TMEM206基因敲除小鼠小腦組織中差異表達(dá)基因的篩選及生物學(xué)功能分析

陸盈，孫順昌，2

1 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025；2 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院無錫分院檢驗(yàn)科

質(zhì)子活化型Cl-（proton-activated Cl-， PAC）通道是新發(fā)現(xiàn)的一種Cl-通道，由3分子跨膜蛋白206（transmembrane protein 206， TMEM206）單體組成，可將Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，但其在細(xì)胞中的功能尚未完全清楚［1］。體外研究［2］顯示，PAC通道在pH值降至6.2時(shí)開始激活，PAC通道在酸性條件下被激活后，將Cl-從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或分泌囊泡內(nèi)排出，防止內(nèi)體腔過酸，病理?xiàng)l件下如缺血性卒中和腫瘤組織內(nèi)，pH值較低，PAC通道也可被活化，可將Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞容積增大，甚至腫脹死亡［3］。TMEM206蛋白氨基酸序列在脊椎動(dòng)物中高度保守，且在人體各組織中廣泛分布，以腦組織中相對(duì)含量最高，提示其或許有類似管家基因的功能。TMEM206蛋白含2個(gè)跨膜螺旋和1個(gè)富含β折疊的胞外結(jié)構(gòu)域，TMEM206蛋白的N-端和C-端位于胞內(nèi)側(cè)［4］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，ataxin-1蛋白與TMEM206蛋白存在相互作用，小腦組織浦肯野細(xì)胞中ataxin-1蛋白的編碼基因ATXN1基因突變是1型脊髓小腦型共濟(jì)失調(diào)（spinocerebellar ataxia type 1， SCA1）發(fā)病的分子基礎(chǔ)，我們推測(cè)TMEM206蛋白可能與SCA1的發(fā)病有關(guān)，因此有必要探討TMEM206基因的功能。2022年10月—2023年5月，我們通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除小鼠的TMEM206基因，篩選TMEM206基因敲除小鼠小腦組織中的差異表達(dá)基因并進(jìn)行生物學(xué)功能分析，探討TMEM206基因的功能。

1 材料與方法

1.1 C57BL/6系TMEM206基因敲除純合小鼠的制備 TMEM206基因敲除鼠采用C57BL/6系小鼠制備，基因敲除鼠及其組織制備符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理原則和標(biāo)準(zhǔn)?；蚯贸褂肅RISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，敲除TMEM206基因的外顯子2～外顯子5片段（見圖1）。敲除路徑：向單細(xì)胞期受精卵同時(shí)注射Cas9蛋白和靶向外顯子2和外顯子5的單向?qū)NA。單向?qū)NA序列如下，gRNA1：5'-CTAGCTTCT-GCTGATTACCC-3'；gRNA2：5'-CCTTAAAGATGTACCCCAAG-3'；gRNA3：5'-CAAGAAGGCTCACGGACCAC-3'；gRNA4：5'-AGTGAAGCCTGAAGCTCGGC-3'。TMEM206基因敲除小鼠委托江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司制備，TMEM206基因敲除突變通過PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序驗(yàn)證，TMEM206基因敲除純合鼠通過TMEM206基因敲除雜合鼠配殖獲得。

圖1 TMEM206基因敲除示意圖

1.2 TMEM206基因敲除純合小鼠和同窩野生小鼠的飼養(yǎng)、體質(zhì)量變化 挑選TMEM206基因敲除純合小鼠和同窩野生小鼠雌、雄各5只，常規(guī)飼養(yǎng)，在第49～52周稱取小鼠體質(zhì)量，比較TMEM206基因敲除純合小鼠和同窩野生小鼠的體質(zhì)量變化，結(jié)果顯示TMEM206基因敲除純合小鼠和同窩野生小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），提示TMEM206基因敲除不影響小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。

