白芨外泌體的分離及對(duì)體外人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(Hacat)的凋亡保護(hù)研究

施建羽，李惠華，吳美芳，王偉

（福建省亞熱帶植物研究所，福建省亞熱帶植物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361006）

0 引言

白芨又名“白及”，Bletillastriata(Thunb. ex A.Murray)Rchb.f.，蘭科白芨屬草本植物，是中國(guó)傳統(tǒng)中藥。其藥用部位是干燥塊莖，味甘、苦、澀，性偏寒，歸胃經(jīng)、肺經(jīng)和肝經(jīng)[1]。白芨的藥用價(jià)值很高：抑菌、消炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、促傷口愈合等[2-3]。其主要成分為天然水溶性多糖，其次為多酚、氨基酸類[4]。目前白芨的應(yīng)用領(lǐng)域主要涉及：傳統(tǒng)中藥組方、包合材料、生物黏附材料、水凝膠材料、基因遞送載體、血管栓塞材料和聚合物膠束材料等，也可用作祛斑類化妝品[5-7]。隨著白芨栽培技術(shù)的完善，產(chǎn)量大幅提升，高端加工產(chǎn)品的需求激增。因此，運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)和方法對(duì)白芨的成分以及應(yīng)用場(chǎng)景做進(jìn)一步的挖掘具有重要意義。

近年來(lái)，藥用植物外泌體成為新的中藥活性成分，引起研究人員的重視。植物外泌體是由植物細(xì)胞分泌的、包含了復(fù)雜RNA 和蛋白質(zhì)的細(xì)胞外囊泡，其直徑在30～200 nm之間，主要參與細(xì)胞間的通訊，因具有磷脂雙分子層而性質(zhì)穩(wěn)定，可保護(hù)內(nèi)含物免受降解并運(yùn)送至受體細(xì)胞[8-10]。2012 年細(xì)胞外囊泡國(guó)際學(xué)會(huì)的成立，顯示了外泌體在生物學(xué)和應(yīng)用方面的重要性。外泌體除自身具有一定功能之外，還是一種新興的天然納米材料，用作藥物載體[11-14]。外泌體在原植株細(xì)胞乃至跨界細(xì)胞或物種間有廣泛的應(yīng)用前景，例如在美容方面：間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體可促燙傷皮膚的恢復(fù)及再生[15]，在面部皮膚光損傷修復(fù)中，人血小板外泌體被證實(shí)安全且療效顯著[16]，毛囊乳頭細(xì)胞球來(lái)源的外泌體可促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)[17]。

藥用植物外泌體是目前醫(yī)藥學(xué)、生物學(xué)等研究熱點(diǎn)之一[11-13]，目前尚未見(jiàn)白芨外泌體分離和功能研究的報(bào)導(dǎo)。本研究以鮮白芨塊莖為材料，首次進(jìn)行白芨外泌體的分離，開(kāi)展其對(duì)體外人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(human immortalized keratinocyte，Hacat)的生物活性研究，以期為白芨外泌體在護(hù)膚品領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮白芨(Bletillastriata)的藥用部位塊莖，2021 年10 月采收于福建省亞熱帶植物研究所藥用植物資源圃。

1.2 聚乙二醇(PEG)沉淀法提取白芨外泌體

（1）鮮白芨塊莖500克榨汁，移至離心管內(nèi)，2000×g，4℃，30 min 離心。（2）將上清液移至新的離心管中，10000×g，4℃，45 min離心，去除較大的囊泡。（3）取上清，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，收集過(guò)濾液。（4）將上清和相同體積的PEG6000 溶液混勻，4℃過(guò)夜。（5）10000×g，4℃，60 min離心，去上清，用3 mL預(yù)冷PBS重懸沉淀，透析過(guò)夜。（6）將透析完的重懸液轉(zhuǎn)移到EP 管中，10000×g，4℃，60 min 離心，去上清，預(yù)冷PBS 重懸沉淀，取20 μL用于透射電鏡觀察，10 μL用于粒徑分析，10 μL用于蛋白提取，剩余外泌體于-80℃保存。

