甘藍型油菜高亞麻酸CMS的快速選育方法及效果研究

張耀文，董育紅，關(guān)周博，韋世豪，李殿榮，李少欽，梁峰志

（陜西省雜交油菜研究中心，陜西楊凌 712100）

0 引言

亞麻酸攝入不足已成為中國人群亞健康、慢性疾?。ㄐ哪X血管疾病）發(fā)病率上升的一個重要原因[1-2]。由于缺乏ω3/Δ15脂肪酸脫氫酶(FAD)人體無法將亞油酸轉(zhuǎn)換成亞麻酸，因而必須依賴膳食中的亞麻酸來滿足人體的需求[3-5]。近年來亞麻酸的消費量迅速增加，但生物資源較少、亞麻酸的產(chǎn)出量受限，已成為制約亞麻酸產(chǎn)品廣泛應(yīng)用的障礙因素[6-7]，亟需尋找、開發(fā)新的亞麻酸資源來滿足市場對亞麻酸產(chǎn)品的需求。因具有不含膽固醇、抗氧化性較好、提取加工成本低等優(yōu)勢，植物源亞麻酸的應(yīng)用前景非常廣闊[6]。人體攝入50%以上的脂肪酸來自于食用油[5,8]，改善食用油的脂肪酸組成是提高人體亞麻酸攝入量的一條重要途徑[9-11]。菜籽油是中國居民的重要食用油源也是富含亞麻酸的常用植物油[8,11-14]，開展油菜高亞麻酸育種可有效緩解亞麻酸產(chǎn)品供給緊缺的現(xiàn)狀。然而，雙低育種（低芥酸、低硫苷）在從遺傳上除去菜籽（油）中占50%左右的芥酸的同時使亞麻酸含量降低23.81%、亞油酸含量增加92.31%，導(dǎo)致亞油酸與亞麻酸的比例從1.24:1 提高到3.13:1[9-11,14]；而營養(yǎng)學(xué)要求二者的比例為1:1。因而，基于營養(yǎng)健康的要求也需要提高菜籽（油）中的亞麻酸含量、改變亞油酸與亞麻酸的比例。2016年李殿榮提出在油菜育種中應(yīng)適當提高亞麻酸含量的建議[15]，隨后逐步形成了油菜高亞麻酸育種的概念和策略[11,16]。張耀文等[11]、LI 等[17]、于澄宇等[18]、余順波等[19]、陳俊坤等[20]均已篩選出亞麻酸含量高于15%的甘藍型油菜種質(zhì)。柴友榮等[21]、杜卓霖[22]分別在T3 代（導(dǎo)入紫蘇PfFAD3基因）、‘中雙11’（過表達亞麻薺FAD2和FAD3基因）中獲得亞麻酸含量高于30%的甘藍型油菜種質(zhì)。張耀文等[7]構(gòu)建了甘藍型油菜高亞麻酸種質(zhì)的篩選方法，育成高亞麻酸雜交種‘秦雜油7號’[11]。余順波等[19]、陳俊坤等[20]分別育成高亞麻酸油菜新品系‘908’、‘油研712號’。徐勁松等[23]、于澄宇等[24]分別提出了油菜高油酸與高亞麻酸聚合育種，抗草甘膦高亞麻酸油菜的選育方法。

雜種優(yōu)勢利用是提高油菜產(chǎn)量和品質(zhì)的重要途徑，細胞質(zhì)雄性不育(CMS)是油菜雜種優(yōu)勢利用重要的授粉控制系統(tǒng)之一[25]。由于CMS 提供了雜交種全部的細胞質(zhì)和1/2 的細胞核基因，因此CMS 的性狀對雜交種會有較大影響；對CMS性狀的改良已成為油菜雜種優(yōu)勢利用研究的重要內(nèi)容[26-28]?？偹苤?，油菜CMS 是原CMS 和保持系的雜交后代，每次測交的結(jié)果需要到下一個生殖生長季節(jié)才能獲知。CMS 的育性穩(wěn)定、基因純合都需要5～6代的轉(zhuǎn)育，因冬油菜屬于跨年度作物為“2年1熟”、春油菜為“1年1熟”，所以在常規(guī)條件下需要5～6年甚至更長時間才能獲得遺傳穩(wěn)定的CMS。CMS的品質(zhì)和農(nóng)藝性狀受原CMS的細胞質(zhì)和新（保持系）細胞核基因共同作用的影響，因細胞核中來源于保持系的基因比例不同、生長環(huán)境條件差異都會造成不同世代的CMS 的品質(zhì)和農(nóng)藝性狀發(fā)生較大變化，需要對其品質(zhì)農(nóng)藝性狀進行定向篩選才能獲得具有目標性狀的CMS。近紅外分析法、氣象色譜分析法均要求1 g以上的種子量才能進行亞麻酸含量的化驗分析，而常規(guī)轉(zhuǎn)育CMS獲得的種子量難以滿足化驗分析要求，因而對其進行定向篩選的工作較難開展。來自不同部位（主花序、分枝）種子的含油量、亞麻酸含量的差異會影響對CMS 單株進行篩選的準確性。CMS的育性會影響雜交種雜種優(yōu)勢的發(fā)揮，異交結(jié)實率會影響制種產(chǎn)量[29-31]，因此需要通過對不育性、異交結(jié)實性等進行綜合篩選才能獲得具有育種利用價值的CMS。同時，因傳統(tǒng)的選育方法對保持系進行了5～6代的連續(xù)自交會造成品質(zhì)、農(nóng)藝性狀發(fā)生退化，降低CMS、保持系在育種中的利用價值。綜上所述，亟需建立一種即能對含油量、亞麻酸含量進行定向篩選也能對育性和結(jié)實率的進行協(xié)調(diào)和平衡的快速、高效育種方法，篩選出可滿足油菜高亞麻酸育種實際需求的CMS。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

