‘蛇龍珠’葡萄果實(shí)糖酸含量和代謝關(guān)鍵酶活的變化

摘要 糖酸是決定葡萄品質(zhì)及葡萄酒風(fēng)味的重要指標(biāo)之一。本研究以釀酒葡萄‘蛇龍珠為試驗(yàn)材料，在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的E-L 33、35、36、37和38這5個(gè)時(shí)期，測(cè)定和分析了果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可溶性糖（葡萄糖、果糖）、主要有機(jī)酸（酒石酸、蘋果酸）和游離氨基酸的動(dòng)態(tài)變化，并分別測(cè)定了果實(shí)中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）活性的變化。結(jié)果表明，‘蛇龍珠果實(shí)在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中葡萄糖和果糖逐漸增加；精氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸和丙氨酸等游離氨基酸含量逐漸增加；主要有機(jī)酸酒石酸和蘋果酸含量逐漸下降，PEPC酶的活性在E-L 35時(shí)期后表現(xiàn)出與果實(shí)中蘋果酸含量相似的變化趨勢(shì)，表明葡萄果實(shí)中蘋果酸的降解可能受PEPC酶的影響。通過(guò)對(duì)有效成份含量的研究，更深入地了解葡萄果實(shí)的發(fā)育過(guò)程，并為優(yōu)化葡萄酒釀造和調(diào)整香氣特性提供參考。

關(guān)鍵詞 ‘蛇龍珠；酒石酸；蘋果酸；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶

中圖分類號(hào) S312 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 1007-7731（2024）07-0099-05

Changes of sugar and organic acid contents and key enzyme activities during the growth and?development of Cabernet Gernischt berries

YANG Congdi

（Ningxia Technical College of Wine and Desertification Prevention， Yinchuan 750001， China）

Abstract Sugar and organic acids play a crucial role in determining grape quality and wine flavor. This study aimed to investigate the dynamic changes in sugar （glucose， fructose） and organic acid （tartaric acid， malic acid） accumulation during grape fruit growth and development respectivly. Additionally， the activities of fruit phosphoenolpyruvate carboxylase （PEPC） and phosphoenolpyruvate carboxykinase （PEPCK） were examined at different developmental stages （E-L 33， 35， 36， 37， and 38）. The results demonstrated a gradual increase in free amino acids， glucose， and fructose concentrations. Conversely， the content of tartaric acid and malic acid declined throughout grape berry development. Furthermore， the PEPC enzyme activity displayed a similar pattern of change to that of malic acid content after the E-L 35 stage. Hence， it could be inferred that the breakdown of malic acid in grape berries is regulated by PEPC.By studying the bioactive component content， could gain a deeper understanding of the development process of grape fruits and provide reference for optimizing wine making and adjusting aroma characteristics.

Keywords Cabernet Gernischt; tartaric acid; malic acid; phosphoenolpyruvate carboxylase; phosphoenolpyruvate carboxykinase

