羅哌卡因?qū)Υ笫笾靖杉?xì)胞增殖、凋亡及成骨分化的影響觀察

王靜，唐琳，宋雙榮，蘇小麗，任麗潔，王萍

滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?？谇幌?，河北 滄州 061001

脂肪干細(xì)胞（adipose derived stem cell，ADSCs）來(lái)源于脂肪組織中非脂肪細(xì)胞的基質(zhì)血管成分，具有自我更新及多項(xiàng)分化潛能［1］，可分化為內(nèi)胚層、中胚層和外胚層三個(gè)譜系的細(xì)胞［2］，其釋放的生長(zhǎng)因子、miRNA及外泌體可調(diào)節(jié)細(xì)胞的微環(huán)境，具有抗炎和促進(jìn)血管生成的作用［3］。ADSCs易于自體取材、來(lái)源廣泛、免疫源性低，目前已被廣泛用于骨組織工程、創(chuàng)面治療和骨質(zhì)疏松癥骨缺損修復(fù)［4-6］。目前臨床上主要通過(guò)脂肪抽吸術(shù)或脂肪切除術(shù)來(lái)獲取脂肪組織，采用酶消化法將脂肪組織分離、培養(yǎng)，獲得ADSCs。在手術(shù)獲取人脂肪組織時(shí)，需要對(duì)患者進(jìn)行局部腫脹麻醉或局部浸潤(rùn)麻醉。酰胺類局麻藥物羅哌卡因，具有藥效時(shí)間長(zhǎng)、鎮(zhèn)痛作用好、不良反應(yīng)小且不影響運(yùn)動(dòng)功能等特點(diǎn)，是整形外科常用的局部麻醉藥。目前羅哌卡因?qū)DSCs生物學(xué)特性的影響尚無(wú)深入報(bào)道。由于大鼠與人類脂肪組織的細(xì)胞生物學(xué)特性相似，且涉及的倫理問題少，2022年1月—2023年6月，我們觀察了羅哌卡因?qū)Υ笫驛DSCs增殖、凋亡及成骨分化的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 羅哌卡因、大鼠、試劑 羅哌卡因購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。雄性SD大鼠購(gòu)于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，L-DMEM、胎牛血清FBS、Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，CCK-8購(gòu)自博士德公司，Annexin V APC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BioGems公司，堿性磷酸酶（ALP）試劑盒購(gòu)自碧云天公司，骨鈣素（OCN）單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，抗壞血酸、地塞米松、β-磷酸甘油鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 大鼠ADSCs的提取、培養(yǎng)與分組 安樂死處死SD大鼠3只，迅速分離出腹股溝及附睪周圍的脂肪組織，剪成漿糊狀后加入Ⅰ型膠原酶，37 ℃消化60 min，篩網(wǎng)過(guò)濾后1000 r/min離心10 min，DMEM重懸細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液一次，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)胰蛋白酶消化并傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ADSCs，胰酶消化、離心后棄上清，取100 μL濃度為2×1010/L的細(xì)胞懸液移入96孔板，分別加入含0 mg/mL、200 mg/mL、500 mg/mL羅哌卡因的培養(yǎng)基100 μL，使羅哌卡因的終濃度分別為0 mg/mL、200 mg/mL和500 mg/mL，分別記為對(duì)照組、200 mg/mL組、500 mg/mL組。

1.3 各組細(xì)胞增殖能力觀察 采用CCK-8實(shí)驗(yàn)。取各組細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，向每孔加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃孵育1.5 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)的OD值，以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖能力。

1.4 各組細(xì)胞凋亡情況觀察 取各組細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，胰酶消化細(xì)胞，染色緩沖液清洗，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，吸取100 μL細(xì)胞懸液，分別加入5 μL Annexin V和7-AAD溶液，混勻后避光孵育15 min，加入400 μL Annexin V結(jié)合緩沖液，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.5 各組細(xì)胞成骨分化能力觀察 取各組細(xì)胞，加入等量的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含0.1 μmol/L地塞米松、0.05 g/L抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉），每3天換培養(yǎng)基一次，觀察各組細(xì)胞成骨分化能力，包括成骨潛能、礦化能力和成骨相關(guān)蛋白OCN表達(dá)水平。

