蘿卜黑腐病的病原鑒定及室內(nèi)藥劑篩選

楊利娟，高葦，李海燕，薛濤，張春祥，王勇

（1天津市農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，天津 300384；2天津市農(nóng)業(yè)發(fā)展服務中心，天津 300061；3揚州大學農(nóng)學院，江蘇揚州 225009）

0 引言

蘿卜是十字花科蘿卜屬一年生或二年生作物，是國內(nèi)重要的蔬菜作物之一[1]，在民間有“小人參”的美稱[2]。天津市種植蘿卜已有600 多年的歷史[3]，衛(wèi)青蘿卜是天津蘿卜的代表，最受人們的青睞，作為天津口岸獨有的傳統(tǒng)出口商品一直遠銷日本、東南亞和港澳等地區(qū)，并在2019年入選中國農(nóng)業(yè)品牌目錄。隨著經(jīng)濟發(fā)展和種植面積的擴大，現(xiàn)已形成西青區(qū)沙窩蘿卜、津南區(qū)葛沽蘿卜和武清區(qū)田水鋪蘿卜3個新的蘿卜主產(chǎn)地類型的衛(wèi)青蘿卜，均以設施栽培為主[4]。2021 年秋冬季在天津市西青區(qū)辛口鎮(zhèn)調(diào)研蘿卜病害發(fā)現(xiàn)，由于連茬種植和設施栽培小氣候條件的影響，一種不同于常見軟腐病癥狀[5-6]的細菌性腐爛病大面積發(fā)生，并逐年加重，嚴重地塊發(fā)病率50%以上，因農(nóng)戶病害診斷不明，選藥不準確，未能有效控制該病害的快速蔓延，嚴重影響蘿卜的品質(zhì)和產(chǎn)量，甚至部分地塊出現(xiàn)絕收。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，該病害發(fā)病癥狀與已報道的蘿卜黑腐病癥狀相似[7-9]，即病原菌主要危害葉和根，幼葉片發(fā)病一般從老葉開始向上蔓延，先從葉緣處產(chǎn)生黃色病斑，逐漸變成“V”字形向內(nèi)擴展，隨后全葉呈花斑網(wǎng)紋狀，葉脈變黑，逐漸枯黃，最后干枯腐爛；病菌沿葉脈和維管束向短縮莖和根部發(fā)展，肉質(zhì)根受侵染后，先是維管束呈放射狀，黑褐色，重者菌膿溢出，甚至干縮空洞。目前，尚無登記在蘿卜細菌性病害防治的藥劑，生產(chǎn)上常參考其他作物細菌性病害防治技術防治蘿卜細菌性病害，造成不科學用藥問題較為突出，抗性風險高，缺乏有效防治蘿卜細菌性病害技術?；谔旖虻貐^(qū)蘿卜該類細菌性病害病原及有效防治藥劑研究缺乏的現(xiàn)狀，本研究對該病害的病原進行組織分離、形態(tài)觀察、致病性測定及分子生物學鑒定，同時進行20種常見殺菌劑的抑菌試驗，以期篩選較好的殺菌劑，為該病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣來源

