凋落物真菌Neocucurbitaria salicis-albae及其代謝產(chǎn)物的抗細(xì)菌活性

劉瑤，趙吳超，楊驍，寇雨心，都婷婷，陳秀青，秦夢(mèng)飛，徐利劍

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

真菌作為自然界重要的自然資源，分布范圍極其廣泛，其物種的多樣性十分豐富，而且在生態(tài)系統(tǒng)中也扮演了分解者等重要作用。隨著自然條件的變化和生物種群的繁衍，真菌作為自然界不可缺少的一部分，真菌的多樣性及組成也在不斷變化，從而使得真菌物種豐富，功能多樣。真菌物種數(shù)量非常龐大，目前估計(jì)有220 萬(wàn)至380 萬(wàn)種真菌，而已經(jīng)命名的真菌僅20 萬(wàn)種左右，其中多數(shù)真菌的活性與用途未被深入研究，所以真菌被認(rèn)為是重要的未被深入開(kāi)發(fā)的自然資源[1]。

真菌的次生代謝物作為天然產(chǎn)物，已經(jīng)在工業(yè)、醫(yī)藥、食品等諸多方面表現(xiàn)了很好的應(yīng)用潛力，因此，森林凋落物真菌資源逐漸受到重視[2-4]。2019—2022年，在大興安嶺森林凋落物中共報(bào)道真菌334 株，其中91株為尚未被描述的真菌[5-7]，張哲棟等[4]在2株凋落物真菌中分離出4個(gè)單體化合物，其中有3個(gè)單體化合物具有抗菌活性，有2 個(gè)化合物為首次從真菌的提取物中分離得到。SI等[8]在1株真菌中得到5個(gè)單體化合物，且都具有抗菌活性，其中3 個(gè)單體化合物為新結(jié)構(gòu)化合物。甄錦程等[9]在3株凋落物真菌中，共分離8個(gè)化合物，其中2個(gè)表現(xiàn)了抗菌活性，并且含有2個(gè)新化合物。以上研究表明大興安嶺真菌資源豐富，可以產(chǎn)生具有抗菌活性的化合物，但研究不夠廣泛與深入，目前尚有大量真菌資源未被嘗試開(kāi)發(fā)利用。

為了獲得大興安嶺森林凋落物中未開(kāi)發(fā)的真菌及其抗菌化合物，為防治植物病害提供備選菌株及其抗菌化合物，本研究從大興安嶺森林凋落物中分離鑒定了一株Neocucurbitaria屬真菌SGSF801，并從其發(fā)酵物中分離、純化并鑒定了一個(gè)具有抗植物病原菌活性的抗菌化合物，為大興安嶺森林凋落物真菌資源的利用，提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 樣品采集本研究的凋落物樣品采自于大興安嶺地區(qū)[2]。該地區(qū)主要的植物為樟子松(Pinussylvestris)，興安落葉松(Larixgmelinii)，水曲柳(Fraxinus mandshurica)白樺(Betulaplatyphylla)等。以每層4 cm至8 cm 的深度采集凋落物的樣品，共采集A、B、C 三層。將所采集的樣品分別裝入已經(jīng)滅菌過(guò)的信封袋里，對(duì)其進(jìn)行自然風(fēng)干，然后放入箱中保存。

1.1.2 供試微生物植物病原細(xì)菌：水稻黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)，丁香假單胞桿菌(Pseudomonassyringae)，青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)，植物病原真菌：細(xì)交鏈格孢菌(Alternariatenuis)，立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)，用于抗菌活性測(cè)試。供試培養(yǎng)基MEA、OA、PD、PDA、SM、SMAY、YMA 與大米培養(yǎng)基等，培養(yǎng)基配方參考邱天藝等[10]的研究。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 凋落物真菌的分離運(yùn)用顆粒涂布平板法[11]對(duì)凋落物真菌進(jìn)行分離。將所采集到的森林凋落物樣品充分研磨至小顆粒狀，隨后將其配置成懸浮液，按照一定梯度稀釋涂布在1/4 PDA培養(yǎng)基上，放置在25℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔12 h觀察一次，在無(wú)菌操作臺(tái)中挑出剛萌發(fā)的菌落至PDA培養(yǎng)基上，進(jìn)行真菌的培養(yǎng)純化。