在葡萄栽培和釀酒過(guò)程中，葡萄果實(shí)中的糖酸平衡尤為重要?？扇苄蕴堑暮抠x予葡萄漿果的甜度和豐富度，而有機(jī)酸則為漿果提供酸度和清新感，使其更加爽口[1]。適宜的糖酸平衡可以使葡萄漿果呈現(xiàn)豐富且平衡的口感，提升其品質(zhì)。在葡萄酒釀造過(guò)程中，糖和酸各自的含量直接決定了酒的甜度和酸度。如果糖酸平衡失調(diào)，會(huì)導(dǎo)致葡萄酒過(guò)甜或過(guò)酸，影響口感和平衡度。此外，糖酸平衡還影響葡萄漿果的生長(zhǎng)和發(fā)育。適宜的糖酸平衡有助于維持葡萄果實(shí)的膨脹、顏色、風(fēng)味和酚類化合物的積累等正常的生理過(guò)程。葡萄果實(shí)含有大約20種不同的有機(jī)酸，其中酒石酸和蘋果酸是葡萄果實(shí)中的主要有機(jī)酸，占葡萄總酸度的90%以上。蘋果酸（2-羥基丁二酸）在生物系統(tǒng)中普遍存在，其是糖酵解、三羧酸循環(huán)、乙醛酸循環(huán)和草莽酸等代謝途徑的中間產(chǎn)物，也是C4類植物（包括景天酸代謝植物）重要的光合作用產(chǎn)物[2]。在植物中，蘋果酸參與調(diào)節(jié)氣孔的開度，平衡細(xì)胞的能量供應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞質(zhì)的pH，增強(qiáng)植物的抗逆性，以及與代謝途徑有更復(fù)雜聯(lián)系的其他過(guò)程。果實(shí)中蘋果酸的含量與其合成、降解和分隔的凈平衡密切相關(guān)，果實(shí)有機(jī)酸的積累與植物的遺傳背景及生長(zhǎng)過(guò)程中的環(huán)境條件密切相關(guān)[3]。因此，通過(guò)研究釀酒葡萄‘蛇龍珠果實(shí)發(fā)育過(guò)程中有機(jī)酸含量的變化，分析蘋果酸代謝關(guān)鍵酶活性，可以為闡明蘋果酸的代謝提供參考。

游離氨基酸是葡萄果實(shí)中產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物之一。從葡萄酒釀造角度來(lái)看，氨基酸代謝至關(guān)重要，因?yàn)槠涫窃S多關(guān)鍵揮發(fā)性香氣化合物的前體物質(zhì)。葡萄果實(shí)中氨基酸含量在不同品種和產(chǎn)區(qū)可能會(huì)有不同的變化模式[4]。本研究通過(guò)測(cè)定‘蛇龍珠葡萄果實(shí)中的水溶性糖、有機(jī)酸和氨基酸含量，了解各有效成分含量在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的變化規(guī)律。通過(guò)對(duì)有效成分含量的研究，更深入地了解葡萄果實(shí)的發(fā)育過(guò)程，并為優(yōu)化葡萄酒釀造和調(diào)整香氣特性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2023年4—9月在寧夏賀蘭山東麓玉泉營(yíng)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)材料為長(zhǎng)勢(shì)基本一致，且無(wú)病害的六年生‘蛇龍珠，單干雙臂整形方式，株行距0.8 m × 3.0 m。利用Eichhorn-Lorenz（E-L）系統(tǒng)，分別于E-L 33、35、36、37和38這5個(gè)時(shí)期進(jìn)行果實(shí)樣品的采集，并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取樣方法? 取樣時(shí)間為上午8—9時(shí)，在設(shè)有保護(hù)行的試驗(yàn)地，于每個(gè)果穗前、后、左和右4個(gè)面的上、中、下3個(gè)位置隨機(jī)均勻取樣，共取150粒。剪去果梗，用于測(cè)定果實(shí)鮮重，取50顆果粒壓榨成汁，測(cè)定可溶性總固形物（TSS）、可滴定酸含量及pH值。其余果實(shí)樣品用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存，用于其他指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2 果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)? 葡萄果實(shí)鮮重使用1/104電子天平測(cè)定，TSS采用手持折光儀進(jìn)行測(cè)定，果實(shí)TA含量采用氫氧化鈉滴定法（0.05 M）測(cè)定，葡萄汁pH值使用雷磁pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 可溶性糖、有機(jī)酸和氨基酸的測(cè)定? 去除葡萄果實(shí)的果梗和種子后，用液氮將其研磨成粉末狀，準(zhǔn)確稱取1 g，加入9 mL超純水，20 °C下超聲提取30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.45 μm的濾膜過(guò)濾，采用UltiMate 3000型高效液相色譜儀（Thermo Fisher科技有限公司）進(jìn)行測(cè)定。