2021 年從天津市西青區(qū)辛口鎮(zhèn)采集大量蘿卜黑腐病發(fā)病植株。

1.2 供試藥劑

20個試驗藥劑分別是98%硫酸鏈霉素原藥（北京索寶來科技有限公司）、20%松脂酸銅水乳劑（江西禾益化工股份有限公司）、27.12%堿式硫酸銅懸浮劑（澳大利亞紐發(fā)姆有限公司）、86.2%氧化亞銅可濕性粉劑（天津市綠亨化工有限公司）、20%乙酸銅可濕性粉劑（山東省青島瀚生生物科技股份有限公司）、20%噻森銅懸浮劑（浙江東風化工有限公司）、15%絡氨銅水劑（天津博克百勝科技有限公司）、30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑（黑龍江省齊齊哈爾四友化工有限公司）、10%混合氨基酸銅水劑（霍州市綠洲農(nóng)藥有限公司）、30%王銅懸浮劑（山東省青島瀚生生物科技股份有限公司）、46%氫氧化銅水分散粒劑（科迪華農(nóng)業(yè)科技有限責任公司）、77%硫酸銅鈣可濕性粉劑（陜西湯普森生物科技有限公司）、20%噻菌銅懸浮劑（浙江龍灣化工有限公司）、80%代森鋅水分散粒劑（山東鑫星農(nóng)藥有限公司）、70%代森聯(lián)水分散粒劑（巴斯夫歐洲公司）、5%大蒜素微乳劑（成都新朝陽作物科學股份有限公司）、80%乙蒜素乳油（山東省德州祥龍生化有限公司）、6%低聚糖素水劑（海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司）、20%春雷霉素水分散粒劑（陜西華戎凱威生物有限公司）、0.3%四霉素水劑（遼寧微科生物工程股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣本采集2021 年12 月在天津市西青區(qū)辛口鎮(zhèn)采集蘿卜黑腐病發(fā)病植株，觀察并記錄發(fā)病癥狀，采集典型癥狀的發(fā)病植株放入采樣袋，帶回實驗室待病原菌的分離。

1.3.2 病原菌的分離純化取病健交界處組織，進行表面消毒后，采用平板畫線分離法在NA 培養(yǎng)基上分離純化，分離純化的菌株接入NA 試管中，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 病原菌的致病力鑒定將分離純化的5株菌株單菌落分別接種到液體NB培養(yǎng)基中，置于搖床中28℃、150 r/min培養(yǎng)至對數(shù)期，細菌濃度約108cfu/mL時，用移液器將菌液滴加健康蘿卜的橫切面上，3次重復，以無菌水為對照，置于28℃、75%RH培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況，對發(fā)病蘿卜進行病原菌的再分離。

1.3.4 分子生物學鑒定將分離獲得的5個菌株分別培養(yǎng)至對數(shù)期，采用TSINGKE TSE011 T5 Direct PCR Kit(Plant)提取基因組DNA，采用通用引物27F/1492R[10](5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’/ 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)進行擴增，將擴增獲得的產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進行測序，并將所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST序列比對，使用MEGA 5.2構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3.5 室內(nèi)生物活性測定采用K-B 濾紙片擴散法[11]，用NB 培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株LOC 并配制濃度為108cfu/mL的細菌懸浮液，吸取100 μL菌懸液滴加到直徑9 cm的無菌NA平板表面，用無菌玻璃涂布器均勻涂布，涂菌后室溫干燥3 min。用無菌水分別將供試藥劑配制成100、200、500、1000、2000、3000 mg/L（有效成分量）的藥液，用無菌鑷子夾直徑為6 mm 的滅菌濾紙片浸泡于配制好的藥液中，浸泡片刻后立即將紙片平放于直徑為9 cm含菌NA平板表面，每皿貼3張紙片，以浸泡滅菌水的滅菌濾紙片為對照，重復3次，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)36 h后觀察測量抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 田間癥狀

葉片上出現(xiàn)由邊緣擴展的黃色病斑，后期葉片整個黃化、干枯，葉柄上表現(xiàn)出黑褐色萎蔫干枯（圖1A～B）；蘿卜表面完好，切開后出現(xiàn)黑褐色水浸狀腐爛（圖1C），或是內(nèi)部中空、黑心、干枯（圖1D）；蘿卜內(nèi)部出現(xiàn)黑色點狀病變（圖1E）。

圖1 蘿卜黑腐病田間發(fā)病癥狀

2.2 病原形態(tài)特征

從病部分離純化的菌株在NA培養(yǎng)基上畫線培養(yǎng)48 h后出現(xiàn)形態(tài)一致的單菌落，初為淡黃色，后變?yōu)橄烖S色，有光澤，邊緣完整略有凸起（圖2A），革蘭氏陰性。