甘藍型油菜CMS陜6A（陜2A不育胞質(zhì)），高亞麻酸種質(zhì)（亞麻酸含量為17.6%）。

1.2 試驗方法

1.2.1 CMS 的轉(zhuǎn)育基于對育性、農(nóng)藝性狀比較，在盛花期從陜6A、測恢材料(17gh168)中分別選擇出優(yōu)異單株，去除主花序和倒1、2 分枝基部已開放的花蕾和上部的較小花蕾。在對將在2～3 d內(nèi)可開放的花蕾數(shù)進行統(tǒng)計后，用自交袋將不育株和對應(yīng)父本套在一起。從套袋后第2天開始，每天上午9:00—10:00、下午3:0—4:00 進行人工搖擺自交袋進行授粉，重復(fù)3～5 d。授粉結(jié)束3 d后拆除自交袋，讓F1代自然成熟。收獲前統(tǒng)計成角數(shù)。按單株收獲、化驗；依據(jù)表1的篩選指標對F1代進行篩選。在冬油菜、春油菜、溫室重復(fù)以上操作流程，最終獲得F5代、F6代CMS。

表1 不同世代CMS的篩選指標

1.2.2 保持系的選育利用高亞麻酸種質(zhì)(17gh168)與陜6A 進行測恢，根據(jù)F1代、F2代CMS 的育性、品質(zhì)和對該種質(zhì)的產(chǎn)量、品質(zhì)性狀遺傳穩(wěn)定性的分析結(jié)果，篩選出3個優(yōu)異單株進行混繁。

1.2.3 花器官的形態(tài)測量 在盛花期分別取不育系(YM-1A)、保持系(YM-1B)50朵完全開放的花朵，用游標卡尺測量花瓣長度、寬度、雄蕊長、雌蕊長；取平均值進行統(tǒng)計分析。

1.2.4 不育度與不育率調(diào)查在盛花期分別取不育系(YM-1A)、保持系(YM-1B)100 朵完全開放的花朵，按照侯國佐(1991)的方法與標準[31]進行不育度、不育率的調(diào)查和不育性級別的劃分。

1.2.5 結(jié)實系數(shù)測定將‘YM-1A’的分枝分成2 份；1份套袋自交，另1 份與‘YM-1B’進行人工授粉。分別記錄下處理的花蕾數(shù)，待成熟后統(tǒng)計有效結(jié)角數(shù)。按照“結(jié)實系數(shù)=有效角果數(shù)/處理的花蕾數(shù)”分別計算自交、異交結(jié)實系數(shù)。

1.2.6 產(chǎn)量和品質(zhì)測定對每個世代的不育系與保持系按單株收獲。用稱重法計算單株株產(chǎn)量。用近紅外分析法測定種子的含油量、亞麻酸含量。按照“亞麻酸產(chǎn)量=單株株產(chǎn)量×含油量×亞麻酸含量”計算單株亞麻酸產(chǎn)出量。

1.2.7 遺傳穩(wěn)定性分析用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件分別對‘YM-1B’和F5代、F6代CMS進行亞麻酸含量、含油量、單株產(chǎn)量、單株亞麻酸產(chǎn)量的遺傳穩(wěn)定性分析。