1.3 透射電鏡觀察白芨外泌體

（1）吸取外泌體10 μL，滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min，濾紙吸去浮液。（2）醋酸雙氧鈾10 μL滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min，濾紙吸去浮液，常溫干燥數(shù)分鐘。（3）100 kv進(jìn)行電鏡(Hitachi HT-7700)檢測(cè)成像。

1.4 白芨外泌體樣品粒徑分析

（1）吸取外泌體10 μL，稀釋到30 μL。（2）先用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行粒徑分析儀(NanoFCM N30E)性能測(cè)試，合格后方可進(jìn)行外泌體樣品上樣，注意需進(jìn)行梯度稀釋，避免樣本堵塞進(jìn)樣針。（3）樣本完成檢測(cè)，即可獲得儀器檢測(cè)外泌體的粒徑和濃度信息。

1.5 白芨外泌體樣品蛋白提取及濃度測(cè)定

（1）37℃速融外泌體，并迅速加入5×的RIPA（Radio Immunoprecipitation Assay，放射免疫沉淀）裂解液。（2）混勻后在冰上裂解30 min，期間混勻。（3）配制BCA(bicinchoninic acid，聚氰基丙烯酸正丁酯）法測(cè)蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，并取5 μL樣品加入到BCA混合液中，混勻。（4）37℃孵育30 min，酶標(biāo)儀上在OD562 nm處檢測(cè)吸光值并記錄。（5）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出待測(cè)樣品蛋白濃度。

1.6 Hacat細(xì)胞培養(yǎng)

Hacat 細(xì)胞在含有1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM(dulbecco's modified eagle medium)高糖培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2保持飽和濕度培養(yǎng)，細(xì)胞密度約80%～90%時(shí)進(jìn)行常規(guī)傳代。

1.7 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力

Hacat細(xì)胞按照5000個(gè)/孔鋪板96孔板，待細(xì)胞貼壁后，62.5 μmol/L H2O2處理4 min 進(jìn)行氧化損傷。之后，棄舊的培養(yǎng)基，向細(xì)胞中添加內(nèi)含10 μg/mL 白芨外泌體的完全培養(yǎng)基。氧化損傷處理的細(xì)胞為模型組，正常未處理細(xì)胞為對(duì)照。48 h后，加入CCK8試劑進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)，2 h內(nèi)讀取OD450值。此時(shí)，分別收集對(duì)照組、模型組、造模后外泌體處理組的Hacat 細(xì)胞，制備Western Blot的樣本。

1.8 流式雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡

采用生工生物工程股份有限公司生產(chǎn)的E606336-0020 Annexin V（分子量為35k～36 kD 的Ca依賴性磷脂結(jié)合蛋白）凋亡檢測(cè)試劑盒，F(xiàn)ITC/PI（Propidium Iodide 碘化丙啶）雙染法，按照說(shuō)明書操作：胰酶消化細(xì)胞，1200 r/min，離心5 min 收集細(xì)胞，PBS洗滌2次；195 μL 1×Binding buffer懸浮細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC，4℃避光孵育10～15 min；加入200 μL 1×Binding buffer 洗滌細(xì)胞、1200 r/min 離心5 min，移除上清；190 μL 1×Binding buffer 懸浮細(xì)胞；加10 μL PI混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.9 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

提取細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)BCA法定量和蛋白變性后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，80 V恒壓電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚二偏氟乙烯膜上，用5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h；用5% BSA稀釋一抗Anti-BCL-2(1:1000)、Anti- Caspse- 3(1:1000)、Anti- Caspase- 9(1:1000)，放入PVDF 膜，4℃過(guò)夜，TBST（洗滌緩沖液一種：T:Tris；B:Buffer；S:Solution；T:Tween）洗膜3 次；放入山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜5次；然后用電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影。抗體及生化試劑購(gòu)自生工生物工程股份有限公司。以β-actin 作為內(nèi)參，采用Photoshop 5.0軟件對(duì)各條帶的總灰度值作相對(duì)定量分析。具體方法參考文獻(xiàn)[18]。