2.3 病原致病力鑒定

從病組織中分離純化到5 株細菌菌株，分別是LOA、LOB、LOC、LOD和LOE。將上述菌株分別接種到健康的蘿卜橫切面上，5株細菌菌株在接種后3～5 d均出現(xiàn)典型癥狀（圖2B），且病斑癥狀與田間癥狀一致，從接種后發(fā)病部位分離的菌株與供試細菌菌株的菌落特征相同，而接種無菌水的對照未見任何癥狀。

2.4 16S rDNA擴增及序列分析

將測序結果與NCBI 數(shù)據(jù)庫中序列進行BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)5 株菌株（LOA、LOB、LOC、LOD 和LOE）均與野油菜黃單胞桿菌野油菜黑腐病致病變種(Xanthomonascampestrispv.campestris)相似度達到99%。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，5 株菌株與Xanthomonas campestrispv.campestris聚在一個分支上，支持率為99%（圖3）。結合形態(tài)學特征和分子生物學鑒定結果，明確病原為野油菜黃單胞桿菌野油菜黑腐病致病變種(Xanthomonascampestrispv.campestris)。

圖3 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 病原對供試藥劑的敏感性測定

如表1 所示，在試驗濃度100～3000 mg/L（有效成分濃度，下同）范圍內(nèi)，供試的20種殺菌劑對蘿卜黑腐病病原的抑制作用不同。0.3%四霉素水劑對病原的抑制效果最好，在濃度為100 mg/L時對病原有明顯的抑菌圈，隨著濃度增加，抑菌圈增大，即抑菌效果增強；其次是80%乙蒜素乳油和98%硫酸鏈霉素原藥，在濃度500 mg/L時對病原有明顯的抑菌圈，在相同濃度下前者抑菌效果好于后者，隨著這2種殺菌劑濃度增加，抑菌圈增大；相較于前3種殺菌劑，20%松脂酸銅水乳劑、86.2%氧化亞銅可濕性粉劑、20%乙酸銅可濕性粉劑、20%噻森銅懸浮劑、15%絡氨銅水劑、70%代森聯(lián)水分散粒劑、6%低聚糖素水劑、30%琥珀肥酸銅可濕性粉劑、10%混合氨基酸銅水劑和30%王銅懸浮劑在更高濃度下可見抑菌圈，但都很?。欢?7.12%堿式硫酸銅懸浮劑、46%氫氧化銅水分散粒劑、77%硫酸銅鈣可濕性粉劑、20%噻菌銅懸浮劑、80%代森鋅水分散粒劑、5%大蒜素微乳劑和20%春雷霉素水分散粒劑在最高濃度3000 mg/L 時對病原仍無抑菌圈產(chǎn)生，無抑菌效果。

表1 20種殺菌劑對菌株LOC的抑菌效果mm

3 結論與討論

本研究分離自天津市西青區(qū)辛口鎮(zhèn)的蘿卜細菌性病害的病原，經(jīng)過形態(tài)觀察、致病性測定和16S rDNA序列分析，明確病原為野油菜黃單胞桿菌野油菜黑腐病致病變種(Xanthomonascampestrispv.campestris)，屬于細菌界薄壁菌門，與蘿卜黑腐病為同一種病原。據(jù)報道，該病原在國內(nèi)主要危害蘿卜、甘藍、白菜、芥菜、薺菜等10 余種十字花科蔬菜，該病原在種子、病殘體及土壤中越冬，通過帶菌菜苗、農(nóng)具或者暴風雨傳播，在重茬、排水不良、地勢低洼、早播等地塊病害加重[12-13]。因此，在蘿卜栽培管理前需要明確上茬種植情況，結合該病原傳播和侵染特性，在病害發(fā)生較重的地塊，合理安排與非十字花科作物進行輪作倒茬，減輕蘿卜黑腐病的發(fā)生與為害。