可溶性糖測(cè)定高效液相色譜條件：示差檢測(cè)器，色譜柱Hypersil GOLDTM Amino色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相為乙腈∶水（V/V） = 75∶25；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm；流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 ?L。

有機(jī)酸測(cè)定高效液相色譜條件：色譜柱型號(hào)C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；紫外檢測(cè)器（210 nm），流動(dòng)相為97% 10 mmol/L的磷酸二氫鉀（pH 2.7）和3%的甲醇；流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 ?L。

氨基酸的衍生化：使用經(jīng)過(guò)相同衍生化程序的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算氨基酸含量。氨基酸測(cè)定高效液相色譜條件：色譜柱型號(hào)C18（250 mm × 4.6 mm，5 ?m）；紫外檢測(cè)器（280 nm）；A相10 mM磷酸氫二鈉/硼砂，pH 8.4；B相乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10（V/V/V）；流速1.2 mL/min；柱溫16 ℃；進(jìn)樣量5 μL。洗脫程序?yàn)?% B保持0.5 min，2%～57% B保持24.5 min，57%～100% B保持0.1 min，3.4 min，2%～100% B保持0.1 min，保持1.4 min。

1.2.4 有機(jī)酸代謝關(guān)鍵酶活含量的測(cè)定? 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶（PEPCK）的前處理和活性測(cè)定主要參考Sweetman等[5]的方法。稱取5 g去除果梗和種子的葡萄果實(shí)粉末，加入20 mL提取緩沖液[內(nèi)含500 mM pH 8.5 Tris-Cl、200 mM氯化鉀、20 mM氯化鎂、10 mM乙二胺四乙酸、8%（w/v）PEG-2000、8 mM鹽酸半胱氨酸、5 mM二硫蘇糖醇、2%（w/v）交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、0.25%（w/v）牛血清白蛋白、0.5 mM苯甲磺酰氟和0.5 mM 4-氨基苯甲酰胺]于冰上充分研磨，研磨的勻漿全部加入50 mL離心管后進(jìn)行離心（3 000 g，10 min），收集上清液于新的離心管，加入聚乙二醇-2000，使其終濃度為40%（w/v），在室溫下輕輕混合，直到聚乙二醇-2000完全溶解后離心（30 000 g，15 min），加入5 mL重懸液（內(nèi)含5 mM pH 7.0 Tris-Cl、20 mM氯化鎂、10 mM乙二胺四乙酸、5 mM二硫蘇糖醇、3%（v/v）Triton X-100、0.5 mM苯甲磺酰氟和0.5 mM 4-氨基苯甲酰胺）對(duì)沉淀的蛋白進(jìn)行重懸后離心（5 000 g，1 min），以上上清液立即用于酶活性的檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用Origin 2022和TBtools-II進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 品質(zhì)指標(biāo)

從表1可以看出，隨著葡萄果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育，‘蛇龍珠葡萄果實(shí)鮮重呈穩(wěn)步增加的趨勢(shì)。E-L 35—36時(shí)期和E-L 37—38時(shí)期漿果鮮重明顯增大，果粒重量增加迅速，單粒漿果鮮重分別增加0.408 4和0.292 2 g。葡萄漿果的總可溶性固形物（TSS）和可滴定酸（TA）變化趨勢(shì)相反，TSS含量逐漸升高，但TA含量逐漸下降；E-L 35時(shí)期TSS增速最快，而TA含量下降速度最快，在E-L 35時(shí)期漿果可溶性糖含量得到了迅速積累。隨著葡萄的生長(zhǎng)發(fā)育，漿果pH值逐漸升高，但果汁樣品pH值與相應(yīng)的含酸量不一致。