1.5.1 各組細(xì)胞成骨潛能觀察 連續(xù)誘導(dǎo)7 d，棄原培養(yǎng)基，TritonX-100裂解細(xì)胞40 min，提取上清液，按照ALP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm下的OD值，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的濃度，即為ALP活性，以ALP活性表示細(xì)胞成骨潛能。

1.5.2 各組細(xì)胞礦化能力觀察 連續(xù)誘導(dǎo)14 d，4%多聚甲醛4 ℃固定細(xì)胞25 min，PBS緩沖液沖洗三遍，40 mmol/L茜素紅（pH 4.1）室溫染色20 min，倒置顯微鏡下觀察拍照，之后用10%氯化十六烷基吡啶溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定562 nm波長(zhǎng)處OD值，以O(shè)D值表示細(xì)胞礦化能力。

1.5.3 各組細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白OCN檢測(cè) 采用免疫熒光法。連續(xù)誘導(dǎo)14 d，多聚甲醛固定細(xì)胞25 min，PBS緩沖液沖洗，0.5% Triton X-100透膜處理15 min，PBS緩沖液清洗，5%BSA封閉1 h，PBS緩沖液清洗，加入一抗OCN（1：100）孵育，4 ℃過(guò)夜，PBS緩沖液清洗，加入相應(yīng)二抗（1：50），避光孵育1 h，DAPI染色15 min，共聚焦顯微鏡觀察拍照，用Image J軟件進(jìn)行免疫熒光定量分析，以熒光強(qiáng)度表示細(xì)胞OCN蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料呈正態(tài)分布時(shí)以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞OD值比較 各組細(xì)胞OD值比較見表1。由表可知，與對(duì)照組相比，200 mg/mL組、500 mg/mL組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)的OD值均顯著下降，且500 mg/mL組低于200 mg/mL組。

表1 各組細(xì)胞OD值比較（±s）

表1 各組細(xì)胞OD值比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與200 mg/mL組比較，#P＜0.05。

組別對(duì)照組200 mg/mL組500 mg/mL組OD值72 h 1.616 ± 0.0211.299 ± 0.001*1.026 ± 0.004*#24 h 1.093 ± 0.0600.734 ± 0.030*0.519 ± 0.010*#48 h 1.357 ± 0.0050.936 ± 0.025*0.773 ± 0.009*#

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 對(duì)照組、200 mg/mL組、500 mg/mL組細(xì)胞凋亡率分別為2.78% ±0.23%、4.15% ± 0.62%、5.88% ± 0.78%，組間相比，P均＜0.05。

2.3 各組細(xì)胞成骨分化能力比較

2.3.1 各組細(xì)胞成骨潛能比較 對(duì)照組、200 mg/mL組、500 mg/mL組細(xì)胞ALP活性分別為（0.385 ± 0.005）、（0.233 ± 0.005）、（0.195 ± 0.005）mmol/（g·min），組間相比，P均＜0.05。

2.3.2 各組細(xì)胞礦化能力比較 對(duì)照組、200 mg/mL組、500 mg/mL組細(xì)胞OD值分別為0.457 ± 0.040、0.388 ± 0.003、0.226 ± 0.001，組間相比，P均＜0.05。

2.3.3 各組細(xì)胞OCN蛋白表達(dá)水平比較 對(duì)照組、200 mg/mL組、500 mg/mL組細(xì)胞OCN蛋白表達(dá)水平分別為96.354 ± 0.367、84.926 ± 0.138、74.095 ± 0.046，組間相比，P均＜0.05。