蘿卜黑腐病的防治方法主要包括農(nóng)業(yè)防治、物理防治和化學防治。農(nóng)業(yè)防治主要是選擇抗病品種，栽培管理上清除病殘體，與非十字花科蔬菜輪作?？购诟√}卜種子資源相對較少，劉釗[14]從30份蘿卜種質(zhì)中篩選出2 份高抗黑腐病材料‘貴妃脆B3×S3’和‘貴妃脆B12×A52’，抗病材料11 份；李建萍等[15]指出‘亞美白春’和‘日本耐病長龍’2 個品種可以推廣到實際生產(chǎn)中應用；Wu等[16]利用高密度遺傳圖譜定位到了2個與黑腐病抗性相關的QTL，奠定了抗黑腐病分子輔助育種的基礎。此外，田景芝等[17]在蘿卜地施用土壤調(diào)理劑有效改良了土壤理化性質(zhì)，提高了蘿卜抗黑腐病的能力，實現(xiàn)了提質(zhì)和增產(chǎn)。物理防治主要是蘿卜播種前采用50℃溫湯浸種25 min 處理種子?；瘜W防治主要有3個方面，一是采用化學藥劑種子處理，即采用種子重量0.2%的50%福美雙可濕性粉劑或35%甲霜靈拌種劑拌種[18]；二是土壤處理，播種前施50%福美雙可濕性粉劑[18-19]；三是采用化學藥劑噴施或灌根處理，是生產(chǎn)中使用最多的防治方法，已報道用在蘿卜黑腐病防治的藥劑有72%農(nóng)用鏈霉素可濕性粉劑500倍液、47%春雷·王銅可濕性粉劑700倍液、新植霉素100萬單位5000 倍液、50%瑞毒銅可濕性粉劑700 倍液、77%可殺得可濕性粉劑500 倍液和14%絡氨銅水劑300 倍液等[12,19-22]。在實際生產(chǎn)中，農(nóng)用硫酸鏈霉素對包括蘿卜黑腐病在內(nèi)的多種細菌性病害均有較高的防治效果而被廣泛應用[19-25]，因其對人類健康有風險，農(nóng)用硫酸鏈霉素在國內(nèi)已禁止生產(chǎn)使用，在2018年6月15日正式退出農(nóng)業(yè)市場[26]，造成在細菌性病害防治中依賴使用農(nóng)用鏈霉素的農(nóng)戶出現(xiàn)選藥經(jīng)驗缺乏等問題。

本研究評價了20 種常見殺菌劑對蘿卜黑腐病病原的抑菌效果，并以98%硫酸鏈霉素原藥為對照藥劑，比較供試殺菌劑的抑菌活性，為生產(chǎn)上蘿卜黑腐病的防治提供了理論參考。研究發(fā)現(xiàn)，供試殺菌劑的抑菌效果為0.3%四霉素水劑>80%乙蒜素乳油>98%硫酸鏈霉素原藥>20%松脂酸銅水乳劑>70%代森聯(lián)水分散粒劑>86.2%氧化亞銅可濕性粉劑>20%乙酸銅可濕性粉劑>6%低聚糖素水劑>20%噻森銅懸浮劑>15%絡氨銅水劑>30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑>10%混合氨基酸銅水劑/30%王銅懸浮劑，而27.12%堿式硫酸銅懸浮劑、46%氫氧化銅水分散粒劑、77%硫酸銅鈣可濕性粉劑、20%噻菌銅懸浮劑、80%代森鋅水分散粒劑、5%大蒜素微乳劑和20%春雷霉素水分散粒劑在濃度≤3000 mg/L時對蘿卜黑腐病沒有抑菌效果；僅0.3%四霉素水劑和80%乙蒜素乳油對病原的抑菌效果優(yōu)于98%硫酸鏈霉素原藥，可作為硫酸鏈霉素替代藥劑用于蘿卜黑腐病防治。本研究只進行了室內(nèi)生物活性測定，還有待進一步開展田間藥劑驗證試驗從多方面研究，以確定其科學使用技術，確保蘿卜的安全生產(chǎn)。