甜菜酪氨酸代謝途徑關鍵酶的生物信息學研究

楊家琪，韓廣源，劉乃新，周芹

（1黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，哈爾濱 150080；2哈爾濱海關技術中心，哈爾濱 150023）

0 引言

酪氨酸代謝途徑是植物產(chǎn)生多種天然化合物的起點，如大豆中的生育酚[1]、甜菜中的甜菜堿[2]、黃連中的芐基異喹啉生物堿[3]、紅景天中的紅景天苷[4]、秋水仙中的秋水仙堿[5]等。其中，酪氨酸代謝產(chǎn)物生育酚、質(zhì)體醌、泛素是所有生物體中蛋白質(zhì)合成所必需的芳香族氨基酸，對于植物的生長發(fā)育具有至關重要的作用，然而，它只存在于植物、細菌和真菌中[6]。除了蛋白質(zhì)的合成之外，植物利用酪氨酸的代謝能夠產(chǎn)生具有不同特性的代謝物，如生育酚具有耐逆性[7]、甜菜堿能夠吸引傳粉者進行授粉[8]。據(jù)相關研究報道，酪氨酸代謝途徑的衍生化合物可以用作鎮(zhèn)痛藥（嗎啡）[9]、紫外線保護劑（黑色素）、抗氧化劑（維生素E）[10]等。

甜菜(BetavulgarisL.)屬于藜科甜菜屬二年生草本植物，是全球重要的糖料作物之一，每年有20%～30%的糖產(chǎn)自于甜菜[11]，其具有耐寒、耐鹽堿、抗旱和喜溫的特性，廣泛種植于中國的黑龍江、新疆和內(nèi)蒙古地區(qū)。甜菜不僅是食品工業(yè)的原材料，還是醫(yī)藥工業(yè)的重要原材料（例如治療帕金森病藥品（L-二羥基苯丙氨酸）的底物[12]）。甜菜中的甜菜堿是一種由甜菜胺酸合成酪氨酸衍生物[13]，在天然植物中，作為活性氧(ROS)的清除者，能夠保護植物免受細菌滲透造成的損害[14]；在人體中，具有對抗腫瘤、降脂保肝、保胃治肝、降低血壓的功能[15]；甜菜素又稱“甜菜花青素”是一種由L-酪氨酸衍生的水溶性含氮色素，對于植物顏色（黃、紅、紫）變化具有重要的作用[16]，并且其消炎能力和抗氧化性對人體健康有積極的影響[17]。因此，了解甜菜的酪氨酸代謝途徑有可能提高酪氨酸和對人體有益的酪氨酸衍生物的產(chǎn)量。盡管甜菜對人體有很多益處，但是目前關于甜菜在酪氨酸代謝途徑中對人體有益衍生物的研究主要集中于甜菜堿和甜菜素兩個方面[14]，其他酪氨酸衍生物鮮少有報導。為了了解甜菜酪氨酸代謝途徑中更多的有益酪氨酸衍生物，本研究以酪氨酸代謝途徑為研究背景，基于NCBI數(shù)據(jù)，利用生物學信息的方法對甜菜酪氨酸代謝中五種關鍵酶進行了比較分析，該研究為探索甜菜酪氨酸代謝途徑關鍵酶功能研究提供參考，為進一步研究甜菜基因組學奠定基礎。

1 材料與方法

通過查詢相關資料[18]了解到酪氨酸代謝途徑和5種關鍵酶(PPO、TAT、TYDC、HPPD、HPPR)，從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得關鍵酶的氨基酸序列，利用在線軟件ExPASy- ProtParam(expasy.org/ protparam/)分析甜菜酪氨酸代謝途徑中關鍵酶的理化性質(zhì)，再使用MEGA-7軟件將各個植物的同一種酶蛋白氨基酸序列間的相似性及演化距離進行對比，并且構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 序列檢索及理化性質(zhì)分析

