UPLC-Q-TOF-MS/MS 法分析鑒定雞血藤中藥復(fù)方提取物的化學(xué)成分

謝燦輝，賈德政，胥愛麗，鄔旻珊，肖觀林，畢曉黎，張素中，曹穎男*

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院 廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東 廣州 510095；3.廣州新華學(xué)院 藥學(xué)院，廣東 廣州 510520）

近年來癌癥的發(fā)病率逐年上升，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機體的免疫功能低下密切相關(guān)。一方面機體免疫系統(tǒng)可通過多種免疫效應(yīng)機制殺傷和清除腫瘤細(xì)胞；另一方面，腫瘤細(xì)胞也能通過多種機制抵抗免疫系統(tǒng)對其的殺傷與清除［1-2］。中藥在治療腫瘤方面具有副作用小、多靶點的特點，在提高機體免疫力方面有很大優(yōu)勢，因此，以中醫(yī)藥調(diào)護(hù)機體、增強免疫力來治療癌癥的方法越來越受關(guān)注。

雞血藤中藥復(fù)方選取臨床的抗腫瘤中藥驗方，在結(jié)合腫瘤病因確立的治則治法上優(yōu)化篩選出以雞血藤、重樓、莪術(shù)、柴胡組成的中藥復(fù)方（發(fā)明專利授權(quán)號CN106237265B），該中藥復(fù)方的抗腫瘤作用機制與免疫調(diào)節(jié)有高度相關(guān)性。盡管上述四味中藥均進(jìn)行過系統(tǒng)的化學(xué)成分分析，但中藥復(fù)方發(fā)揮治療作用具有多成分、多靶點、多途徑整體調(diào)節(jié)的特點，各藥味組成中藥復(fù)方后，其化學(xué)成分可能會發(fā)生變化，多味藥之間可能會產(chǎn)生相互作用從而生成新的化學(xué)成分［3］。因此，對中藥復(fù)方的化學(xué)成分進(jìn)行快速鑒定分析，獲取盡可能多的化學(xué)成分信息，對于研究化學(xué)成分與藥效之間的關(guān)系有十分重要的作用。

超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術(shù)廣泛用于中藥復(fù)方的多成分分析，具有靈敏度高、分辨率高、分離效率高和掃描速度快的特點，可為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供重要參考［4-5］。本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)，通過離子碎片推測化學(xué)成分可能的裂解途徑，實現(xiàn)對雞血藤中藥復(fù)方提取物中化學(xué)成分的快速分離鑒定，為進(jìn)一步研究雞血藤中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

阿魏酸（批號110773-201313，純度99.6%）、兒茶素（批號110877-201203，純度96.6%）、表兒茶素（批號110878-200102，純度99.7%）、原兒茶酸（批號110809-201906，純度97.7%）、原兒茶醛（批號813-9201）、咖啡酸（批號110885-200102）、柴胡皂苷a（批號110777-201510，純度93.2%）、柴胡皂苷d（批號110778-201208，純度94.6%）、大豆苷（批號111738-201302，純度91.3%）、大豆苷元（批號1502-200101）、綠原酸（批號110753-202119，純度96.2%）、重樓皂苷I（批號111590-202105，純度94.5%）、重樓皂苷Ⅱ（批號111591-201604，純度91.4%）、重樓皂苷Ⅵ（批號111592-201203，純度95.1%）、重樓皂苷Ⅶ（批號111593-202105，純度98.4%）、芒柄花素（批號111703-200603）、染料木苷（批號111709-201702，純度99.9%）、吉馬酮（批號111655-201204）、莪術(shù)醇（批號100185-200405）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；異綠原酸B（批號RDD-Y06911812012，純度98%）、隱綠原酸（批號AF9080321，純度98%）、新綠原酸（批號RDD-X01402112013，純度98%）對照品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；異綠原酸A（批號RDD-Y06911812012，純度98%）對照品購自成都瑞芬思德丹生物科技有限公司；柴胡皂苷b2（批號MUST-19032104，純度99%）對照品購自成都曼思特生物科技有限公司。以上未標(biāo)明純度的對照品的純度均大于98%。