2 高亞麻酸保持系(YM-1B)和CMS(YM-1A)的篩選過程與效果

2.1 ‘YM-1B’的篩選過程與效果

如圖1 所示，2017 年7 月利用高亞麻酸種質(zhì)(17gh168)的8個株系與陜6A進行測恢，2017年9月按單株收獲、化驗分析。依據(jù)2018 年4 月對8 個F2代的育性鑒定結(jié)果和2017年9月、2018年6月的農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量、品質(zhì)分析結(jié)果，篩選出亞麻酸含量＞17.5%、含油量＞49%、單株產(chǎn)量＞20 g、單株亞麻酸產(chǎn)出量＞1.71 g 的3 個優(yōu)異單株17GH120（17gh69-3 自交）、122（17gh69-4 自交）、128（17gh69-7 自交）進行混繁（代號18GH220），收獲的種子用于后續(xù)轉(zhuǎn)育CMS。

圖1 甘藍型油菜高亞麻酸CMS和保持系的篩選過程

從表2 可知，該種質(zhì)的亞麻酸含量、含油量、單株產(chǎn)量、單株亞麻酸產(chǎn)量的表型變異在1.78%～4.19%之間，表明遺傳穩(wěn)定；確定其為保持系并命名為‘YM-1B’。

表2 高亞麻酸CMS和保持系的遺傳穩(wěn)定性分析結(jié)果

2.2 ‘YM-1A’的篩選過程

2.2.1 在春油菜區(qū)通過測恢獲得F1代2017年7月按照1.2.1的方法用17gh69的8個株系與陜6A進行測恢獲得F1代（圖1）。

2.2.2 在冬油菜區(qū)篩選、轉(zhuǎn)育出F2代2017 年9 月將8個F1代和對應(yīng)父本隔行種植，田間編號為17GH115-140。2018 年4 月選擇選擇不育度＞98%、不育率為100%；自交結(jié)實系數(shù)＜0.25、異交結(jié)實系數(shù)＞17.4；亞麻酸含量＞11.8%、含油量＞45.0%的4 個F1代[17GH119（陜6A×17gh69-3 自交）、17GH121（陜6A×17gh69-4 自交）、17GH125（陜6A×17gh69-5 自交）、17GH127（陜6A×17gh69-7 自交）]與對應(yīng)的父本[17GH120(17gh69-3 自交)、17GH122(17gh69-4 自交)、17GH125(17gh69-5自交)、17GH128(17gh69-7自交)]按照1.2.1的方法進行套袋雜交獲得F2代（圖1）。

2.2.3 在溫室進行篩選、轉(zhuǎn)育出F3代2018 年9 月選擇亞麻酸含量＞13.4%、含油量＞45.5%的4 個F2代與對應(yīng)父本隔行種植，田間代號為18GH388～395。2018年11 月將為4 個F2代(18GH388、18GH390、18GH392、18GH394) 及父本(18GH389、18GH391、18GH393、18GH395)移入溫室，編號為18GW1～8。2019年1月在選擇選擇不育度＞98%、不育率為100%的3 個F2代18GW3(GH390)、18GW5(GH392)、18GW7(GH394)與對應(yīng)父本18GW4(GH391)、18GW6(GH393)、18GW8(GH395)按照1.2.1的方法進行雜交獲得F3代（圖1）。

2.2.4 春油菜區(qū)篩選、轉(zhuǎn)育出F4代2019 年4 月選擇自交結(jié)實系數(shù)＜0.25、異交結(jié)實系數(shù)＞18.4；亞麻酸含量＞14.5%；含油量＞46.5%的3 個F3代單株(18GW3、GW5、GW7)與保持系(18GH220)隔行種植，田間代號為19gh65～70。2019年7月選擇不育度＞98%、不育率100%的2 個F3代19gh65(18GW5)、19gh69(18GW7)與保持系(19gh66、19gh70)按照1.2.1 的方法進行雜交獲得F4代（圖1）。

2.2.5 在溫室轉(zhuǎn)育、篩選出F5代2019 年9 月選擇亞麻酸含量＞15.39%；含油量＞47.3%的2 個F4代單株(19gh65、gh67)與保持系(18GH220)隔行種植在冬油菜區(qū)，田間代號為19GH283～286。2019年11月將為2個F4代(19GH283、285)及保持系(19GH284、GH286)移入溫室，編號為19GW1～4；2020 年1 月選擇選擇不育度＞98%、不育率為100%的2個F4代19GW3(19GH283)、19GW5(19GH285)與保持系19GW4(GH284)、19GW4(GH286)按照1.2.1的方法進行雜交獲得F5代（圖1）。

