肝硬化病人血清lncRNA TUG1表達水平與肝功能、肝纖維化程度的相關(guān)性研究

李軼 尚立

肝硬化是肝臟慢性纖維化的終末期[1],肝纖維化是肝硬化進展的主要過程和必經(jīng)階段[2]。早期識別和治療肝纖維化,有利于改善肝硬化疾病預(yù)后。有研究表明,長鏈非編碼RNA?；撬嵘险{(diào)基因1(long non-coding ribonucleic acid taurine up-regulated gene 1,lncRNA TUG1)可通過促纖維化相關(guān)基因的表達,加速肝纖維化的進展[3]。lncRNA TUG1在脂多糖誘導(dǎo)的肝細胞炎癥中表達上調(diào)[4]。lncRNA TUG1可加速肝纖維化進展,而肝纖維化是肝硬化進展的必經(jīng)階段。因此推測,lncRNA TUG1可能通過促進肝纖維化參與肝硬化疾病進展。本研究探討肝硬化病人血清lncRNA TUG1表達水平與肝纖維化和肝硬化的關(guān)系,以期為逆轉(zhuǎn)或消退肝纖維化、治療肝硬化提供相關(guān)線索。

對象與方法

一、對象

2020年2月～2022年6月本院收治的Child-Pugh分級C級的肝硬化病人92例,為肝硬化組,均為乙型肝炎肝硬化,男38例,女54例,年齡中位數(shù)為50歲。根據(jù)國內(nèi)S2000標(biāo)準(zhǔn)對病人進行肝纖維化分級:S0～S4級,其中S0、S1、S2級歸為輕中度纖維化(輕中度組,61例),S3、S4級歸為重度纖維化(重度組,31例)。同期88例本院健康體檢者為對照組,男33例,女55例,年齡中位數(shù)為50歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)均經(jīng)臨床癥狀、血液學(xué)、腹部超聲檢查確診,診斷符合中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會制訂的診治指南[5];(2)一般資料完整;(3)自愿參與本研究且簽署同意書;(4)非酒精、藥物等不良生活習(xí)慣引起的肝炎、肝硬化。排除標(biāo)準(zhǔn):近6個月內(nèi)接受過激素、干擾素等治療;有肝外膽道梗阻性疾病;全身性炎癥疾病、其他肝病或病毒感染;有精神疾患。

二、方法

1.血清lncRNA TUG1測定:采集對照組體檢當(dāng)天及肝硬化病人入組第二天(治療前)清晨空腹靜脈血,每分鐘3 000轉(zhuǎn)離心15分鐘,分離血清,置于-80 ℃條件保存待測。依照RNA提取試劑盒說明提取血清總RNA,紫外分光光度計測定濃度和純度,260 nm、280 nm波長處吸光度值處于1.8～2.1之間鑒定為合格,依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用熒光定量PCR(qRT-PCR)法對lncRNA TUG1及其內(nèi)參GAPDH進行擴增,序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系:cDNA模板(50 ng/μl)1 μl,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl,SYBR Green qPCR Mix(2×)(美國EZBioscience公司)5 μl,ddH2O加之10 μl。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性1分鐘;95 ℃變性30秒,58 ℃退火30秒,72 ℃延伸30秒,45個循環(huán)后終止。為減小誤差,每個樣品重復(fù)3次,反應(yīng)終止后采用2-ΔΔCT法計算lncRNA TUG1相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

2.肝功能指標(biāo)、肝纖維化指標(biāo)檢測:采用全自動生化分析儀測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)水平,采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定肝纖維化指標(biāo)層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原肽(PⅢP)、Ⅳ型膠原(CⅣ)水平,采用全自動熒光定量PCR儀檢測血清乙型肝炎病毒DNA(HBV DNA)水平。

3.治療方法:肝硬化病人入組后均口服恩替卡韋分散片,每次0.5 mg,每天1次。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果

