模型豚鼠隨機(jī)分為A組、B組、C組、D組,每組15只。A組每日置于室外充足陽光下3 h,平均光照度60 000 lux;B組每日置于室外陰涼處3 h,平均光照度10 000 lux;C組每日置于室內(nèi)北窗處3 h,平均光照度2 000 lux;D組每日室內(nèi)正常飼養(yǎng),平均光照度300 lux。其余時間統(tǒng)一室內(nèi)飼養(yǎng),平均光照度300 lux,正常攝食飲水,持續(xù)光照處理6個月后,每組隨機(jī)選取10只豚鼠進(jìn)行后續(xù)實驗。實驗中未出現(xiàn)豚鼠死亡。

1.5屈光度與眼軸測量 分別于光照前,以及光照后1個月、3個月、6個月進(jìn)行屈光度與眼軸測量。用復(fù)方托吡卡胺滴眼液(參天制藥株式會社)滴眼3次,1滴/次,待完全散瞳后,采用帶狀光檢影驗光測量右眼屈光度。采用眼科A型超聲儀測量豚鼠右眼眼軸長度,用鹽酸奧布卡因滴眼液(參天制藥株式會社)滴眼3次,1滴/次,設(shè)置前房傳播速度為1 557 m/s,玻璃體傳播速度為1 540 m/s,晶狀體傳播速度為1 723 m/s,將探頭置于角膜頂點測量眼軸長度[6]。

1.6顯微鏡觀察視網(wǎng)膜病理變化 光照處理6個月后,脫頸處死豚鼠,摘取右眼球(帶有部分視神經(jīng)),沿視神經(jīng)縱向切眼球,去除內(nèi)容物,經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟包埋后,取后極部黃斑區(qū)附近組織制成4 μm石蠟切片,進(jìn)行TUNEL細(xì)胞凋亡染色,熒光顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜病理變化(空泡樣改變、水腫等)。

1.7透射電子顯微鏡觀察視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu) 光照處理6個月后,脫頸處死豚鼠,摘取右眼球,置于3%戊二醛溶液中固定3 h,沿后極部切出寬度為1～2 mm的長條,3%戊二醛溶液再固定2 h,1%四氧化鋨避光固定90 min,再經(jīng)脫水、浸透、包埋,鈾鉛雙重染色后,透射電子顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)。

1.8實時熒光定量PCR法檢測鞏膜組織中l(wèi)umican和MMP-2 mRNA相對表達(dá)量 光照處理6個月后,脫頸處死豚鼠,摘取右眼球,取后極部鞏膜組織,采用Trizol法提取總RNA,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并以cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。引物序列見表1。擴(kuò)增條件：95 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 5 min,共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,通過2-△△Ct法計算lumican和MMP-2 mRNA相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.9蛋白印跡法檢測鞏膜組織中l(wèi)umican和MMP-2蛋白相對表達(dá)量 光照處理6個月后,脫頸處死豚鼠,摘取右眼球,取后極部鞏膜組織,應(yīng)用RIPA裂解液提取總蛋白,測定濃度后,上樣、電泳、電轉(zhuǎn),用5%脫脂牛奶封閉2 h,再加入兔抗lumican(1∶1 500)、兔抗MMP-2(1∶2 000)、鼠抗β-actin(1∶1 000)一抗,4 ℃孵育過夜,洗膜后,再加入過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/鼠IgG蛋白二抗(1∶8 000),37 ℃孵育30 min,最后滴加發(fā)光液顯影,掃描各蛋白條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參計算lumican和MMP-2蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1四組豚鼠光照前后屈光度比較 光照前,各組豚鼠屈光度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與光照前比較,光照1個月、3個月及6個月時各組屈光度有不同程度增加(P<0.05)。光照1個月時,A組和B組屈光度低于D組;光照3個月、6個月時,A組屈光度低于B組、C組和D組,B組屈光度低于D組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 四組豚鼠光照前后屈光度比較

