放線菌4-1的鑒定及其發(fā)酵液抑菌作用和穩(wěn)定性探究

郭宇豪，劉紹波，葛菁萍,2，平文祥,2

（1黑龍江大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江省寒區(qū)植物基因與生物發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；2河北環(huán)境工程學(xué)院，河北省農(nóng)業(yè)生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島 066102）

0 引言

放線菌是產(chǎn)生抗生素的重要的微生物資源。其中鏈霉菌屬(Streptomycessp.)產(chǎn)生的抗生素物質(zhì)超過7000 種，占微生物來源的活性物質(zhì)的一半以上[1]。探索稀有放線菌并尋找有價(jià)值的活性物質(zhì)是目前的科學(xué)研究熱點(diǎn)[2]。

目前人們已經(jīng)從不同來源的放線菌中分離得到多樣化的抑菌物質(zhì)，例如從蛇藤(Kennedianigriscan)中分離得到內(nèi)生放線菌StreptomycesNRRL 30562[3]，其產(chǎn)生對結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)有抑制作用的抗生素物質(zhì)munumbicins A,B,C,D；從高良姜(Alpiniagalanga)的根部分離得到活性化合物Actinomycin D[4]，可以有效抑制香蕉炭疽病(Colletotrichummusae)[5]和白色念珠菌(Candida albicans)的生長[6]。放線菌MSU-2110(Streptomycessp.)分離自龜背竹(Monsterasp.)，其發(fā)酵產(chǎn)物中具有對植物病原真菌有抑制活性的多肽類抗生素coronamycin[7]。而來自于陜西秦嶺山區(qū)土壤中的放線菌Z139對小麥白粉病的保護(hù)作用達(dá)到98.6%，對其治療作用達(dá)到86.1%[8]。分離自京郊菜園土壤的吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)[9]，對果蔬灰霉病菌(Botrytiscinerea)[10]、番茄早疫病菌(Phytophthora infesta)[11]抑制作用相對較強(qiáng)。SINGH等[12]從印度哈里亞納邦的農(nóng)業(yè)土壤中分離出鏈霉菌活性微生物菌株，可以有效地抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的活性。

放線菌在土壤微生物中占有很大比例[13-14]，雖然土壤被認(rèn)為是分離不同潛力放線菌的極好來源，但目前國內(nèi)外研究重點(diǎn)是探索不同尋常和以前被忽視的生態(tài)系統(tǒng)[15]。因此極端環(huán)境中生長的微生物成為研究的側(cè)重點(diǎn)。極端環(huán)境包括強(qiáng)酸堿、高鹽度、高輻射、高溫和低溫等[16]。極端微生物產(chǎn)生的新型活性物質(zhì)使其對極端生活環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性[17]。由于極端環(huán)境中的特殊生存條件，使得極端微生物的物種、遺傳和代謝機(jī)制具有豐富的多樣性。并且為了適應(yīng)極端的生存環(huán)境，極端微生物具有產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)的潛力[18]。極端環(huán)境放線菌中的嗜鹽堿放線菌是一類適宜生存在一定的鹽濃度環(huán)境中的革蘭氏陽性細(xì)菌，已經(jīng)成為了目前極端環(huán)境放線菌研究的主要類群之一[19]。研究人員已從極端環(huán)境放線菌中發(fā)現(xiàn)了許多具有發(fā)展前景的優(yōu)異菌種[20-21]，但是大多數(shù)菌種受到生產(chǎn)應(yīng)用的限制。

課題組之前從黑龍江省肇東市錦繡大地試驗(yàn)基地土壤中分離獲得了若干放線菌。該地區(qū)地處北緯46°2'23.1''，東經(jīng)125°55'57.2''，土壤為堿化草甸土類型，pH高達(dá)9.90，鹽度含量達(dá)到0.12%，符合鹽堿地區(qū)的特點(diǎn)。本研究對其中高鹽脅迫下生長最好的4-1進(jìn)行菌株鑒定及發(fā)酵液抑菌活性和穩(wěn)定性測定。對分離自該生境下的放線菌種類及其產(chǎn)生的代謝物質(zhì)進(jìn)行摸索，將有利于擴(kuò)大極端環(huán)境下的微生物資源挖掘及利用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)用菌株

實(shí)驗(yàn)室前期從肇東市錦繡大地試驗(yàn)基地分離出10 株放線菌，經(jīng)過耐鹽脅迫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株4-1 在7%鹽含量下培養(yǎng)可以正常生長，說明其可以耐受高鹽脅迫，因此選用于后續(xù)試驗(yàn)。

指示細(xì)菌包括變形桿菌(Proteusvulgaris)，大腸桿菌(Escherichiacoil)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等。

指示真菌包括禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)，小麥赤霉菌(Gibberellazeae)，瓜果腐霉菌(Pythiummelonii)，辣椒根腐菌(Phytophthorapepper)等。