3 討論

隨著組織工程與再生醫(yī)學(xué)、干細(xì)胞理論與技術(shù)的發(fā)展，ADSCs已被廣泛用于各種組織缺損與疾病治療。CAETANO、陳立峰等將ADSCs與新型支架組合，發(fā)現(xiàn)“支架—干細(xì)胞復(fù)合體”修復(fù)骨組織缺損效果更好，骨再生更為明顯［7-8］。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞在治療肝硬化、肝衰竭以及對(duì)肝移植后排斥反應(yīng)中也已經(jīng)獲得了臨床有效性的結(jié)果［9-10］。

羅哌卡因是一種長(zhǎng)效酰胺類局部麻醉藥，可通過(guò)與特定受體結(jié)合，阻滯鈉離子通道，抑制鈉內(nèi)流，可逆地抑制神經(jīng)興奮的產(chǎn)生和傳導(dǎo)，發(fā)揮有效的麻醉鎮(zhèn)痛作用。但是當(dāng)羅哌卡因給藥劑量過(guò)大時(shí)，會(huì)出現(xiàn)一定的不良反應(yīng)，且局麻藥的不良反應(yīng)呈濃度依賴性。與布比卡因相比，等量的羅哌卡因被認(rèn)為不太可能引起肌肉毒性和全身毒性，包括神經(jīng)毒性和心臟毒性［11］。由于個(gè)體差異，患者對(duì)麻藥的耐受程度不同，羅哌卡因的安全濃度為200～750 mg/mL，被廣泛應(yīng)用于各種麻醉處理［12-13］。洪婷婷等［14］研究顯示，300 mg/mL羅哌卡因效果確切，能有效緩解疼痛，不良反應(yīng)發(fā)生率低。鑒于此，本課題選用200 mg/mL、500 mg/mL兩個(gè)濃度，研究其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。

羅哌卡因可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［15-17］。羅哌卡因可影響細(xì)胞的生物學(xué)特性，包括抑制細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期等。在本研究中，CCK-8結(jié)果顯示羅哌卡因呈濃度依賴性降低ADSCs的增殖能力。cyclinD1蛋白在細(xì)胞周期的調(diào)控中起關(guān)鍵作用，羅哌卡因可通過(guò)下調(diào)cyclinD1的蛋白水平，阻止細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)移，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)［18-19］。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的過(guò)程，貫穿整個(gè)生命過(guò)程，可受細(xì)胞內(nèi)外部多種因素調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，錯(cuò)誤折疊的蛋白會(huì)增多，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，通過(guò)激活下游細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)分子，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［20-21］。在本研究中，隨著羅哌卡因濃度的增高，細(xì)胞的凋亡率顯著增高。其具體作用機(jī)制可能與以下幾種因素有關(guān)［22-27］：①酰胺類麻醉藥物羅哌卡因?qū)儆诟叨扔H脂性分子，可破壞細(xì)胞膜的通透性，且濃度越高，破壞程度越大，因此羅哌卡因?qū)?xì)胞凋亡的影響呈濃度依懶性。②羅哌卡因可通過(guò)影響鈉離子電流，改變跨膜電位，影響細(xì)胞的能量代謝。③羅哌卡因還可能通過(guò)抑制IkB-NF-κBICAM-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，干擾細(xì)胞線粒體中的能量代謝，抑制細(xì)胞間的有效通訊，實(shí)現(xiàn)對(duì)抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用的。OCN是成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)向礦化期分化的重要標(biāo)志性蛋白，在骨形成過(guò)程中可調(diào)節(jié)晶體生長(zhǎng)，被用于評(píng)價(jià)細(xì)胞后期的成骨分化水平。本研究結(jié)果顯示，羅哌卡因呈濃度依賴性降低了ADSCs的成骨分化能力。關(guān)于其具體作用機(jī)制，還需進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，羅哌卡因可降低ADSCs的增殖能力、成骨分化能力，促進(jìn)其凋亡，且濃度越高，抑制能力越強(qiáng)。因此，在臨床進(jìn)行脂肪抽吸術(shù)操作時(shí)，要在保證麻醉的前提下，盡量的降低羅哌卡因的濃度，以減少對(duì)ADSCs的毒性作用，維持細(xì)胞正常的生物學(xué)特性。