1.10 數(shù)據(jù)

每個(gè)試驗(yàn)3 次生物學(xué)重復(fù)，1.7 中細(xì)胞活力設(shè)6 次生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行生統(tǒng)分析。其余試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Duncan法進(jìn)行多重比較，表示為3次重復(fù)的平均值±SE，標(biāo)有不同小寫字母表示組間差異顯著(P＜0.05)，標(biāo)有相同小寫字母表示組間差異不顯著(P＞0.05)；標(biāo)有不同大寫字母表示組間差異顯著(P＜0.01)，標(biāo)有相同大寫字母表示組間差異不顯著(P＞0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外泌體形態(tài)及大小

采用PEG沉淀法，由鮮白芨塊莖分離的外泌體標(biāo)注為：白芨外泌體(B-exo)。圖1所示：在透射電鏡下可以看到白芨外泌體具有十分明顯的膜結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)茶杯狀；粒徑分析儀檢測(cè)，白芨外泌體粒徑為69.63 nm，500 g鮮樣提取白芨外泌體35 mL，每毫升白芨外泌體的顆粒數(shù)為7.48E+9 Particles，每克鮮白芨外泌體的顆粒數(shù)為5.24E+8 Particles?；谛螒B(tài)完整性判斷，采用PEG沉淀法提取的白芨外泌體可用于后續(xù)研究。

圖1 白芨外泌體透射電子顯微鏡圖和平均粒徑示意圖

2.2 白芨外泌體蛋白指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

采用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，結(jié)果表明：外泌體蛋白測(cè)出的OD562 nm 為0.0945 代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的公式(1)進(jìn)行計(jì)算，得到白芨外泌體蛋白濃度為0.223 μg/μL（加裂解液），換算得到未添加裂解液的白芨外泌體原蛋白濃度為0.279 μg/μL，并根據(jù)此數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)定量。結(jié)合以上蛋白濃度和樣本的起始量可知，每克白芨鮮樣中含外泌體蛋白19.53 μg。

式中x表示OD562，y表示標(biāo)準(zhǔn)濃度(μg/mL)。

2.3 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

CCK8檢測(cè)不同濃度白芨外泌體對(duì)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(Hacat)存活率影響，結(jié)果如表1所示。

表1 不同濃度白芨外泌體對(duì)Hacat細(xì)胞存活率的影響

與空白對(duì)照相比，5 μg/mL 以上的白芨外泌體處理均可以顯著提高Hacat細(xì)胞的存活率(P<0.05)，并且隨著白芨外泌體處理濃度的提高，Hacat細(xì)胞存活率也逐漸提高，10 μg/mL與20 μg/mL的處理沒(méi)有顯著性差異。說(shuō)明一定濃度的白芨外泌體在一定程度上可以顯著提高Hacat細(xì)胞的存活率，也有飽和濃度。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，如圖2 所示。H2O2氧化損傷處理后，Hacat 細(xì)胞凋亡水平顯著上調(diào)(P<0.01)。Hacat細(xì)胞經(jīng)氧化損傷再添加10 μg/mL白芨外泌體處理48 h，與氧化損傷模型組比較，Hacat 細(xì)胞凋亡程度均顯著降低(P<0.01)。

圖2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

表2數(shù)據(jù)分析表明：氧化損傷模型組造模有效，白芨外泌體處理組能夠顯著降低氧化損傷引起的Hacat細(xì)胞早凋亡、晚凋亡和總凋亡的細(xì)胞比例(P<0.01)。