1.2 各菌株所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式

各指示細(xì)菌以1%接種量接入Beef extract Peptone(BP)培養(yǎng)基(g/L)后，37℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)24～48 h，獲得對數(shù)生長期菌體；各指示真菌點(diǎn)植于PDA培養(yǎng)基(g/L)中，30℃靜止培養(yǎng)后獲得菌絲體。將斜面保藏的放線菌4-1 菌株接種到ISP 2 培養(yǎng)基(g/L)（葡萄糖4 g，麥芽浸粉10 g，酵母提取物4 g，pH 7.2～7.4），28℃，140 r/min 下?lián)u床振蕩培養(yǎng)7 d，活化4-1 菌株。將過夜培養(yǎng)的4-1 菌株采用三區(qū)劃線的方法將菌株4-1 轉(zhuǎn)接到ISP 2 固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3 d。連續(xù)傳代培養(yǎng)3～5 代，分別挑取長勢良好的單菌落作為出發(fā)菌株，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

以瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，其中下層為2%的水瓊脂培養(yǎng)基，上層為半固體BP培養(yǎng)基。

淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、纖維素水解試驗(yàn)、硝酸鹽還原檢測、碳源利用試驗(yàn)所需培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[22]和[23]，在進(jìn)行碳源利用試驗(yàn)時(shí)，在培養(yǎng)基中加入0.5%(g/L)的葡萄糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、肌醇、甘露醇、甘露糖、鼠李糖。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤放線菌4-1的鑒定

（1）菌株4-1菌落形態(tài)及菌絲形態(tài)觀察

在ISP 2 液體培養(yǎng)基中接入菌株4-1 的單菌落，180 r/min 振蕩培養(yǎng)7 d，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；采用插片法制片，將菌絲完全覆蓋在載玻片上，置于顯微鏡下觀察其菌絲形態(tài)。

（2）菌株4-1分子生物學(xué)測定

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，目錄號DP307-02）提取菌株4-1 基因組DNA。以27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’)和1492R(5’-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)為擴(kuò)增引物，以細(xì)菌基因組為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，片段全長分別為1509 bp。

向PCR產(chǎn)物中加入0.25μLTaq DNA聚合酶(5 U/μL)，在72℃恒溫水浴下反應(yīng)10 min。用DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司，目錄號DP209）回收目的片段。以DL 2000 為Marker，擴(kuò)增結(jié)果通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將pMDTM18-T 載體與回收純化的PCR 產(chǎn)物16℃過夜連接，利用熱激法向E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)入連接產(chǎn)物，復(fù)蘇后梯度稀釋涂布于LB 瓊脂平板（200 mg/mL IPTG、100 μg/mL Amp 和20 mg/mL X-gal）上，37℃過夜培養(yǎng)進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。

在上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行菌液測序并上傳至NCBI進(jìn)行比對。選擇同源性相近種屬的序列信息下載，并利用MEGA4.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定放線菌4-1的種屬地位。

（3）生理生化特性測定

參照《放線菌的分類和鑒定》[24]對菌株4-1 進(jìn)行淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、纖維素水解試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、碳源利用試驗(yàn)，初步推測菌株4-1所在的種屬分類。

1.3.2 菌株4-1 生長曲線的繪制菌株4-1 活化后，按1%接種量接入ISP 2 培養(yǎng)基中，并每隔24 h 測定菌體干重，菌體干重(DCW)的計(jì)算見公式(1)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，DCW為縱坐標(biāo)繪制菌株的生長曲線。

1.3.3 4-1 發(fā)酵液抑菌活性測定將菌株4-1 以1%接種量接入ISP 2 培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)7 d，取1 mL發(fā)酵，4000 r/min，室溫離心10 min，取上清液備用。以添加ISP 2培養(yǎng)基作為對照組。

采用瓊脂擴(kuò)散法檢測病原性細(xì)菌抑菌活性，下層培養(yǎng)基為2%的水瓊脂，上層培養(yǎng)基為半固體BP。指示菌濃度為107cfu/mL，測量抑菌圈直徑，重復(fù)3 次。

采用菌絲生長速率抑制法檢測植物病原真菌抑菌活性。在加入發(fā)酵上清液的PDA 固體培養(yǎng)基中心點(diǎn)植直徑為4～5 mm 的供試真菌菌餅，培養(yǎng)7 d。以培養(yǎng)基作為對照，每個(gè)處理重復(fù)3 次。采用十字交叉法測定菌落直徑。菌絲生長抑制率見公式(2)：