2.1.1 多酚氧化酶(PPO) 多酚氧化酶參與植物的光合作用、生物合成及褐化等過程，特別是在酶促褐變過程中，多酚氧化酶具有關鍵性作用[19]。本研究在NCBI上下載了10 種植物的多酚氧化酶(PPO)氨基酸序列信息，使用ExPASy-ProtParam軟件對目標蛋白酶的理化性質(zhì)進行了分析，所得結果如表1所示。

表1 不同植物PPO的序列號及理化性質(zhì)

分析10種植物的PPO氨基酸數(shù)約含400～700個；相對分子質(zhì)量約為50.0k～160.0 kDa。等電點的范圍在4.68～7.20 之間，整體的酸堿度為中性偏酸性分布。10種植物的PPO穩(wěn)定性存在差異，馬鈴薯和芝麻的穩(wěn)定性較強，而其他8 種植物的穩(wěn)定性較弱。相對平均親水性皆為親水性蛋白（表1）。

2.1.2 酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(TAT) 酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是合成維生素E 的一個關鍵酶，維生素E 的含量與酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶呈正相關[20]。

分析10 種植物的TAT 氨基酸數(shù)約含400～430 個；相對分子質(zhì)量約為45.0k～48.0 kDa。等電點的范圍在5.04～5.96之間，整體的酸堿度為酸性分布。10種植物的TAT穩(wěn)定性存在差異，甜菜、彩葉草、歐洲油菜和薺菜的穩(wěn)定性較弱，而其他6 種植物的穩(wěn)定性較強。只有甜菜和辣椒的相對親水性為親水性蛋白，其他8 種植物均為疏水性蛋白（表2）。

表2 不同植物TAT的序列號及理化性質(zhì)

2.1.3 酪氨酸脫羧酶(TYDC) 酪氨酸脫羧酶是秋水仙堿合成的關鍵酶[21]。分析10種植物的TYDC氨基酸數(shù)約含100～530個；相對分子質(zhì)量約為13.0 k～57.0 kDa。等電點的范圍在4.80～7.56之間，整體的酸堿度為酸性分布，只有大豆為弱堿性。10種植物的TYDC穩(wěn)定性存在差異，擬南芥、大豆和薺菜的穩(wěn)定性較強，其他6種植物的穩(wěn)定性較弱。相對平均親水性中馬鈴薯、花生、大豆為疏水性蛋白，其他7種植物均為親水性蛋白（表3）。

表3 不同植物TYDC的序列號及理化性質(zhì)

2.1.4 對羥基苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD) 對羥基苯丙酮酸雙加氧酶能夠直接影響質(zhì)體醌和生育酚的合成，從而影響植物的生長發(fā)育[22]。分析10種植物的HPPD氨基酸數(shù)約含400～500 個；相對分子質(zhì)量約為46.0k～50.0 kDa。等電點的范圍在4.31～5.97 之間，整體的酸堿度為酸性分布。10 種植物的HPPD 穩(wěn)定性存在差異，大麥的穩(wěn)定性較強，其他9 種植物穩(wěn)定性均較弱。相對平均親水性均為親水蛋白（表4）。

表4 不同植物HPPD的序列號及理化性質(zhì)

2.1.5 羥苯基丙酮酸還原酶(HPPR) 迷迭香酸(RA)及其衍生物具有促進身體健康的特性[18]，例如保護心臟、抗氧化、抗菌等，而羥苯基丙酮酸還原酶是合成RA的關鍵酶。分析10 種植物的HPPR 氨基酸數(shù)約含300～500個；相對分子質(zhì)量約為33.0k～52.0 kDa。等電點的范圍在5.26～8.70之間，整體的酸堿度為中性偏堿性分布。10 種植物的HPPR 穩(wěn)定性存在差異，玉米、高粱、花生、辣椒、藜麥、大麥的穩(wěn)定性較強，甜菜、水稻、芝麻、大豆的穩(wěn)定性較弱。相對平均親水性方面甜菜、芝麻、大豆均為親水蛋白，其他6種植物均為疏水性蛋白（表5）。

表5 不同植物HPPR的序列號及理化性質(zhì)

