流式細(xì)胞分析儀檢測抗核抗體譜方法學(xué)性能驗(yàn)證

徐敏,黎海生,戚南昌,太繼瓊,蔣金梅（昆明市第一人民醫(yī)院,云南 昆明 650011）

自身抗體是診斷自身免疫性疾病的重要依據(jù)，抗核抗體是細(xì)胞內(nèi)所有核抗原成分的總稱，是自身免疫性疾病的重要輔助診斷指標(biāo)[1]。每種自身免疫性疾病幾乎都伴有特征性的自身抗體譜。自身免疫病患者中，有相當(dāng)一部分病人的血清或其體液中可以檢測到一種或多種高效價的自身抗體，能為自身免疫病的診斷、療效觀察等提供非常有價值的依據(jù)，自身免疫性疾病的檢測方法多種，而在眾多的檢測方法中，有的操作繁瑣，有的對人體有害，而且都不能同時檢測多種抗體。根據(jù)國內(nèi)外研究情況介紹，美國ZEUS公司AtheNA檢測系統(tǒng)即通過多重微球流式點(diǎn)陣分析（multiplexed bead assay，MBA）技術(shù)原理，可同時自動化或半自動化定量檢測多種自身抗體，根據(jù)CNAS-CL02：2012《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》的規(guī)定[2]，開展使用新方法前，實(shí)驗(yàn)室必須對指標(biāo)的相關(guān)性能進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證評估。本實(shí)驗(yàn)室對美國ZEUS公司AtheNA系統(tǒng)Luminex200流式熒光分析儀的主要性能進(jìn)行驗(yàn)證，確定設(shè)備能否達(dá)到所要求的性能指標(biāo)及設(shè)備性能是否合格，以確保儀器檢測所得結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，這樣更有助于臨床病情監(jiān)測與臨床用藥指導(dǎo)，以及協(xié)助自身免疫性疾病的診斷。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 采集昆明市第一人民醫(yī)院2019年住院病人已檢測抗核抗體譜項(xiàng)目的血清及門診體檢正常人血清，避免使用溶血、脂血和細(xì)菌污染的標(biāo)本。

1.2儀器與試劑 美國ZEUS公司AtheNA系統(tǒng)Luminex200流式熒光分析儀，美國ZEUS公司抗核抗體譜檢測試劑盒（多重微珠流式免疫熒光發(fā)光法）［批號16110003，試劑成分：復(fù)合微珠懸浮液、藻紅蛋白標(biāo)記的羊抗-人IgG，實(shí)驗(yàn)緩沖液、洗滌緩沖液（10×）］；美國宙斯（Zeus）科技公司生產(chǎn)的AtheNA Multilyte ENA譜（抗核抗體譜）檢測試劑盒內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3檢測項(xiàng)目 SSA-52、SSA-60、SSB、Sm、RNP、Scl-70、Jo-1、Cent B、ds-DNA（雙鏈DNA）、Nucleosome（抗核小體抗體）、PM-Scl、PCNA、Ribosomal P（抗核糖體P蛋白抗體）、Histone（組蛋白抗體）、M2（抗線粒體抗體）。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1精密度評價 根據(jù)CLSI EP5-A2[3]方案來驗(yàn)證其精密度。①批內(nèi)精密度：收集我院住院患者血清，濃度水平接近醫(yī)學(xué)決定水平樣本，樣本量為5ml，一天內(nèi)重復(fù)檢測20次，計算均數(shù)（x）、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）及批內(nèi)變異系數(shù)（CV%），批內(nèi)變異系數(shù)（CV%）需符合WS/T 494-2017[4]要求＜10%。②批間精密度：用室內(nèi)質(zhì)控品，每天檢測1次，選取20天的室內(nèi)質(zhì)控的在控結(jié)果的變異系數(shù)作為評價指標(biāo)，批間變異系數(shù)（CV%）需符合WS/T 494-2017要求＜15%。

1.4.2正確度（符合性實(shí)驗(yàn)） 因定量標(biāo)準(zhǔn)品難以獲取，本實(shí)驗(yàn)室用已檢測抗核抗體譜項(xiàng)目的衛(wèi)生部室間質(zhì)評樣本作為驗(yàn)證材料，樣本血清按試劑盒說明書進(jìn)行常規(guī)步驟試驗(yàn)，結(jié)果再與免疫印跡法做符合性比對試驗(yàn)，陰性、陽性及弱陽性結(jié)果須完全相符。