1.3.4 4-1發(fā)酵液穩(wěn)定性的測定

（1）發(fā)酵液酸堿穩(wěn)定性測定。分別用l mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液將菌株4-1的發(fā)酵液調(diào)節(jié)至pH 2.0～12.0。在室溫下放置1 h 后，將各處理組的pH值調(diào)節(jié)到與原始菌株發(fā)酵液pH值相同(pH 7)，以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為指示菌，參照1.3.3 測定抑菌活性，以原始發(fā)酵液為對照，重復(fù)3 次。以相對抑菌活性評價(jià)抑菌能力。相對抑菌活性見公式(3)。

（2）發(fā)酵液熱穩(wěn)定性測定。將菌株4-1 發(fā)酵液于50、60、70、80、90、100℃下分別處理10 min 和30 min后，放置至室溫后測定其抑菌活性，以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為指示菌，參照1.3.3 測定抑菌活性，以原始發(fā)酵液為對照，重復(fù)3次。以相對抑菌活性評價(jià)抑菌能力。

（3）發(fā)酵液紫外線穩(wěn)定性測定。將菌株4-1 菌株發(fā)酵液靜置在波長254 nm，功率20 W的紫外燈下，高度為30 cm左右，放置時(shí)間為5、15、30、60、120 min，以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為指示菌，參照1.3.3 測定抑菌活性，以原始發(fā)酵液為對照，重復(fù)3次。以相對抑菌活性評價(jià)抑菌能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤放線菌4-1的鑒定

放線菌4-1 的革蘭氏染色結(jié)果為陽性（圖1A），菌絲粗細(xì)介于4.5±0.1～5.8±0.1 μm。菌落中間呈紫紅色，表面隆起且光滑，邊緣白色，菌落質(zhì)地柔軟。利用插片法觀察可見基內(nèi)菌絲纖細(xì)，易斷裂，氣生菌絲較粗，分化形成孢子鏈，孢子呈鏈狀且彎曲，有分支，孢子橢圓狀或長圓狀，表面光滑。單菌落形態(tài)及菌絲形態(tài)如圖1B所示。

圖1 4-1菌體形態(tài)A(1600×)以及單菌落B形態(tài)(640×)

2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

提取放線菌4-1 基因組及PCR 擴(kuò)增并測序后（圖2A），得到1329 bp 片段，選取30 條同源性高于99%的16S rDNA 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖2B 可知，與菌株4-1分支最近且相似度最高的是紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)。

圖2 16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖A以及系統(tǒng)發(fā)育樹B

2.3 菌株4-1生理生化特性

生理生化特性表明，菌株4-1 可以水解淀粉并液化明膠，不能產(chǎn)生過氧化氫酶、尿酶和硫化氫、不能還原硝酸鹽和分解纖維素。可以利用半乳糖、葡萄糖、肌醇、乳糖、甘露糖、麥芽糖、鼠李糖。NaCl 耐受范圍是0%～7%。

綜合形態(tài)、生理生化結(jié)果和16S rDNA測序結(jié)果，菌株4-1 初步鑒定為紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)。

2.4 紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)4-1對病原性細(xì)菌的抑制作用

采用瓊脂擴(kuò)散法測定了紫赤鏈霉菌(Streptomyces.puniceus)4-1 菌株發(fā)酵液對供試病原性細(xì)菌的抑制作用。由表1 可知，紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 發(fā)酵液對革蘭氏陽性細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用，對革蘭氏陰性菌的抑制作用較弱。其中金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)抑菌圈直徑最大，而且抑菌圈非常透明；對其余革蘭氏陽性菌的抑菌活性次之。在選取的供試革蘭氏陰性細(xì)菌中，僅對銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)有較強(qiáng)活性，但抑菌圈并不完全透明，僅為清晰。

2.5 紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)4-1對植物病原真菌的抑制作用

采用菌絲生長速率抑制法測定紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 發(fā)酵液對供試植物病原真菌的抑制作用。紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 對5 種供試真菌的抑制作用相對較弱（表2），有3 種供試菌株生長抑制率在50%以下，其中禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)的生長抑制率最高，達(dá)到了70%。

表2 紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)4-1發(fā)酵液對植物病原真菌菌絲生長的抑制作用

2.6 紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)4-1發(fā)酵液穩(wěn)定性測定

（1）酸堿對發(fā)酵液穩(wěn)定性的影響

紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 菌株的發(fā)酵液對酸堿穩(wěn)定性的測定結(jié)果如圖3 所示。發(fā)酵液pH在5～12之間時(shí)相對抑菌活性波動(dòng)小，在1 h后指示菌的相對抑菌活性約在94%～100%之間，與對照組的原始發(fā)酵液相差不大，差異不顯著(P>0.05)。在pH為2 時(shí)，相對抑菌活性為86.7%，與對照組差異顯著(P<0.05)。由此可見，紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1菌株的發(fā)酵液在中性和堿性條件下穩(wěn)定，在較強(qiáng)酸性條件下(pH 2～4)穩(wěn)定性較差。