1.2.2 凋落物真菌的鑒定運(yùn)用CTAB法[12]獲取真菌的DNA，采用引物ITS1 及ITS4 擴(kuò)增其內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(Internal Transcribed Spacer,ITS)，選用引物L(fēng)R0R和LR5 擴(kuò)增其核糖體大亞基基因序列(nuclear large subunit rDNA, LSU)，選用引物Bt2a 和Bt2b 擴(kuò)增其β-微管蛋白基因序列(β-tubulin,TUB2)。其中PCR 擴(kuò)增的體系和及引物序列等信息參見(jiàn)GAO 等[13]的方法。經(jīng)過(guò)測(cè)序，運(yùn)用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行真菌基因序列比對(duì)分析，確定該凋落物真菌的分類學(xué)地位。在形態(tài)學(xué)觀察方面，通過(guò)觀察在不同培養(yǎng)基上菌落顏色、質(zhì)地和分泌物，以及觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子的形狀、大小等特征，和相近真菌文獻(xiàn)進(jìn)行比較，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.3 菌株發(fā)酵及提取物制備 首先把菌碟接種在SMAY培養(yǎng)基中，放置于搖床里在180 r/min，25℃條件下振蕩培養(yǎng)3 d，然后分別吸取200μL菌液，接種到20 mL體系的SM、PD、PDA 及大米培養(yǎng)基中進(jìn)行菌株發(fā)酵。SM、PD發(fā)酵置于搖床180 r/min，25℃條件下培養(yǎng)14 d，PDA及大米培養(yǎng)基發(fā)酵置于25℃靜置培養(yǎng)21 d。真菌發(fā)酵結(jié)束后，加入20 mL 的乙酸乙酯，充分混勻，然后靜置24 h，通過(guò)減壓濃縮得到發(fā)酵提取物，使用1 mL的10%的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)作為溶劑，得到真菌發(fā)酵物的提取物溶液。

1.2.4 粗提物的抗菌活性測(cè)定運(yùn)用打孔藥劑擴(kuò)散法[14]測(cè)定真菌的抗菌活性。抗植物病原細(xì)菌：將搖好的菌液加入到溫度在50℃的LBA培養(yǎng)基中，倒平板后靜置4 h，待其凝固后用打孔器均勻打6 個(gè)孔。取10μL 發(fā)酵提取物溶液，加入孔中?？怪参锊≡婢河么蚩灼髟赑DA平板上均勻的打6個(gè)孔，中間接種植物病原真菌菌碟，其余同上。

1.2.5 化合物的分離與鑒定利用大米培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大發(fā)酵，利用乙酸乙酯進(jìn)行提取。將濃縮粗提物與等量的100～200 目硅膠混合均勻。風(fēng)干上樣進(jìn)行柱層析，使用二氯甲烷與甲醇溶液梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫2 L溶液，得到洗脫樣品S1～S30。利用薄層層析(TLC)法合并相似組分[15]，采用葡聚糖凝膠Sephadex LH20 層析柱，二氯甲烷與甲醇1:1比例配置洗脫溶液，洗脫流速約為8 s一滴。利用半制備液相(C18反向硅膠柱)甲醇-水系統(tǒng)進(jìn)行制備，HPLC 進(jìn)行化合物純度檢測(cè)，獲得高純度的單體化合物。隨后進(jìn)行核磁共振氫譜(1HNMR)分析與碳譜(13C-NMR)分析，查閱文獻(xiàn)，鑒定其結(jié)構(gòu)。

1.2.6 單體化合物測(cè)定最低抑菌濃度參照張哲棟等[4]研究方法。使用96 孔板對(duì)化合物最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)進(jìn)行測(cè)定，首先將單體化合物溶于5%的DMSO 溶液中溶解，然后倍半稀釋至不同濃度，添加至96孔板，3次重復(fù)，5%的DMSO 與金霉素分別作為對(duì)照。密封于25℃的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，24 h后開(kāi)始觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 凋落物真菌的分離與鑒定

從森林凋落物中分離出真菌SGSF801，經(jīng)多序列相似性分析，其最相近菌種為Neocucurbitariasalicisalbae（表1）。真菌SGSF801 在PDA 培養(yǎng)基上呈現(xiàn)橄欖綠色，YMA上呈白棕色，可產(chǎn)生厚垣孢子，與報(bào)道的形態(tài)學(xué)特征[16]存在一定的差異。真菌形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果如圖1 所示，結(jié)合分子鑒定結(jié)果，初步將其鑒定為N.salicis-albae的新株系。

圖1 形態(tài)學(xué)觀察

表1 多序列相似性分析結(jié)果

2.2 凋落物真菌的生長(zhǎng)速率分析

通過(guò)比較4 種培養(yǎng)基不同溫度下的生長(zhǎng)速率，發(fā)現(xiàn)SGSF801 在OA 培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)速度最快，其最適生長(zhǎng)溫度為20℃至25℃。不同培養(yǎng)基及不同溫度的生長(zhǎng)直徑如表2所示。

表2 不同培養(yǎng)基及不同溫度的生長(zhǎng)直徑 mm

2.3 粗提物的抗菌活性測(cè)定

SGSF801菌株粗提物的抗菌活性測(cè)定結(jié)果如表3所示。在抗植物病原細(xì)菌活性方面，4 種培養(yǎng)基發(fā)酵的粗提物都表現(xiàn)了不同程度的抗丁香假單胞菌和青枯勞爾氏菌的活性，在抗真菌方面，大米培養(yǎng)基粗提物表現(xiàn)了抗立枯絲核菌的活性，綜合比較選擇大米培養(yǎng)基作為擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)基。

表3 抗菌活性測(cè)定

2.4 單體化合物的結(jié)構(gòu)