1.3 TMEM206基因敲除小鼠小腦組織RNA測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建 分別取3只8周齡雌性TMEM206基因敲除純合小鼠和3只同窩雌性野生小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉液麻醉，用預(yù)冷切片液心臟灌流，迅速斷頭，剪開顱骨取出全腦，再分離小腦組織。3只TMEM206基因敲除純合鼠分別取等量小腦組織混合為1管，3只野生小鼠也同樣取等量小腦組織混合為1管。每管組織分別用Invitrogen公司的TRIzol試劑提取總RNA，經(jīng)測(cè)定濃度和純度后，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.4 TMEM206基因敲除小鼠小腦組織中差異表達(dá)基因的篩選 小腦組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后顯示，TMEM206基因敲除純合鼠小腦組織測(cè)序平均長(zhǎng)度為148.25 bp，產(chǎn)生89495253測(cè)序reads，總堿基數(shù)為13268086226；野生C57BL/6J小鼠小腦組織測(cè)序平均長(zhǎng)度為148.29 bp，產(chǎn)生82118098測(cè)序reads，總堿基數(shù)為12196692913。測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估采用FastQC（v0.10.1）軟件分析，結(jié)果顯示TMEM206基因敲除純合鼠和野生鼠小腦測(cè)序堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在35以上，即堿基位置測(cè)序正確率在99.9%以上；兩個(gè)測(cè)序樣本絕大多數(shù)堿基序列的平均Phred堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)峰值均＞30，提示測(cè)序序列質(zhì)量較好。基因差異分析使用Cuffdiff（v2.2.1）軟件，依據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)counts值，通過EBseq算法篩選差異表達(dá)基因，差異倍數(shù)＞2.0或＜0.5，同時(shí)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率＜0.05時(shí)，視為差異表達(dá)基因。

1.5 TMEM206基因敲除小鼠小腦組織中差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因?qū)傩裕╣ene ontology， GO）和京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 TMEM206基因敲除小鼠小腦組織中差異表達(dá)基因的篩選結(jié)果 共篩選出474個(gè)差異表達(dá)基因，與正常小腦組織相比，TMEM206基因敲除小鼠小腦組織中上調(diào)的基因265個(gè)、下調(diào)的基因209個(gè)。其中表達(dá)量上調(diào)最高的10個(gè)基因由高到低依次為Acp2、Gzma、Tfe3、Zfp518a、Ppp1r26、Top3b、Mki67、Zranb1、Top2a、Chd9，表達(dá)量下調(diào)最高的10個(gè)基因由高到低依次為Ppp1r26、Gak、Slc15a2、Coch、Gm49325、Resf1、Mid1-ps1、Ptpre、Myo7a、Ntrk2。以上結(jié)果提示TMEM206基因敲除影響了小鼠小腦組織的基因表達(dá)譜。

2.2 TMEM206基因敲除小鼠小腦組織中差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能分析結(jié)果 GO功能分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因的表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞外膜和主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類蛋白（major histocompatibility complex Ⅰ， MHC Ⅰ）較多，這些基因表達(dá)產(chǎn)物功能屬性主要?dú)w類于結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、脂類分子及抗原分子等；差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)過程眾多，如DNA損傷的細(xì)胞反應(yīng)、細(xì)胞分化選擇、骨質(zhì)礦化、BMP信號(hào)通路負(fù)調(diào)控、內(nèi)皮細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控、血管收縮正調(diào)控等。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因在分子屬性上多為細(xì)胞黏附分子和腫瘤壞死因子路徑的分子，功能上主要與細(xì)胞吞噬和衰老有關(guān)，此外還與人乳頭瘤病毒、Ⅰ型人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒、單純皰疹病毒、ⅤⅢ型人皰疹病毒及EB病毒等感染有關(guān)。

3 討論

脊髓小腦型共濟(jì)失調(diào)（spinocerebellar ataxia，SCA）是一類遺傳性共濟(jì)失調(diào)，病變主要累及小腦、腦干及脊髓［5］。目前已發(fā)現(xiàn)的SCA類型有30多型，其中SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7等型均由致病基因編碼區(qū)CAG（編碼谷氨酰胺）三核苷酸重復(fù)序列的重復(fù)數(shù)增加所致，因此又稱為多聚谷氨酰胺病或poly Q?。?-7］。SCA1的致病基因?yàn)锳TXN1，基因表達(dá)產(chǎn)物為ataxin-1，但發(fā)病機(jī)制仍不清楚［8］。前期通過穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸免疫沉淀分析和蛋白免疫共沉淀，我們發(fā)現(xiàn)TMEM206與ataxin-1存在相互作用，提示TMEM206或許參與SCA1的發(fā)?。?］。因此，有必要探討TMEM206基因在小腦組織中的功能。研究［10］顯示，PAC通道失活時(shí)，可保護(hù)酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡，活化時(shí)可增強(qiáng)神經(jīng)元細(xì)胞的酸毒性。敲除TMEM206基因不影響小鼠的生殖和發(fā)育，且能改善酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡，降低缺血性中風(fēng)時(shí)腦梗死面積，抑制缺血性中風(fēng)時(shí)腦損傷程度［11］。深圳華大基因研究院研究［12］發(fā)現(xiàn)，TMEM206可保護(hù)低氧環(huán)境導(dǎo)致腦損傷。因此，PAC通道在神經(jīng)元中具有重要功能。