2.2四組豚鼠光照前后眼軸長度比較 光照前,各組豚鼠眼軸長度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與光照前比較,A組光照3個月、6個月,B組、C組和D組光照1個月、3個月及6個月時眼軸長度有不同程度增長(P<0.05)。光照1個月時,A組和B組眼軸長度低于D組;光照3個月、6個月時,A組眼軸長度低于B組、C組和D組,B組眼軸長度低于D組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 四組豚鼠光照前后眼軸長度比較

2.3四組豚鼠光照后視網(wǎng)膜病理和超微結(jié)構(gòu)情況

光照6個月后,TUNEL染色結(jié)果顯示,各組豚鼠視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)外核層及光感受器細(xì)胞層均有不同程度的細(xì)胞凋亡,可見散在未染色細(xì)胞、核裂解細(xì)胞、染色質(zhì)濃縮邊緣化。高倍鏡視野下A組、B組、C組和D組視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)量分別為(7.30±1.39)個、(15.40±3.25)個、(34.80±5.66)個、(37.20±5.14)個。A組和B組凋亡細(xì)胞數(shù)量少于C組、D組(A組 vs C組,t=14.601,P<0.001;A組 vs D組,t=15.875,P<0.001;B組 vs C組,t=10.300,P<0.001;B組 vs D組,t=11.574,P<0.001),且A組凋亡細(xì)胞數(shù)量少于B組(t=4.301,P<0.001)。透射電子顯微鏡顯示,局部視網(wǎng)膜出現(xiàn)線粒體腫脹伴空泡樣改變,微小皺褶和囊腫。A組和B組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)損傷程度較C組、D組輕,且A組損傷程度較B組輕,見圖1。

黑色箭頭示黃棕色細(xì)胞為凋亡細(xì)胞;藍(lán)色箭頭示空泡樣改變;紅色箭頭示水腫

2.4四組豚鼠光照后鞏膜組織中l(wèi)umican和MMP-2表達(dá)水平比較 光照6個月后,與C組、D組比較,A組和B組的lumican表達(dá)水平較高,MMP-2表達(dá)水平較低,且A組lumican表達(dá)水平高于B組,MMP-2表達(dá)水平低于B組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

?鞏膜組織中l(wèi)umican和MMP-2 mRNA相對表達(dá)量比較。各組lumican mRNA相對表達(dá)量比較,F=293.565,P<0.001;各組MMP-2 mRNA相對表達(dá)量比較,F=93.530,P<0.001。?鞏膜組織中l(wèi)umican和MMP-2蛋白相對表達(dá)量比較。各組lumican蛋白相對表達(dá)量比較,F=55.974,P<0.001;各組MMP-2蛋白相對表達(dá)量比較,F=35.385,P<0.001。與B組比較,aP<0.05;與C組比較,bP<0.05;與D組比較,cP<0.05

3 討論

3.1豚鼠常被用于建立近視動物模型,因其眼球解剖結(jié)構(gòu)、功能及正視化機(jī)制與人類相似,便于測量眼生物學(xué)參數(shù)[6]。近視的誘導(dǎo)方法主要有形覺剝奪性誘導(dǎo)和光學(xué)離焦性誘導(dǎo),而豚鼠對光學(xué)離焦性誘導(dǎo)更為敏感[7]。本研究采用凹透鏡誘導(dǎo)光學(xué)離焦性近視豚鼠模型,結(jié)果顯示,佩戴凹透鏡誘導(dǎo)3～5周后,豚鼠開始出現(xiàn)不同程度的近視,屈光度范圍為-1～-4 D,與既往研究結(jié)果一致[8]。