2.2.6 在冬、春油菜區(qū)分別轉(zhuǎn)育、篩選出F6代2020年4月、9 月選擇自交結(jié)實系數(shù)＜0.25、異交結(jié)實系數(shù)＞18.4；亞麻酸含量＞16.36%；含油量＞48.2%的F5代(19GW3)與保持系(18GH220)隔行種植于春、冬油菜區(qū)；在2020 年7 月、2021 年4 月分別按照1.2.1 的方法進行轉(zhuǎn)育獲得F6代（圖1）。

2.2.7 ‘YM-1A’的確立從表2可知，該CMS亞麻酸含量、含油量、單株產(chǎn)量、單株亞麻酸產(chǎn)出量的表型變異在2.98%～4.22%之間，說明遺傳穩(wěn)定。確定其為油菜高亞麻酸CMS并命名為“YM-1A”。

2.3 ‘YM-1A’的選育效果

2.3.1 花器官形態(tài)的測定結(jié)果表明‘YM-1A’屬于CMS不育系花器官形態(tài)是鑒別油菜雄性不育性的重要指標[27]。從表3可看出，較‘YM-1B’，‘YM-1A’的花朵直徑、花瓣長度、花瓣寬度分別降低12.74%、26.97%、31.44%，表明其花朵大小、花瓣長、寬均明顯變?。恍廴镩L度短57.98%而雌蕊長度無明顯差異則表明其雄蕊明顯退化而雌蕊發(fā)育正常?！甕M-1A’雄蕊長度與雌蕊長度之比為0.46即小于1/2，按侯國佐等[31]的育性分級標準可定為1級。

表3 ‘YM-1A’與‘YM-1B’的花器官形態(tài)比較

2.3.2 在選育過程中CMS 的品質(zhì)性狀明顯提高從F1代到F6代亞麻酸含量由11.85%提升至16.96%提高了43.12%，年平均增量為1.006 個百分點；不同世代間（年）的增長量逐步降低即F2-F1（1.60個百分點）＞F3-F2（1.11個百分點）＞F4-F3（0.93個百分點）＞F5-F4（0.87個百分點）＞F6-F5（0.6個百分點）。從F1代到F6代含油量由45.0%提升至48.8%提高了8.44%，年平均增量為0.759個百分點；不同世代間（年）含油量的增長量之間為F4-F3（0.98 個百分點）＞F3-F2（0.78 個百分點）、F5-F4（0.77個百分點）＞F6-F5（0.6個百分點）＞F2-F1（0.47個百分點）。從F1代到F6代單株亞麻酸產(chǎn)量由0.98 g提升至1.53 g提高了56.12%，年平均增量為0.112 g；不同世代間（年）增長量逐步降低即F2-F1(0.16g)＞F3-F2(0.14 g)＞F4-F3(0.12g)＞F5-F4(0.09g)＞F6-F5(0.04 g)（圖2）。

圖2 甘藍型油菜高亞麻酸CMS的篩選效果

2.3.3 ‘YM-1A’的品質(zhì)、結(jié)實性顯著提高如表4所示，‘YM-1A’的不育度為99.6%、不育率為100%，含油量為48.8%、亞麻酸含量為16.66%，說明‘YM-1A’符合高油、高亞麻酸CMS的標準。與陜6A相比，‘YM-1A’的含油量、單株產(chǎn)量分別提高8.45%、4.49%；亞麻酸含量、異交結(jié)實系數(shù)、單株亞麻酸產(chǎn)量分別提高59.43%、12.8%、80.65%；而自交結(jié)實系數(shù)則降低56.86%。

表4 ‘YM-1A’與陜6A的比較結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 本研究的方法可有效提高CMS 及保持系的選育效率

傳統(tǒng)轉(zhuǎn)育CMS的方法需要進行剝蕾、取粉、授粉、套袋、固定、松袋、拆袋等繁瑣的操作程序且需要5～6年甚至更長時間才能育成穩(wěn)定的CMS[27-28,30,32]，而本研究采用對父母本間的單株套袋雜交的方法造作較簡便，選育周期縮短為4 年。利用自交袋代替雜交袋有效提高了不育株的成角率、角粒數(shù)，使收獲的種子量可滿足化驗分析對種子量的要求，有利于對不同世代CMS進行含油量、亞麻酸含量的定向篩選。依據(jù)篩選目標，制定出不同環(huán)境、不同世代育性、結(jié)實性、品質(zhì)的篩選，對不同世代的CMS 進行單株間比較篩選，即可保證獲得具有目標性狀（育性、結(jié)實性、高亞麻酸）CMS 也可通過定向選擇逐步提高CMS 的含油量、亞麻酸含量及結(jié)實性。采用不同世代的CMS 的品質(zhì)指標（含油量、亞麻酸含量）與保持系的比值進行單株間的比較篩選，成功解決了因受不同世代、不同環(huán)境影響不同世代CMS 的品質(zhì)性狀難以比較的問題。通過對不同世代的CMS進行固定部位（種子）的結(jié)實率、品質(zhì)（含油量、亞麻酸含量）的定量比較，有效降低了測定結(jié)果間的差異，提高了篩選的準確性。采用對CMS進行自交結(jié)實系數(shù)、異交結(jié)實系數(shù)篩選的方法解決了需要對CMS 的育性和結(jié)實率進行的協(xié)調(diào)和平衡的問題。對保持系采用混合繁殖不僅可有效解決因連續(xù)5～6代自交造成的品質(zhì)、農(nóng)藝性狀發(fā)生退化的問題而且明顯減少了工作量。