2.2 可溶性糖含量

如圖1所示，在‘蛇龍珠葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，以積累果糖和葡萄糖為主，且均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。E-L 33時(shí)期葡萄漿果仍是綠色的和堅(jiān)硬的，漿果果實(shí)主要積累有機(jī)酸（主要是酒石酸和蘋果酸），僅有很少的糖（果糖和葡萄糖含量分別為5.716和7.573 mg/L）。漿果在E-L 35時(shí)期開始變色和軟化，并快速積累果糖和葡萄糖，在E-L 36時(shí)期以具有白利糖度的中值為特點(diǎn)，在E-L 38時(shí)達(dá)到收獲成熟度，與E-L 35時(shí)期相似，其果糖含量（85.369 mg/L）仍高于葡萄糖（70.631 mg/L）。

2.3 有機(jī)酸含量

‘蛇龍珠葡萄漿果在E-L 33—38時(shí)期酒石酸和蘋果酸的含量變化如圖2所示。酒石酸和蘋果酸在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中變化趨勢(shì)相似，均是迅速積累后急速下降，再轉(zhuǎn)為緩慢下降，并持續(xù)到漿果成熟。在E-L 33—38時(shí)期，果實(shí)中酒石酸含量下降了11.374 mg/L，蘋果酸含量下降了14.927 mg/L。

2.4 有機(jī)酸關(guān)鍵代謝酶活性

‘蛇龍珠漿果發(fā)育過(guò)程中有機(jī)酸關(guān)鍵代謝酶活性的變化如圖3所示。由圖3（A）可知，‘蛇龍珠葡萄果實(shí)在不同時(shí)期磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性呈先升高再降低趨勢(shì)，E-L 33時(shí)期PEPC酶活性為35.50 nmol/g FW，此后逐漸升高，E-L 36時(shí)期達(dá)到最高（88.05 nmol/g FW）。隨后，隨著果實(shí)逐漸成熟，其活性呈下降趨勢(shì)，在E-L 38時(shí)期PEPC酶活性為65.45 nmol/g FW，這表明漿果中PEPC酶活性成熟期高于綠果期。由圖3（B）可知，漿果中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（PEPCK）活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于PEPC酶活性，且在E-L 38時(shí)期更為明顯。在‘蛇龍珠漿果生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，PEPCK酶活性最高為20.40 nmol/g FW。

2.5 不同氨基酸含量

如圖4所示，精氨酸在E-L 33-38時(shí)期的含量呈明顯增加的趨勢(shì)，脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸和丙氨酸在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育期也表現(xiàn)出明顯的增加趨勢(shì)。在E-L 33—38時(shí)期，甘氨酸和谷氨酸的含量經(jīng)歷了較大變化。相比之下，天冬氨酸和賴氨酸在E-L 33—38時(shí)期的變化較小?？梢?，在‘蛇龍珠漿果的發(fā)育過(guò)程中，不同氨基酸的含量呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。

3 結(jié)論與討論

‘蛇龍珠漿果的發(fā)育伴隨著重量體積的增大、糖分的積累以及酸分的下降，最后達(dá)到糖酸平衡，漿果進(jìn)入成熟期?？扇苄怨绦挝锖涂傻味ㄋ岷颗c葡萄果實(shí)和葡萄酒的品質(zhì)直接相關(guān)[6]，二者是葡萄品質(zhì)的關(guān)鍵因素。成熟漿果中的糖分通常占可溶性固形物含量的90%以上，蔗糖是葡萄中主要的轉(zhuǎn)運(yùn)糖之一，但其在漿果中的含量較低[7]，各個(gè)時(shí)期葡萄漿果中的可溶性糖主要由葡萄糖和果糖組成。