1.4.3線性范圍驗(yàn)證試驗(yàn) 采用CLSI EP6-A2[5]《定量分析方法的線性評價》驗(yàn)證方法，取一份低濃度ds-DNA樣本（L）和一份高濃度ds-DNA樣本（H）分別按照5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H的低高濃度配比，配成6個濃度梯度樣本，按試劑盒說明書進(jìn)行常規(guī)步驟試驗(yàn)。將6對實(shí)測值（Y軸）與預(yù)期值（X軸）進(jìn)行直線回歸，計算y=ax+b，計算線性范圍和相關(guān)性，以R2≥0.95為判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.4最低檢出限 取一份低濃度標(biāo)本重復(fù)做10次試驗(yàn)，按試劑盒說明書進(jìn)行常規(guī)步驟試驗(yàn)。求空白檢測低限（LoB）：將空白樣品重復(fù)10次作批內(nèi)測定，計算空白（響應(yīng)量）均值（空白）和標(biāo)準(zhǔn)差（s空白），95%可能性為：LoB=x空白+2·s空白。

取稀釋液作為標(biāo)本重復(fù)做10次試驗(yàn)，按試劑盒說明書進(jìn)行常規(guī)步驟試驗(yàn)。

求定量檢測低限（LoQ）：將定量檢測限樣品重復(fù)10次作批內(nèi)測定，計算響應(yīng)量均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（s定量），95%可能性為：LoQ=定量+2·s定量。

1.4.5參考區(qū)間 參考CLSI C28-A2[6]，選取我院門診體檢正常人20名，男、女各10名，年齡在18-60歲之間，樣本血清無黃疸及溶血，按試劑盒說明書進(jìn)行常規(guī)檢測，判斷標(biāo)準(zhǔn)為R值≥90%，若滿足要求，則可判定廠家提供的參考區(qū)間適用于本實(shí)驗(yàn)室，若不滿足要求，則需根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立參考區(qū)間。按以下公式計算R值：R＝檢測值在引用參考區(qū)間的個體數(shù)／總個體數(shù)×100%。如果≥90%的樣本檢測結(jié)果在（1-119AU/ml）范圍內(nèi)，則驗(yàn)證符合通過。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用Microsoft Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。并計算相應(yīng)的均值、CV和標(biāo)準(zhǔn)差。線性驗(yàn)證中各濃度理論值與實(shí)測值關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示。

2 結(jié)果

2.1精密度驗(yàn)證結(jié)果 混合血清批內(nèi)精密度均＜10%，質(zhì)控血清批間精密度均＜15%，符合WS/T 494-2017要求的標(biāo)準(zhǔn)，見表1、表2。

表2 流式熒光免疫法檢測15個自身抗體項(xiàng)目的批間精密度驗(yàn)證結(jié)果

2.2正確度驗(yàn)證 因定量標(biāo)準(zhǔn)品難以獲取，本實(shí)驗(yàn)室用已檢測ENA項(xiàng)目的衛(wèi)生部室間質(zhì)評樣本作為驗(yàn)證材料，樣本血清按試劑盒說明書進(jìn)行常規(guī)步驟試驗(yàn)，結(jié)果再與免疫印跡法做符合性比對試驗(yàn)，陰性（＜100）、陽性（＞120）及弱陽性（100-120），結(jié)果完全相符，見表3。

表3 流式熒光免疫法檢測自身抗體的正確度性能評價結(jié)果

2.3線性范圍驗(yàn)證 因本實(shí)驗(yàn)室使用的美國ZEUS公司AtheNA系統(tǒng)Luminex200流式熒光分析儀檢測ENA譜（抗核抗體譜）的結(jié)果只有ds-DNA項(xiàng)目是定量（IU/ml），其余項(xiàng)目為半定量（AU/ml），故此僅對ds-DNA的線性范圍性能做評價。ds-DNA在美國ZEUS公司AtheNA系統(tǒng)Luminex200流式熒光分析儀檢測結(jié)果在范圍內(nèi)呈線性，R2=0.9871，R2＞0.95，符合要求，見表4。

表4 流式熒光免疫分析法ds-DNA線性范圍性能評價結(jié)果

2.4最低檢出限驗(yàn)證 ENA譜15項(xiàng)檢測試劑盒（多重微球流式免疫熒光發(fā)光法）在美國ZEUS公司AtheNA系統(tǒng)Luminex200流式熒光分析儀上最低檢測限預(yù)期值為12，15項(xiàng)檢測均低于預(yù)期值，見表5。

表5 流式熒光免疫分析法檢測自身抗體檢出限(靈敏度)結(jié)果

2.5參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果 使用的美國ZEUS公司AtheNA系統(tǒng)Luminex200流式熒光分析儀檢測ENA譜參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果見表6，15項(xiàng)檢測結(jié)果≥90%的樣本檢測結(jié)果在試劑盒規(guī)定的參考區(qū)間（1-119AU/ml）范圍內(nèi)，故參考區(qū)間驗(yàn)證符合通過。