3.2 ‘YM-1A’的不育性、結(jié)實性、品質(zhì)等性狀得到顯著提高

與陜6A（原CMS）相比，‘YM-1A’的不育度、不育率無顯著差異而異交結(jié)實系數(shù)提高12.88%、自交結(jié)實系數(shù)降低56.86%；亞麻酸含量、含油量、單株產(chǎn)量、單株亞麻酸產(chǎn)出量分別提高59.43%、8.45%、4.49%、80.65%，表明‘YM-1A’的不育性、品質(zhì)、結(jié)實性等性狀顯著提高。較F1代，F(xiàn)6代CMS的亞麻酸含量、含油量、單株亞麻酸產(chǎn)出量分別提高43.12%、8.44%、56.12%，其原因在于選用的保持系(YM-1B)在亞麻酸含量、含油量、單株產(chǎn)量、單株亞麻酸產(chǎn)量等性狀方面具有明顯的優(yōu)勢，印證了前人的利用優(yōu)良的保持系可顯著是改良CMS 性狀的結(jié)論[28-31]。在選育過程中，世代間（年）的亞麻酸量的增長量、單株亞麻酸產(chǎn)量均呈現(xiàn)出逐步降低的趨勢即F2-F1＞F3-F2＞F4-F3＞F5-F4＞F6-F5，其原因可能在于保持系(YM-1B)的亞麻酸含量、單株產(chǎn)量(17.52%、22.57 g)較陜6A(10.45%、17.82 g)分別高67.66%、26.66%即二者之間具有顯著差異；隨保持系基因?qū)肓康脑黾樱鸩娇s小。至于世代間（年）含油量的增長量表現(xiàn)出F4-F3＞F3-F2、F5-F4＞F6-F5＞F2-F1的原因可能在于不同的選擇環(huán)境對CMS 的含油量產(chǎn)生了一定影響。

3.3 ‘YM-1A’具有較高的育種利用價值

亞麻酸含量、含油量、單株產(chǎn)量、單株亞麻酸產(chǎn)出量的表型變異在2.98%～4.22%之間說明‘YM-1A’的表型性狀遺傳穩(wěn)定。CMS的育性、異交結(jié)實使判斷其育種利用價值高低的重要指標[29-32]。本研究對花器官形態(tài)的研究結(jié)果表明‘YM-1A’屬于CMS；不育度、不育率分別為99.6%、100%及自交結(jié)實系數(shù)為0.22 表明‘YM-1A’的不育性徹底；含油量、亞麻酸含量分別為48.8%、16.96%表明“‘YM-1A’的品質(zhì)較優(yōu)；亞麻酸單株產(chǎn)量為1.51 g、異交結(jié)實系數(shù)為18.5 表明‘YM-1A’的結(jié)實性較好。與陜6A相比，‘YM-1A’的含油量、單株產(chǎn)量、亞麻酸含量、異交結(jié)實系數(shù)、單株亞麻酸產(chǎn)量顯著或極顯著提高，自交結(jié)實系數(shù)極顯著降低則表明其的育種價值優(yōu)于陜6A。同時，由于在不同環(huán)境（冬油菜區(qū)、春油菜區(qū)、溫室）在的交互選擇，‘YM-1A’可同時適于冬、春油菜區(qū)的甘藍型油菜高亞麻酸雜交育種。隨后將利用‘YM-1A’進行優(yōu)勢組合的測配工作，以期盡快選育出甘藍型油菜高亞麻酸雜交種。

本研究的快速轉(zhuǎn)育方法明顯縮短了育種年限、提高了育種選擇效率。選育出的高油、高亞麻酸CMS‘YM-1A’具有較高的育種利用價值。