2.2 系統(tǒng)發(fā)生分析

2.2.1 多酚氧化酶（PPO）由圖1 可知，甜菜與菠菜的PPO 親緣關系最近，表明它們在酪氨酸合成代謝途徑中的作用可能相似度較高。從PPO 蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹可以發(fā)現(xiàn)高梁和花生位于系統(tǒng)發(fā)育樹的最外圍，它們與其他8 種植物PPO 親緣關系最遠，表明這兩種植物與甜菜的PPO的結構和功能可能存在較大的差異。

圖1 10種植物PPO蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.2 酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(TAT) 由圖2可知，甜菜與大豆的TAT親緣關系最近，其次是玉米、薺菜，它們的分支長度和遺傳距離較為相近，表明它們在酪氨酸合成代謝途徑中可能具有相似的作用。

圖2 10種植物TAT蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.3 酪氨酸脫羧酶(TYDC) 由圖3可知，甜菜與馬鈴薯的TYDC 親緣關系最近，表明它們在酪氨酸合成代謝途徑中TYDC分子可能具有相似的結構和功能。因此，研究該代謝途徑的TYDC 時可以將甜菜與馬鈴薯進行比較。

圖3 10種植物TYDC蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.4 對羥基苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD) 由圖4 可知，甜菜與菠菜的HPPD 親緣關系最近，其次是歐洲油菜；而玉米單獨形成一組，與其他9 種植物沒有親緣關系稍微相近的分子，表明在酪氨酸合成代謝途徑中甜菜與玉米的HPPD 結構、功能可能存在較大的差異。

圖4 10種植物HPPD蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.5 羥苯基丙酮酸還原酶(HPPR) 由圖5 可知，甜菜與大麥的HPPR 親緣關系最近，這兩種植物的遺傳距離和分支長度相似，表明它們在酪氨酸合成代謝途徑中可能具有較高的相似性。

圖5 10種植物HPPR蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

近幾十年來，人們對甜菜的酪氨酸代謝途徑的生物合成及其相關酶和基因進行了廣泛的研究，使人們對這類代謝途徑的認識和利用取得了一些進展。對于甜菜等不同植物酪氨酸代謝途徑中的PPO、TAT、TYDC、HPPD、HPPR 的理化性質(zhì)分析表明，不同的蛋白質(zhì)分子構建的系統(tǒng)發(fā)育樹不能在不同的植物之間產(chǎn)生相同的進化關系。例如，甜菜與馬鈴薯的TYDC 進化關系最近，而它們的分子進化關系存在較大的差異。相同的代謝途徑下，不同的植物產(chǎn)生代謝物（酪氨酸）的含量也可能存在差異，因此關鍵酶的表達和序列的差異都可能影響代謝物的產(chǎn)生。

多酚氧化酶(PPO)廣泛分布于植物界，在大部分的蔬菜和水果中都已被檢測到。在植物中，PPO 主要位于葉綠體的類囊體膜上，是蔬菜、水果酶促褐變和黑色素合成的關鍵酶[23]。蔬菜、水果發(fā)生酶促褐變，容易引起產(chǎn)品水分、風味、色澤等變化，降低其經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值。根據(jù)PRECZENHAK 等[24]研究報道，甜菜堿由于具有較強的ROS清除劑能力和高抗氧化能力，能夠延緩蔬菜、水果的酶促褐變，保持該產(chǎn)品的社會價值，被認為是最重要的抗自由基化合物，而PPO 催化酪氨酸的羥化反應和多巴的氧化反應是甜菜堿合成的前提[25]，因此，甜菜在甜菜堿的作用下能夠保持較高的經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值。