表6 流式熒光免疫分析法檢測自身抗體參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

近年來由于臨床經(jīng)驗(yàn)的積累和實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)自身免疫性疾病患者越來越多，涉及臨床多學(xué)科，相互交叉、相互滲透，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，同病異癥，異癥同病也是該類疾病容易誤診的主要原因之一。抗核抗體為一種廣泛存在于人體內(nèi)的自身抗體，可與細(xì)胞核產(chǎn)生反應(yīng)，主要分布在血清內(nèi)，通過其水平檢測，可為自身免疫性疾病診斷提供一定指導(dǎo)[7]，自身抗體是用于輔助診斷自身免疫性疾病（AID）的重要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，其檢測方法已不同程度實(shí)現(xiàn)了定量或半定量[8]。目前，比較公認(rèn)的血清自身抗體檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”是ANA HEp-2 IFA檢測法，但是該方法只能作為初篩試驗(yàn)，而且主要依靠主觀判斷抗體的滴度，對于陽性的標(biāo)本還需要做一系列的確證試驗(yàn)。因此，對于陽性標(biāo)本，其檢測步驟繁瑣，檢測成本高，報告周期長。因此，迫切需要一種能集初篩和確診試驗(yàn)于一體的簡便、快速的自身抗體檢測法[9]。美國ZEUS公司AtheNA系統(tǒng)Luminex200流式熒光分析儀診斷系統(tǒng)采用多重微球流式點(diǎn)陣分析（multiplexed bead assay，MBA）技術(shù)研制的AtheNA Multi-Lyte抗核抗體檢測系統(tǒng)是一種均勻的、多元的微珠分析系統(tǒng)[10]。有國內(nèi)外文獻(xiàn)報道，AtheNA ANA系統(tǒng)和標(biāo)準(zhǔn)的ELISA系統(tǒng)在檢測確診的自身免疫患者、實(shí)驗(yàn)室常規(guī)送檢的連續(xù)標(biāo)本以及獻(xiàn)血者血清時，其符合率從97.7%-99.0%，單個標(biāo)志物的符合率從92.09%-97.7%，具有高度一致性，其敏感性、特異性都很好[11]。在臨床檢驗(yàn)中，精密度是試劑盒或檢驗(yàn)程序重要的分析性能之一，是保證準(zhǔn)確度的先決條件，臨床實(shí)驗(yàn)室絕不希望同一樣本在不同時間測量的結(jié)果有明顯差異，致使臨床醫(yī)生無法相信臨床實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)結(jié)果，從而使檢驗(yàn)結(jié)果不能成為診斷和治療的依據(jù)[12-13]。

正確度（符合性）是表示測量結(jié)果中系統(tǒng)誤差大小的程度。本實(shí)驗(yàn)室用已檢測抗核抗體譜項(xiàng)目的衛(wèi)生部室間質(zhì)評樣本作為驗(yàn)證材料，符合性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相對CV在0.37%-7.48%；結(jié)果再與免疫印跡法做符合性比對試驗(yàn)，陰性、陽性及弱陽性結(jié)果完全相符。說明該試驗(yàn)正確度性能符合要求。

多重微球流式免疫熒光發(fā)光法檢測的ds-DNA濃度范圍為12-649IU/mL，線性相關(guān)性好，R2=0.9871，說明該儀器具有良好的線性范圍。最低檢出限是對單位濃度或單位量待測物質(zhì)變化所致的響應(yīng)量變化程度，是試驗(yàn)方法產(chǎn)生一個能可靠地被檢出的分析信號所需的被測組分的最小濃度或含量。參考區(qū)間是解釋檢驗(yàn)結(jié)果，分析檢驗(yàn)信息的一個基本尺度和依據(jù)[14]，只有實(shí)驗(yàn)室給臨床提供檢驗(yàn)項(xiàng)目可靠的生物參考區(qū)間，才能使臨床對患者或健康體檢者的診斷治療有明確的指引。按照CLSI C28-A2文件推薦的方法，對抗核抗體譜15個項(xiàng)目參考區(qū)間進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，測定結(jié)果提示，SSA-52、SSB、Cent B有95.0%的測定數(shù)據(jù)在廠家引用的參考區(qū)間內(nèi)，SSA-60、Sm、RNP、Scl-70、Jo-1、ds-DNA、Nucleosome、PM-Scl、PCNA、Ribosomal P、Histone、M2有100%的測定數(shù)據(jù)在廠家引用的參考區(qū)間內(nèi)，均大于90.0%的要求，表明廠家提供的參考區(qū)間適合本實(shí)驗(yàn)室，可以直接引用。

綜上所述，AtheNA系統(tǒng)Luminex200流式熒光分析儀診斷系統(tǒng)其精密度、正確度（符合性）、線性、檢測限、參考區(qū)間均達(dá)到所要求的性能指標(biāo)，性能能夠滿足臨床需求，為自身免疫性疾病相關(guān)特異性抗體的檢測提供了一種靈敏而特異的工具。