本研究中，敲除TMEM206基因的純合小鼠均能正常生長(zhǎng)發(fā)育，且成年鼠體質(zhì)量與野生小鼠體質(zhì)量無顯著性差異。這證實(shí)了TMEM206基因雖廣泛表達(dá)，但并非管家基因，敲除它不影響小鼠的生殖和發(fā)育。通過敲除野生C57BL/6J鼠的TMEM206基因，本研究發(fā)現(xiàn)小腦組織中265個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)、209個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)。GO功能分析顯示，差異表達(dá)基因在結(jié)構(gòu)上主要是細(xì)胞外膜和MHC Ⅰ。TMEM206蛋白本身是一種膜蛋白，細(xì)胞膜缺乏TMEM206蛋白時(shí)，其他膜蛋白基因表達(dá)可能發(fā)生改變，以維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能［13］。MHC Ⅰ類基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中均有表達(dá)，通常定位于軸突和樹突表面，其在神經(jīng)系統(tǒng)除發(fā)揮經(jīng)典的免疫學(xué)功能外，還具有非免疫學(xué)功能，如調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和突觸可塑性［14］。有研究［15］表明，經(jīng)典MHC Ⅰ類分子的異常表達(dá)與神經(jīng)退行性疾病如帕金森病、阿爾茨海默癥及肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥等發(fā)病有關(guān)。SCA1是ATXN1基因突變引起的一種神經(jīng)退行性疾病，ataxin-1與TMEM206蛋白存在相互作用，敲除TMEM206基因可引起MHC Ⅰ類分子表達(dá)異常，我們推測(cè)SCA1發(fā)病時(shí)，可能存在MHC Ⅰ類分子表達(dá)異常。

細(xì)胞黏附分子是一類介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合的分子。細(xì)胞黏附分子參與細(xì)胞的識(shí)別、活化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、分化，是免疫應(yīng)答、炎癥、凝血、腫瘤轉(zhuǎn)移等重要生理和病理過程的分子基礎(chǔ)［16］。對(duì)敲除小鼠TMEM206基因后小腦組織表達(dá)量發(fā)生改變的474個(gè)基因經(jīng)KEGG分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因在功能上多為細(xì)胞黏附分子和腫瘤壞死因子路徑分子，主要與細(xì)胞吞噬和衰老有關(guān)。TMEM206蛋白是一種離子通道蛋白，敲除TMEM206基因引起細(xì)胞黏附分子類的一些基因表達(dá)量發(fā)生改變，提示TMEM206蛋白功能或許與細(xì)胞識(shí)別、活化、增殖、分化及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，敲除TMEM206基因會(huì)引起一些與人乳頭瘤病毒、Ⅰ型人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒、單純皰疹病毒、ⅤⅢ型人皰疹病毒及EB病毒等感染有關(guān)的基因出現(xiàn)表達(dá)量改變。與病毒感染的細(xì)胞結(jié)構(gòu)一般為細(xì)胞表面受體，本研究顯示敲除TMEM206基因，可導(dǎo)致一些細(xì)胞受體基因表達(dá)異常。

綜上所述，通過敲除C57BL/6J鼠的TMEM206基因，本研究發(fā)現(xiàn)小腦組織有474個(gè)基因表達(dá)量發(fā)生改變，其中265個(gè)基因上調(diào)、209個(gè)基因下調(diào)，這些差異表達(dá)基因參與維持細(xì)胞外膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和細(xì)胞黏附，并與病毒感染相關(guān)，提示作為離子通道蛋白，TMEM206蛋白在體內(nèi)可能有眾多的功能，其參與SCA1發(fā)病的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。