圖3 紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)4-1發(fā)酵液的酸堿穩(wěn)定性

（2）熱對發(fā)酵液穩(wěn)定性的影響

紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 菌株的發(fā)酵液對熱穩(wěn)定性的測定結(jié)果如圖4所示。當(dāng)溫度處于50℃～90℃之間時(shí)，發(fā)酵液的抑菌成分有極強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，在80℃下仍有87.1%的相對抑菌活性。當(dāng)溫度大于90℃時(shí)，發(fā)酵液的相對抑菌活性低至75.1%，已有明顯下降，與對照組的原始發(fā)酵液差異顯著(P<0.05)，且隨著高溫時(shí)間的延長，相對抑菌活性也逐漸降低。由此可以看出，紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)4-1菌株發(fā)酵液的抑菌成分對溫度較耐受，但在高溫條件下(T>90℃)不穩(wěn)定。

（3）紫外線對發(fā)酵液穩(wěn)定性的影響

紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 菌株的發(fā)酵液對紫外線穩(wěn)定性的測定結(jié)果如圖5所示。在紫外線照射處理120 min 內(nèi)，與0 h 的原始發(fā)酵液相比，發(fā)酵液的相對抑菌活性均沒有太大的變化，差異均不顯著(P>0.05)。說明菌株發(fā)酵液的抑菌成分對紫外線有良好的穩(wěn)定性。

圖4 紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)4-1發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性

3 討論

本研究中所分離獲得的土壤放線菌4-1來自鹽堿地帶，通過形態(tài)、生理生化結(jié)果和16S rDNA基因序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)[25]，該菌株與紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)同源性最高。鏈霉菌屬(Streptomycessp.)是放線菌中分布最廣且產(chǎn)生抗生素種類最多的種屬之一[26]，具有重要的應(yīng)用價(jià)值[27]，因此也使本研究中獲得的4-1 具有更好地潛在應(yīng)用性。紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 發(fā)酵液對大部分革蘭氏陽性細(xì)菌和部分革蘭氏陰性細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用，然而這些作用在一定程度上受到環(huán)境變化的影響，這也是很多鏈霉菌發(fā)酵液的特點(diǎn)，同時(shí)與其他來源菌株相比，4-1發(fā)酵液的抑菌及穩(wěn)定性也具有較大優(yōu)勢。例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)WL2 菌株分離自馬鈴薯晚疫病病葉，具有抑制致病疫霉菌絲體生長的功能[28]，與紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 相比較，4-1發(fā)酵液在強(qiáng)堿性、高溫和紫外條件下有更好的穩(wěn)定性；而陳超等[29]分離出的葡萄座腔菌(Botryosp haeriadothidea)的發(fā)酵液熱穩(wěn)定性比紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1要更加穩(wěn)定，但酸堿和紫外穩(wěn)定性卻較差。趙雅等[30]分離出的貝萊斯芽胞桿菌(Bacillusvelezensis)HN-Q-8菌株的發(fā)酵液具有遠(yuǎn)超紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性，但在強(qiáng)酸強(qiáng)堿和紫外條件下的穩(wěn)定性卻難以與之相比。由此可以看出，紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)4-1的抑菌活性以及穩(wěn)定性受環(huán)境影響較大，其發(fā)酵液在酸堿和紫外條件下的生物活性遠(yuǎn)高于正常環(huán)境下的部分放線菌，且穩(wěn)定性也更強(qiáng)。但是相對而言，其熱穩(wěn)定性與正常環(huán)境下的放線菌相比卻略有不足，尤其當(dāng)溫度高于90℃以上時(shí)，發(fā)酵液抑菌活性明顯下降。紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 是生存于鹽堿地帶的放線菌，對于鹽堿脅迫有較高的耐受性。但可能長期馴化于北方寒冷氣候環(huán)境下，其代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性在高溫時(shí)會(huì)有所下降。

圖5 紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)4-1發(fā)酵液的紫外穩(wěn)定性

4 結(jié)論

研究表明本課題組從鹽堿環(huán)境中分離得到的菌株4- 1 經(jīng)綜合鑒定為紫赤鏈霉菌(Streptomyces puniceus)。菌株4-1對6株病原性細(xì)菌和5株病原性真菌有抑制作用，其發(fā)酵液對酸堿、熱、紫外線都有較好的穩(wěn)定性，但在強(qiáng)酸性條件(pH<4)以及高溫條件(T>90℃)下，發(fā)酵液抑菌活性下降。以上實(shí)驗(yàn)說明紫赤鏈霉菌(Streptomycespuniceus)4-1 在抑菌作用與穩(wěn)定性上有較大的開發(fā)價(jià)值，可為其抑菌作用的次生代謝產(chǎn)物的挖掘利用提供理論基礎(chǔ)和參考。