對(duì)SGSF801菌株進(jìn)行大米培養(yǎng)基發(fā)酵，得到16.8 g粗提物。通過(guò)對(duì)粗提物抗菌活性追蹤分離得到1個(gè)單體化合物。該化合物的13C-NMR(101 MHz，CDCl3)共有16 個(gè)峰，化學(xué)位移值為δ 201.68、197.57、191.61、178.15、169.38、166.05、158.07、154.99、105.46、103.77、101.50、99.21、93.81、58.73、31.91、27.69。經(jīng)文獻(xiàn)查詢，該化合物的13C-NMR與1H-NMR波譜數(shù)據(jù)與化合物尾孢酰胺(Cercosporamide)的數(shù)據(jù)一致[17]，其分子式為C16H13NO7，其結(jié)構(gòu)式如圖2所示。

圖2 單體化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.5 單體化合物的MIC值測(cè)定結(jié)果

利用植物病原細(xì)菌青枯勞爾氏菌和丁香假單胞菌，對(duì)單體化合物進(jìn)行了MIC的測(cè)定，結(jié)果顯示該單體化合物對(duì)青枯勞爾氏菌的MIC值為31.25～62.5 μg/mL，對(duì)丁香假單胞菌的MIC值為125～250 μg/mL。

3 結(jié)論與討論

大興安嶺森林凋落物中具有大量未開(kāi)發(fā)利用的真菌資源[5-7]，本研究在大興安嶺森林凋落物中，分離鑒定了 一 株 真 菌N.salicis-albaeSGSF801。Neocucurbitaria菌屬隸屬于Cucurbitariaceae 菌科，該屬由WANASINGHE 等[18]建立于2017年，目前包括22個(gè)物種，可以腐生在灌木與喬木上。N.salicis-albae是由CROUS 等[16]基于其ITS、LSU 及TUB2 等序列分析結(jié)果，建立于2019 年，最初該物種發(fā)現(xiàn)于烏克蘭的白柳(Salixalba)樹(shù)枝上，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)該菌可以產(chǎn)生棕色球形分生孢子器，分生孢子為近圓柱形至梭形。菌株SGSF801雖然未見(jiàn)產(chǎn)生分生孢子器與分生孢子，但經(jīng)ITS、LSU 及TUB2 多序列分析發(fā)現(xiàn)SGSF801 的最相近菌種為N.salicis-albae，ITS與LSU的相似性都超過(guò)了99%，但是TUB2 其相似的相似性為97.54%與已知株系存在差異，由此將其鑒定為N.salicis-albae的新株系。關(guān)于Neocucurbitaria菌屬的天然產(chǎn)物化學(xué)方面，HU 等[19-20]在N.unguis-hominis提取物中分離到15個(gè)二萜類新化合物，但未見(jiàn)這些化合物具有明顯的抗菌活性，尚未見(jiàn)關(guān)于N.salicis-albae天然產(chǎn)物的報(bào)道。本研究首次嘗試分離N.salicis-albae的天然產(chǎn)物，在其大米發(fā)酵提取物中鑒定了一個(gè)抗菌化合物尾孢酰胺，該研究豐富了Neocucurbitaria菌屬的次生代謝物數(shù)據(jù)。尾孢酰胺最初分離于Cercosporidium henningsii[21]，后來(lái)也發(fā)現(xiàn)于真菌Verruculinaenalia中[17]，尾孢酰胺曾被發(fā)現(xiàn)可以選擇性地作用于Pkc1激酶，具有開(kāi)發(fā)成廣譜型抗真菌藥物的潛力[22]，但尚未見(jiàn)尾孢酰胺抗植物病原細(xì)菌丁香假單胞菌與青枯勞爾氏菌的報(bào)道，本研究為首次在Cucurbitariaceae 菌科真菌中發(fā)現(xiàn)尾孢酰胺，并且還證明了尾孢酰胺在離體情況下具有抗植物病原細(xì)菌的活性，但是否能在活體植株上表現(xiàn)出相同活性還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。在對(duì)SGSF801的次生代謝物分離過(guò)程中，還發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)類似萜類的化合物，且在預(yù)試驗(yàn)中表現(xiàn)出了抗菌活性和抗線蟲活性，由于條件有限未能純化出單體化合物，關(guān)于凋落物真菌SGSF801 的次生代謝產(chǎn)物的研究還有待深入。

綜上所述，本研究在森林凋落物上分離、培養(yǎng)、鑒定了N.salicis-albae的一個(gè)新株系，在它的大米發(fā)酵物中分離鑒定了1 個(gè)抗菌化合物——尾孢酰胺，并首次發(fā)現(xiàn)該化合物具有抗丁香假單胞菌與青枯勞爾氏菌的活性，其MIC為31.25～250 μg/mL。本研究結(jié)果，豐富了關(guān)于Cucurbitariaceae菌科尤其是Neocucurbitaria屬真菌抗菌次生代謝物的研究，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用大興安嶺凋落物真菌資源奠定了基礎(chǔ)。