實驗用水為屈臣氏蒸餾水，甲醇、乙腈、甲酸均為質(zhì)譜純（美國Fisher Chemical 公司），其余試劑均為分析純。雞血藤（批號210501，產(chǎn)地廣東）、北柴胡（批號220502，產(chǎn)地陜西）、莪術(shù)（批號220601，產(chǎn)地廣西）、重樓（批號220501，產(chǎn)地云南）購自廣州至信中藥飲片有限公司，以上藥材均經(jīng)廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院）劉法錦研究員鑒定。

Sorvall Legend Micro 17R 型微量離心機（美國Thermo Scientific 公司）；XS205 型電子分析天平（十萬分之一，瑞士Metter-Toledo 公司）；ExionLC AC 型液相色譜儀（日本島津公司）；X500R 質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）。

1.2 復(fù)方樣品制備

取莪術(shù)45 g，置于圓底燒瓶中，加入14倍量水，水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油5 h，冷卻后移取揮發(fā)油并冷藏。藥渣與60 g 雞血藤、45 g 柴胡、45 g 重樓置于圓底燒瓶中，加入6 倍量水，加熱回流2 h，提取3 次，合并水煎液，70 ℃減壓干燥至干。刮取干膏，將其研磨成細(xì)粉，噴入揮發(fā)油，即得雞血藤中藥復(fù)方樣品。

1.3 溶液配制

1.3.1 供試品溶液精密稱取雞血藤中藥復(fù)方樣品粉末0.25 g 置于錐形瓶中，加入70%甲醇10 mL，超聲處理30 min。將提取液以12 000 r/min 離心10 min，取上清液用0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得雞血藤中藥復(fù)方供試品溶液。

1.3.2 對照品溶液精密稱取各對照品適量，置于10 mL 棕色瓶中，甲醇超聲溶解，室溫放置澄清，以12 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得混合對照品溶液。

1.4 實驗方法及數(shù)據(jù)處理

1.4.1 色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。梯度洗脫：0～3 min，95%～85% A；3～7 min，85%～75% A；7～13 min，75%～67% A；13～24 min，67%～55% A；24～34 min，55%～35% A；34～36 min，35%～20% A；36～40 min，20%～2% A；40～44 min，2% A；44～45 min，2%～95% A；45～50 min，95% A。

1.4.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源（ESI）；正、負(fù)離子模式噴霧氣壓：5.5、-4.5 kV，裂解電壓：100、-80 V，毛細(xì)管電壓：5.5、-4.5 kV，碰撞能量：35、-35 eV，質(zhì)量掃描范圍：m/z100～1 000，離子源溫度：500 ℃，氣簾氣壓力：35 psi（1 psi≈6.895 kPa），霧化氣與輔助氣壓力：55 psi。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理通過查閱CNKI、SciFinder、ChemicalBook、PubChem、TCM systematic Pharmacology Database and Analysis Platform 等平臺或數(shù)據(jù)庫，對雞血藤中藥復(fù)方中化學(xué)成分的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行收集整理，構(gòu)建雞血藤中藥復(fù)方本地化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。采用SCIEX OS 3.1.0軟件進(jìn)行峰提取、峰匹配分析處理，在滿足質(zhì)量偏差≤5，同位素豐度比≤5，數(shù)據(jù)庫匹配得分≥90 的基礎(chǔ)上，與數(shù)據(jù)庫中化合物的準(zhǔn)分子離子峰、碎片裂解規(guī)律進(jìn)行對比分析，最終鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

雞血藤中藥復(fù)方提取物的UPLC-Q-TOF-MS/MS 總離子流圖見圖1。共鑒別出82種成分，包括黃酮類22種，苯丙素類24種，萜類25種，酚酸類4種，甾體類6種，氨基酸類1種。上述成分中，24種歸屬于雞血藤，16 種歸屬于莪術(shù)，27 種歸屬于柴胡，11 種歸屬于重樓，來源于多種藥味的成分有6 種。從雞血藤中藥復(fù)方中新發(fā)現(xiàn)的在處方藥材中未見報道的成分有10種（見表1）。

表1 雞血藤中藥復(fù)方提取物化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS 鑒定與分析Table 1 UPLC-Q-TOF-MS/MS identification and analysis of chemical components in Jixueteng formula extract