表2 白芨外泌體對(duì)Hacat細(xì)胞凋亡的影響

2.5 蛋白印跡法檢測(cè)Hacat細(xì)胞凋亡相關(guān)通路蛋白

Hacat 細(xì)胞經(jīng)H2O2氧化損傷處理造模，模型組用白芨外泌體10 μg/mL 干預(yù)48 h。蛋白印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞的caspase-9和caspase-3 表達(dá)顯著上升，而B(niǎo)cl-2 表達(dá)量無(wú)顯著差異；與模型組相比，白芨外泌體處理組的caspase-9和caspase-3表達(dá)顯著下降，且低于對(duì)照組，而B(niǎo)cl-2表達(dá)量無(wú)顯著差異(P<0.05)（圖3）。采用半定量掃描分析，以β-Actin為蛋白上樣量的內(nèi)參，對(duì)照組、模型組和外泌體處理組計(jì)算灰度比的相對(duì)值結(jié)果如下：caspase-9 分別為1.000，1.325±0.012，0.847±0.006；caspase-3 分別為1.000，1.313±0.025，0.856±0.011；Bcl-2 分別為1.000，1.090±0.024，1.047±0.016。

圖3 Hacat細(xì)胞經(jīng)氧化造模和外泌體處理后相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)

3 討論

3.1 PEG沉淀法適合白芨外泌體的分離

已有研究表明，外泌體的提取方法有超速離心法、超濾離心法、多聚物沉淀法、密度梯度離心法、免疫磁珠法以及尺寸排阻色譜法等[19-20]。方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前最廣泛采用的超速離心法，雖然操作簡(jiǎn)單且易保持外泌體的完整性，但對(duì)儀器設(shè)備的要求較高，需要超高速離心機(jī)的轉(zhuǎn)速>100000 r/min，4℃，滿足此條件的離心機(jī)價(jià)格昂貴[20]。本研究中白芨外泌體的分離采用的是PEG沉淀法，屬于多聚物沉淀法。PEG早已廣泛用于濃縮和純化病毒，因?yàn)橥饷隗w與病毒有著較為相似的生物物理特性，研究人員嘗試用PEG法分離外泌體，較其他方法提取成本更廉價(jià)[21]。本研究中，采用PEG6000 在4℃條件下，過(guò)夜沉淀白芨外泌體，整個(gè)分離過(guò)程中最大的離心力為10000×g，此提取條件絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室均可以滿足，且成本低廉，與已有報(bào)導(dǎo)相符。不過(guò)也有研究表明，PEG可能會(huì)干擾目標(biāo)分離物從而影響后續(xù)試驗(yàn)[19]。本研究中，透射電鏡下白芨外泌體保留完整的膜結(jié)構(gòu)；Hacat 細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡檢測(cè)及蛋白印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)通路蛋白的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示PEG 沉淀法保留了白芨外泌體的生物活性。因此PEG沉淀法適合于白芨外泌體的分離，可為其他植物外泌體的提取提供參考。

3.2 白芨外泌體對(duì)氧化損傷引起的Hacat 細(xì)胞凋亡與Caspase 依賴性凋亡途徑相關(guān)