葡萄果實(shí)中的有機(jī)酸包括酒石酸、蘋果酸和檸檬酸等，其對(duì)葡萄果實(shí)的風(fēng)味和品質(zhì)起著重要作用。在葡萄漿果的生長(zhǎng)初期到成熟的過(guò)程中，有機(jī)酸是通過(guò)糖異生、三羧酸循環(huán)和莽草酸循環(huán)生成的。葡萄發(fā)育過(guò)程中酸度的增加是各種代謝過(guò)程的綜合結(jié)果，其中，蘋果酸和酒石酸占總酸的90%以上。酒石酸在葡萄中比蘋果酸穩(wěn)定得多，且酒石酸和蘋果酸均由糖轉(zhuǎn)化而來(lái)。與蘋果酸相似，大多數(shù)酒石酸是在轉(zhuǎn)色前期合成，但是其生物合成與代謝途徑卻存在差異。酒石酸是葡萄糖和抗壞血酸代謝的次級(jí)代謝產(chǎn)物[8]。轉(zhuǎn)色后期酒石酸含量的降低主要是由于漿果中糖分和水分的稀釋。與蘋果酸不同的是，酒石酸在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中很少會(huì)被降解，僅有微量酒石酸被呼吸代謝。

蘋果酸是葡萄果實(shí)中的主要有機(jī)酸，且參與細(xì)胞內(nèi)大量有機(jī)物的轉(zhuǎn)化。PEPC酶是果實(shí)蘋果酸代謝中的關(guān)鍵酶，能將磷酸烯醇式丙酮酸縮合成草酰乙酸[9]。葡萄漿果中，其活性變化主要在轉(zhuǎn)色后期，與蘋果酸含量積累變化一致。相關(guān)研究表明，葡萄果實(shí)中，PEPC酶活性的降低與CO2的暗固定以及糖酵解通量的減少密切相關(guān)，推測(cè)PEPC酶可能參與光合作用及糖分降解等過(guò)程[10]?！啐堉闈{果發(fā)育過(guò)程中，PEPC酶活性經(jīng)歷E-L 35時(shí)期后，表現(xiàn)出與蘋果酸含量相似的變化趨勢(shì)。這說(shuō)明在葡萄果實(shí)中，蘋果酸的降解受PEPC酶的調(diào)控。在高等植物中，PEPCK是一種胞質(zhì)酶，催化草酰乙酸脫羧生成磷酸烯醇式丙酮酸。PEPCK是主導(dǎo)蘋果酸降解的關(guān)鍵酶，參與了幾種果肉中蘋果酸的異化，并可能與低酸蘋果品種中蘋果酸的缺乏有關(guān)。

在不同生長(zhǎng)階段和果實(shí)部位的氨基酸含量在種植地區(qū)和栽培條件等因素的影響下，可能存在一定的差異[11]。因此，了解‘蛇龍珠漿果氨基酸含量變化規(guī)律對(duì)其適宜的生長(zhǎng)管理和采摘時(shí)間的確定具有一定參考價(jià)值。

綜上，本研究以釀酒葡萄‘蛇龍珠為試驗(yàn)材料，在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的E-L 33、35、36、37和38這5個(gè)時(shí)期，測(cè)定和分析了果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可溶性糖（葡萄糖、果糖）、主要有機(jī)酸（酒石酸、蘋果酸）和游離氨基酸的動(dòng)態(tài)變化，并分別測(cè)定了果實(shí)中有機(jī)酸關(guān)鍵代謝酶PEPC和PEPCK活性的變化。結(jié)果表明，‘蛇龍珠果實(shí)在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中葡萄糖和果糖逐漸增加；精氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸和丙氨酸等游離氨基酸含量逐漸增加；主要有機(jī)酸酒石酸和蘋果酸含量逐漸下降，PEPC酶的活性在E-L 35時(shí)期后表現(xiàn)出與果實(shí)中蘋果酸含量相似的變化趨勢(shì)，表明葡萄果實(shí)中蘋果酸的降解可能受PEPC酶的影響。通過(guò)對(duì)氨基酸含量的研究，更深入地了解葡萄果實(shí)的發(fā)育過(guò)程，并為優(yōu)化葡萄酒釀造和調(diào)整香氣特性提供參考。

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（責(zé)編：楊 歡）

基金項(xiàng)目 寧夏回族自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（NYG2022230）。

作者簡(jiǎn)介 楊從弟（1987—），男，甘肅靜寧人，助教，從事林產(chǎn)化工研究。