3.2近視的發(fā)生發(fā)展與環(huán)境因素密切相關(guān),尤其是青少年近視,其中光暴露是影響眼球屈光發(fā)育的重要因素之一,光照強(qiáng)度、波長、時間、節(jié)律等因素均可產(chǎn)生影響[9]。臨床觀察發(fā)現(xiàn),長期暴露于低強(qiáng)度光照環(huán)境會引發(fā)視疲勞,增加兒童近視風(fēng)險,而高強(qiáng)度光照可延緩近視度數(shù)的增長[10]。有研究認(rèn)為,兒童每日在光照度≥10 000 lux的自然光照環(huán)境下3 h,可有效預(yù)防近視[11-12]。朱秋蓉和劉隴黔[13]的研究顯示,高強(qiáng)度光照刺激視網(wǎng)膜產(chǎn)生多巴胺等信號因子,信號因子通過作用視網(wǎng)膜相應(yīng)位點、周邊部視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜或傳遞到鞏膜等方式發(fā)揮調(diào)控作用,控制眼軸增長,減緩近視進(jìn)展。本研究也觀察到類似結(jié)果,將近視豚鼠每日置于不同光照強(qiáng)度環(huán)境下3 h,發(fā)現(xiàn)室外高強(qiáng)度光照可減緩近視進(jìn)展,室內(nèi)環(huán)境無干預(yù)效果。

3.3眼軸過度增長會導(dǎo)致視網(wǎng)膜擴(kuò)張,結(jié)構(gòu)紊亂,功能下降。本研究通過TUNEL細(xì)胞凋亡染色和透射電子顯微鏡觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變化,光照6個月后,各組豚鼠視網(wǎng)膜均伴有細(xì)胞凋亡表現(xiàn),并出現(xiàn)不同程度的層次排列紊亂,組織間隙增大,線粒體胞質(zhì)內(nèi)空泡樣改變,內(nèi)、外核層細(xì)胞核固縮等結(jié)構(gòu)變化以及細(xì)胞數(shù)量減少,局部視網(wǎng)膜出現(xiàn)微小皺褶和囊腫,A組視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)量最少,病理損傷程度最輕?？梢娛彝飧邚?qiáng)度光照可抑制眼軸增長,減緩近視進(jìn)展,防止高度近視及視網(wǎng)膜病變的發(fā)生。

3.4鞏膜成纖維細(xì)胞和ECM的重塑與眼軸增長密切相關(guān)。鞏膜的主要功能是維持眼球形狀和完整性,若ECM降解增多、合成減少,將引起鞏膜變薄、鞏膜ECM重塑,促進(jìn)眼軸增長[14]。lumican是調(diào)節(jié)膠原纖維生成的因子,在鞏膜組織中高表達(dá),通過連接膠原分子調(diào)節(jié)膠原纖維直徑,促進(jìn)ECM的形成,增強(qiáng)鞏膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,減緩眼軸增長,控制近視進(jìn)展[15]。MMP-2是調(diào)節(jié)ECM重塑的主要酶類,其高表達(dá)是增加鞏膜ECM降解的主要原因,鞏膜ECM重塑導(dǎo)致鞏膜組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,誘導(dǎo)近視發(fā)生[16]。有研究顯示,lumican基因突變可影響堿性成纖維細(xì)胞生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子β2表達(dá),改變鞏膜組織的ECM代謝,從而參與近視的發(fā)生發(fā)展[17]。李佳賢等[18]研究報道,下調(diào)MMP-2表達(dá),可降低豚鼠近視屈光度,延緩眼軸增長,對形覺剝奪性近視的進(jìn)展有干預(yù)作用。本研究發(fā)現(xiàn),室外高強(qiáng)度光照組lumican表達(dá)上調(diào),MMP-2表達(dá)下調(diào),而室內(nèi)低強(qiáng)度光照組對lumican和MMP-2的表達(dá)無明顯影響,表明室外高強(qiáng)度光照有助于抑制鞏膜重塑,延緩眼軸過快增長,從而減緩近視進(jìn)展速度。

綜上所述,室外高強(qiáng)度光照可上調(diào)近視豚鼠鞏膜組織中l(wèi)umican表達(dá),下調(diào)MMP-2表達(dá),間接調(diào)節(jié)膠原纖維合成與分解的平衡,防止鞏膜過度重塑,從而控制眼軸增長,減緩近視進(jìn)展,減輕視網(wǎng)膜病理損傷程度,可間接證實合理戶外活動對控制近視進(jìn)展具有積極作用,但本研究僅針對近視豚鼠模型進(jìn)行對比分析,只能說明具有相關(guān)性,能否在兒童和青少年近視患者中也表現(xiàn)出類似效果,仍需要進(jìn)一步研究。