從已知的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的內(nèi)源性和外源性凋亡途徑[22]可知：Bcl-2 位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游，不局限于調(diào)控下游Caspase 蛋白；Caspase-9 位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的樞紐位置，能被多個(gè)因子調(diào)控；Caspase-3位于Caspase-9的下游。已有研究表明：Caspase蛋白是一類與凋亡相關(guān)的蛋白酶家族，Caspase-9 為凋亡始動(dòng)子，屬啟動(dòng)型蛋白酶，位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游[23]。Caspase-3 為凋亡效應(yīng)子，屬執(zhí)行型蛋白酶，位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，能被上游的始動(dòng)子激活，一旦被激活會(huì)觸發(fā)下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使凋亡不可避免[24]。Bcl-2蛋白是Bcl-2家族蛋白中抗凋亡蛋白的代表[25]。本研究表明：H2O2氧化損傷模型中Caspase-3、Caspase-9含量增加，說(shuō)明在模型組的Hacat細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Caspase依賴性凋亡途徑激活[26]。與模型組相比，白芨外泌體干預(yù)組的Caspase-9 和Caspase-3 表達(dá)顯著下降，且低于對(duì)照組，說(shuō)明在外泌體干預(yù)下，經(jīng)H2O2氧化損傷的Hacat細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Caspase 依賴性凋亡途徑被抑制。Caspase-9 和Caspase-3表達(dá)呈現(xiàn)出正相關(guān)性，與已有研究相符。在本項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組、氧化造模組、外泌體處理組當(dāng)中Bcl-2 表達(dá)均無(wú)顯著性變化，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)涉及的Hacat細(xì)胞凋亡過(guò)程與Bcl-2無(wú)關(guān)，與已有研究Bcl-2位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游，不局限于調(diào)控下游Caspase 蛋白相符。本研究通過(guò)流式雙染檢測(cè)證實(shí)白芨外泌體對(duì)Hacat細(xì)胞凋亡的抑制作用，并通過(guò)蛋白印跡法對(duì)其可能的相關(guān)通路蛋白做了初探，兩部分內(nèi)容相互佐證，證實(shí)白芨外泌體對(duì)氧化損傷引起的Hacat細(xì)胞凋亡具有抑制作用，但鑒于凋亡途徑的復(fù)雜性[22]，其Caspase 途徑上游的影響因子、相關(guān)基因及更深入的凋亡分子機(jī)理研究還需進(jìn)一步試驗(yàn)。

3.3 在益膚方面白芨外泌體是傳統(tǒng)白芨制劑的有益補(bǔ)充

已有研究發(fā)現(xiàn)：將白芨加水?dāng)嚢韬笮纬傻哪z，涂抹于大鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面，能顯著促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織、毛細(xì)血管生長(zhǎng)及創(chuàng)面組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的高表達(dá)，具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用，具有顯著的止血功效[26]。白芨凝膠中最主要的成分是白芨多糖，其作為一種優(yōu)良的天然增稠劑，可應(yīng)用于各種化妝品，代替化學(xué)增稠劑，減少對(duì)皮膚的刺激，同時(shí)也可作為懸浮劑、保濕劑和助乳化劑應(yīng)用于化妝品中，且均具有良好的效果[4]。人皮膚角質(zhì)層的緊密結(jié)構(gòu)是限制物質(zhì)進(jìn)出皮膚的主要屏障，小分子物質(zhì)、兼具脂溶性和水溶性的物質(zhì)更易于滲透[27-28]。

白芨多糖為大分子，并具有黏性，雖然在開(kāi)放性傷口上有很好的促修復(fù)功效，但涂抹在正常皮膚上，其大分子的特性在一定程度上會(huì)限制其透皮吸收率。本研究中白芨外泌體粒徑為69.63 nm，天然納米級(jí)，易于穿過(guò)角質(zhì)層；且有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，可能包裹miRNA等核酸成分使其免受降解，從而可以在基因?qū)用鎸?duì)皮膚進(jìn)行調(diào)控，這是外泌體成為研究熱點(diǎn)的重要原因，也是今后研究的方向。因此將白芨外泌體易吸收、促細(xì)胞增殖、抑制凋亡的活性，與傳統(tǒng)白芨多糖凝膠保濕增稠及促修復(fù)的活性相結(jié)合，例如：形成白芨外泌體A液（小分子，易吸收，先涂抹），白芨多糖B液（大分子，保濕，后涂抹）。類似組合可能在護(hù)膚領(lǐng)域有一定的開(kāi)發(fā)潛能。

4 結(jié)論

本研究獲得了實(shí)驗(yàn)室條件下白芨外泌體的分離方法，明確其能促進(jìn)體外Hacat細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制H2O2引起的Hacat細(xì)胞凋亡且與通路蛋白caspase-9和caspase-3相關(guān)，為其他植物外泌體的提取提供參考，為白芨今后在護(hù)膚品領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)。