圖1 雞血藤中藥復(fù)方提取物在負(fù)（A）、正（B）離子模式下的基峰色譜圖Fig.1 Base peak chromatograms of Jixueteng formula extract in negative（A） and positive（B） ion modes

2.1 主要化合物的鑒定和歸屬

2.1.1 黃酮類黃酮類化合物是一種次生代謝產(chǎn)物，存在于各種植物中。其是以3個碳原子和2個苯環(huán)連接而成的化合物，并以C6-C3-C6結(jié)構(gòu)為基本母核。在雞血藤中藥復(fù)方中，黃酮類化合物的主要來源是雞血藤藥材。該類化合物是雞血藤抗腫瘤和抗貧血的主要活性成分。在電噴霧質(zhì)譜中，黃酮類化合物易脫去糖基，并丟失中性碎片離子-O、-CO、-H2O、-CO2。此外，也容易發(fā)生逆狄爾斯-阿爾德反應(yīng)（RDA）裂解［6］?；衔? 和13 在負(fù)離子模式下的分子離子峰均為m/z289.071 1［M-H］-，推斷其分子式均為C15H14O6，在裂解過程中脫落一分子CO2和一分子C6H6O2，形成m/z245.0818［M-H-CO2］-、m/z179.035 0［M-H-C6H6O2］-，兩個化合物互為同分異構(gòu)體。經(jīng)文獻(xiàn)［6］與對照品對比，確認(rèn)化合物9為兒茶素，化合物13為表兒茶素，兒茶素可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖2A?；衔?在負(fù)離子模式下的分子離子峰為m/z153.019 3［M-H］-，推斷分子式為C7H6O4，在二級質(zhì)譜中產(chǎn)生m/z109.028 9［M-H-CO2］-碎片離子，與文獻(xiàn)［7］及對照品比對，鑒定為原兒茶酸，可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖2B。異黃酮為黃酮類的異構(gòu)體，其母核為3-苯基色原酮，當(dāng)其結(jié)構(gòu)存在甲氧基取代時，在負(fù)離子模式下易產(chǎn)生CH3碎片?；衔?2 在負(fù)離子模式下的分子離子峰為m/z475.1234［M-H］-，在二級質(zhì)譜圖中產(chǎn)生m/z267.065 9［M-HC6H10O5］-和m/z252.043 2［M-H-C6H10O5-CH3］-碎片離子，通過質(zhì)譜信息與文獻(xiàn)［5］對比，推斷該化合物為芒柄花苷，可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖2C。

圖2 兒茶素（A）、原兒茶酸（B）、芒柄花苷（C）的質(zhì)譜裂解途徑Fig.2 Fragment pathways of catechin（A），protocatechuic acid（B） and ononin（C）

（續(xù)表1）

2.1.2 萜 類萜類化合物是自然界中重要的有機化合物之一，半萜類、單萜類、二萜類和三萜類等天然萜類化合物被發(fā)現(xiàn)具有強大的抗腫瘤、抗炎和抑菌活性。萜類化合物有多種母核類型，均由同一生源途徑衍生而來。大多數(shù)萜類化合物具有雙鍵、共軛雙鍵和活潑氫，許多萜類化合物還含有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。在雞血藤中藥復(fù)方中，萜類化合物的主要來源是莪術(shù)藥材，部分來源于重樓和柴胡?；衔?2在正離子模式下產(chǎn)生的分子離子峰為m/z219.1743［M+H］+，脫去1分子H2O生成碎片離子m/z201.1647［M+H-H2O］+，再脫去1 分子C6H8，生成碎片離子m/z105.0700［M+H-H2O-C6H8］+。經(jīng)與文獻(xiàn)［7］和對照品比對，確認(rèn)化合物82 為吉馬酮，可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖3A。化合物79 在正離子模式下的分子離子峰為m/z231.1369［M+H］+，二級質(zhì)譜中檢測到碎片離子m/z213.1273［M+H-H2O］+和m/z203.1439［M+H-C2H4］+，結(jié)合文獻(xiàn)［8］，推測為莪術(shù)酮，可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖3B。柴胡皂苷在負(fù)離子模式下常與羧酸形成加合離子，化合物57在一級質(zhì)譜中檢測到加合離子m/z825.4642［M+HCOO］-，在二級質(zhì)譜中出現(xiàn)未加合的分子離子峰m/z779.4558［M-H］-，脫去1 分子糖后，生成碎片離子m/z617.4051［M-H-Glu］-。經(jīng)與文獻(xiàn)［9］和對照品比對，確認(rèn)化合物57為柴胡皂苷a，可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖3C。