酶酪氨酸脫羧酶(TYDC)是一種依賴吡哆醛-5'-磷酸(PLP)的芳香氨基酸脫羧酶，能夠催化L-酪氨酸(TYR)脫羧生成酪胺，酪胺對生物堿的形成具有重要的作用[26]，甜菜堿屬于生物堿的一種。根據(jù)彭靜葉對大花紅景天的研究表明提高TYDC的數(shù)量表達能夠有效的提高植物中紅景天苷的含量，從而增強植物的藥用價值[27]。目前，國內(nèi)外關于酶酪氨酸脫羧酶對甜菜的生長發(fā)育和營養(yǎng)價值影響的報道尚未發(fā)現(xiàn)，在甜菜中提高TYDC的數(shù)量是否也能增強該植物的藥用價值還有待進行深入的研究。

羥苯丙酮酸還原酶(HPPR)能夠催化4-羥苯丙酮酸(pHPP)還原為4-羥苯乳酸(pHPL)，是酪氨酸生物合成迷迭香酸(RA)的關鍵酶[28]。根據(jù)郭宇等[29]對紫蘇HPPR 基因擴增發(fā)現(xiàn)各種植物激素的響應元件在HPPR啟動子中存在，而激素能夠控制植物的生長、發(fā)育和抗逆能力。甜菜具有耐寒、耐旱等優(yōu)良的特性能夠在惡劣環(huán)境下種植，但是逆境脅迫（高溫、極度干旱等）會嚴重影響作物的生長發(fā)育，導致作物產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。通過調(diào)節(jié)甜菜HPPR基因表達可以提高甜菜的抗逆能力，雖然甜菜在這一方面的研究報道并未發(fā)現(xiàn)，但為今后的研究提供了一個研究思路。

甜菜體內(nèi)營養(yǎng)成分豐富多樣，不僅含有豐富的可溶性糖，還含有維生素E。維生素E，又名生育酚，是一種人體所必需的植物源性脂溶性維生素，僅在高等植物和其他產(chǎn)氧光養(yǎng)生物中合成，人體不能合成，必須從飲食中獲得[30]。在植物中，維生素E 能夠消除光合器官中自由基的數(shù)量，抵御脂肪氧化酶對脂類雙層膜的攻擊，保護生物膜和光合器官的完整性[31]。酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(TAT)和對羥基苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)是合成維生素E 的關鍵酶，JON 等[32]研究發(fā)現(xiàn)煙草中HPPD 的過量表達能夠增加煙草種子維生素E的含量，同時SANDORF 等[20]也發(fā)現(xiàn)增加TAT 的表達可以相應地提高維生素E 的含量?？偟膩碚f，修改HPPD 和TAT 基因表達可以調(diào)節(jié)植物組織中維生素E的含量。

本研究的不足之處在于選擇植物種類時，沒有考慮將相同物種的5 種關鍵酶進行比較，削弱了不同植物酪氨酸代謝途徑的可比性。這是因為并不是所有的植物在酪氨酸代謝方面都擁有一個完整的代謝途徑，或者某一些植物在PPO、TAT、TYDC、HPPD、HPPR 方面還未被測序研究。因此，在研究酪氨酸代謝途徑時，可以將同時擁有相同關鍵酶且關鍵酶的遺傳距離較近的不同植物進行對比，能夠幫助人們進一步了解酪氨酸代謝途徑的細節(jié)。

4 結論

從10種植物酪氨酸代謝途徑5種關鍵酶的理化性質(zhì)分析表明，甜菜在酪氨酸代謝途徑中的5 種關鍵催化酶均為不穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)；甜菜中TAT、PPD、HPPR等電點為偏酸性，TYDC 和PPO等電點為中性；相對分子質(zhì)量和氨基酸數(shù)均存在差異性。序列相似性分析結果表明：在PPO和HPPD方面，甜菜和菠菜的親緣關系最近，各項基礎性質(zhì)相近，在研究甜菜酪氨酸代謝途徑中PPO 和HPPD 方面，可以將菠菜作為參考植物。在TAT、TYDC、HPPR方面，甜菜與大豆、馬鈴薯、大麥的親緣關系最近，但是在理化性質(zhì)方面存在較大的差異，因此，在研究甜菜酪氨酸代謝途徑中TAT、TYDC、HPPR 方面，建議尋找其他植物作為參考物或者采用其他方法研究這三種酶。