圖3 吉馬酮（A）、莪術(shù)酮（B）、柴胡皂苷a（C）的質(zhì)譜裂解途徑Fig.3 Fragment pathways of germacrone（A），curzerenone（B） and saikosaponin a（C）

2.1.3 苯丙素類苯丙素類化合物是一類由苯環(huán)和3個碳鏈連接而成的天然化合物，在植物中廣泛分布。在雞血藤中藥復(fù)方中，苯丙素類化合物主要來自柴胡藥材。大多數(shù)苯丙素類化合物是苯丙酸類化合物，在ESI 電離條件下與奎寧酸脫水成酯，并且易發(fā)生脫氧奎寧酸的中性丟失，從而生成相應(yīng)的苯丙酸碎片離子。以化合物8為例，在負(fù)離子模式下分子離子峰為m/z353.0878［M-H］-，通過酯鍵裂解，中性丟失咖啡?；?，產(chǎn)生奎寧酸分子離子m/z191.0563［M-H-C9H6O3］-，通過與文獻(xiàn)［10］和對照品比對，確認(rèn)為綠原酸，可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖4A?；衔?3在負(fù)離子模式下的分子離子峰為m/z193.0506［M-H］-，其二級質(zhì)譜碎片離子為m/z178.0274［M-H-CH3］-、m/z134.0369［M-H-CH3-CO2］-。結(jié)合裂解規(guī)律，并與文獻(xiàn)［11］和對照品比對，確認(rèn)化合物23 為阿魏酸，可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖4B?；衔?7 在負(fù)離子模式下的分子離子峰為m/z515.1195［M-H］-，失去1 分子C9H6O3得到m/z353.0882［M-HC9H6O3］-碎片離子，繼而發(fā)生脫氧奎寧酸的中性丟失，再失去1 分子C7H10O5，得到離子碎片m/z179.3040［M-H-C9H6O3-C7H10O5］-。通過與文獻(xiàn)［12］及對照品比對，確認(rèn)化合物27為異綠原酸A，可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖5。

圖4 綠原酸（A）和阿魏酸（B）的質(zhì)譜裂解途徑Fig.4 Fragment pathways of chlorogenic acid（A） and ferulic acid（B）

圖5 異綠原酸A的質(zhì)譜裂解途徑Fig.5 Fragment pathways of isochlorogenic acid A

2.1.4 甾體類甾體類化合物具有環(huán)戊烷并氫化菲的環(huán)系結(jié)構(gòu)，常與糖結(jié)合以皂苷的形式存在。雞血藤中藥復(fù)方中的甾體類化合物較少，主要來源于重樓藥材，其中重樓皂苷為主要的活性成分。重樓皂苷在質(zhì)譜條件下易發(fā)生脫糖基、H2O、CO2以及苷元等基團(tuán)，但較少出現(xiàn)分子離子加合峰及苷元的碎片峰信號?；衔?3 在正離子模式下產(chǎn)生分子離子峰m/z723.4314［M+H］+，在二級質(zhì)譜中得到m/z579.3153［M+H-Rha］+、m/z433.2575［M+H-Rha-Glu］+的碎片離子，經(jīng)與文獻(xiàn)［13］對比，推測該化合物為重樓皂苷V，可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖6A。化合物41 在正離子模式下檢測到的分子離子峰為m/z885.4842［M+H］+，在二級質(zhì)譜中可檢測到失去一分子葡萄糖的碎片離子m/z723.4321［M+H-Glu］+，該碎片離子失去一分子鼠李糖基得到碎片離子m/z579.3148［M+H-Glu-Rha］+，繼續(xù)丟失1個葡萄糖基得到碎片離子m/z415.3217［M+H-Glu-Rha-Glu］+。對比文獻(xiàn)［14］中的裂解規(guī)律，推測化合物41 為纖細(xì)薯蕷皂苷，可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖6B。

圖6 重樓皂苷V（A）和纖細(xì)薯蕷皂苷（B）的質(zhì)譜裂解途徑Fig.6 Fragment pathways of paris saponin V（A） and gracillin（B）

圖7 雞血藤中藥復(fù)方的10種新成分Fig.7 10 New components of Jixueteng formula extract

2.2 討 論

雞血藤中藥復(fù)方的化學(xué)成分復(fù)雜，以黃酮類、苯丙素類、萜類化合物為主，且大多數(shù)與腫瘤發(fā)病機制有關(guān)。黃酮類化合物有著廣泛的抗腫瘤機制，可通過抑制細(xì)胞增殖、對化療增效減毒、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬等多個機制起到抗腫瘤作用［15］。文獻(xiàn)表明，雞血藤中的芒柄花素、甘草素、表兒茶素等黃酮類成分可顯著抑制裸鼠移植模型中乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）的生長，同時還可抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［16］。苯丙素類化合物也具有廣泛的抗腫瘤作用。該類化合物主要來源于莪術(shù)和柴胡，以莪術(shù)醇為例，莪術(shù)醇具有非常好的抗腫瘤作用，可通過調(diào)控相關(guān)腫瘤的基因表達(dá)、抑制腫瘤組織血管的生成、影響細(xì)胞分化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖并阻止腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移等多種作用途徑來發(fā)揮抗腫瘤功效［17］。萜類化合物來源于柴胡與重樓，主要以皂苷類化合物為主，其中柴胡皂苷a、d 可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖和生長、提高機體免疫功能等方式發(fā)揮抗腫瘤作用，且在宮頸癌、肝癌、肺癌等研究中均表現(xiàn)出顯著的治療效果［18］；重樓皂苷可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序性死亡、增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性、抑制腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲、與其他藥物協(xié)同作用來發(fā)揮抗腫瘤作用［19］。

此外，在雞血藤中藥復(fù)方中還發(fā)現(xiàn)了藥材中未見報道的10種新成分，推測為中藥復(fù)方制備過程中多味藥的成分相互作用產(chǎn)生。化合物21 和69，根據(jù)其結(jié)構(gòu)式推斷為四環(huán)三萜類和五環(huán)三萜類化合物，這兩類化合物在抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、保肝和免疫調(diào)節(jié)方面顯現(xiàn)出較高的藥理活性［20］。芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷是由芹菜素的7位羥基結(jié)合1分子的β-D-葡萄糖醛酸而成，具有很強的抗癌、抗氧化等藥物活性［21］。木脂素類化合物為苯丙素類的一種，具有廣泛的生物活性，可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性、抑制細(xì)胞增殖、抗血管生成等抗腫瘤作用［22-23］?；衔?8、44、46、48、54、55、56 從結(jié)構(gòu)式可推斷為木脂素類化合物，由此推測可能與上述抗腫瘤藥效相關(guān)，其中，化合物44和54互為同分異構(gòu)體。雞血藤中藥復(fù)方中的抗腫瘤成分眾多，不同類型、不同來源的活性成分可通過協(xié)同或互補作用，實現(xiàn)多成分、多通路、多靶點綜合治療的效果。在本實驗中未能檢測到某些已知成分，可能與ESI的離子化效率有關(guān)。此外，部分難以區(qū)分的同分異構(gòu)體結(jié)構(gòu)只依靠四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行確認(rèn)存在一定的局限性。因此，需要進(jìn)一步結(jié)合其他波譜分析技術(shù)確認(rèn)這些成分的存在。

3 結(jié) 論

本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)分析雞血藤中藥復(fù)方提取物中的化學(xué)成分，通過本地數(shù)據(jù)庫與色譜峰信息對比分析，共鑒別出82種化合物，以黃酮類、苯丙素類、萜類化合物為主。并發(fā)現(xiàn)該復(fù)方藥材中未見報道的新成分10種，其藥理作用可能與雞血藤中藥復(fù)方的抗腫瘤功效相關(guān)。研究結(jié)果豐富和完善了雞血藤中藥復(fù)方的化學(xué)成分庫，為雞血藤中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及質(zhì)量控制方法建立提供了重要依據(jù)。