1.對照組、肝硬化組血清lncRNA TUG1、肝功能指標(biāo)、肝纖維化指標(biāo)水平比較:肝硬化組血清lncRNA TUG1、ALT、AST、TBIL、LN、PⅢP、CⅣ水平均高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組血清lncRNA TUG1、肝功能指標(biāo)、肝纖維化指標(biāo)水平比較

2.肝硬化病人不同肝纖維化程度組一般資料及l(fā)ncRNA TUG1、肝功能指標(biāo)、肝纖維化指標(biāo)比較:重度組肝硬化病程、HBV DNA、lncRNA TUG1、ALT、AST、TBIL、LN、PⅢP、CⅣ均顯著高于輕中度組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組性別、BMI、乙肝家族史比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 肝硬化病人不同肝纖維化程度組一般資料及l(fā)ncRNA TUG1、肝功能指標(biāo)、肝纖維化指標(biāo)比較

3.肝硬化病人血清lncRNA TUG1與肝功能指標(biāo)、肝纖維化指標(biāo)的相關(guān)性:Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,肝硬化病人血清lncRNA TUG1與HBV DNA、ALT、AST、TBIL、LN、PⅢP、CⅣ均呈正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 肝硬化病人血清lncRNA TUG1與肝功能指標(biāo)、肝纖維化指標(biāo)的相關(guān)性

4.血清lncRNA TUG1水平對肝硬化病人肝纖維化程度的評估效能:以血清lncRNA TUG1水平為檢驗變量,以肝硬化病人肝纖維化程度是否發(fā)展為重度為狀態(tài)變量繪制ROC曲線,結(jié)果顯示,lncRNA TUG1評估肝硬化病人肝纖維化程度發(fā)展為重度的曲線下面積(area under curve,AUC)為0.91(95%CI:0.84～0.99),截斷點為2.61,特異性為90.2%,敏感度為83.9%,見圖1。

圖1 血清lncRNA TUG1水平預(yù)測肝硬化患者肝纖維化程度加重風(fēng)險的ROC曲線

5.影響肝硬化病人肝纖維化程度的多因素Logistic回歸分析:將肝硬化病人肝纖維化程度是否發(fā)展為重度作為因變量,以lncRNA TUG1、肝硬化病程、ALT、AST、TBIL、LN、PⅢP、CⅣ為自變量進行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,lncRNA TUG1、LN為肝硬化病人肝纖維化程度發(fā)展為重度獨立影響因素(P=0.001、0.004)。見表5。其中,自變量lncRNA TUG1、肝硬化病程、ALT、AST、TBIL、LN、PIIIP、CIV均為連續(xù)變量,采用實際值;肝纖維化程度為分類變量,賦值情況:重度=1,輕中度=0。

表5 影響肝硬化病人肝纖維化程度的多因素Logistic回歸分析

討論

肝硬化可由肥胖、非酒精性脂肪肝、高飲酒量、乙型或丙型肝炎感染、自身免疫性疾病等引起,是肝臟疾病病人死亡率增加的主要原因[6-8]。肝硬化是在長期炎癥后發(fā)展起來的,炎癥導(dǎo)致健康肝實質(zhì)被纖維化組織和再生結(jié)節(jié)替代,從而導(dǎo)致門靜脈高壓,該疾病從無癥狀期(代償性肝硬化)演變?yōu)榘Y狀期(失代償性肝硬化),其并發(fā)癥往往導(dǎo)致病人生活質(zhì)量受損和高死亡率[9-10]。

研究顯示,肝臟中纖維化逆轉(zhuǎn)至正常結(jié)構(gòu)的程度高于其他組織,其解決纖維化的基礎(chǔ)包括:中斷或清除導(dǎo)致慢性肝損傷的有害物質(zhì),炎癥反應(yīng)的失活和抗炎/恢復(fù)性途徑的誘導(dǎo),細胞外基質(zhì)降解[11-13]。本研究結(jié)果顯示,lncRNA TUG1在肝硬化病人血清中表達水平相對升高,且表達隨肝纖維化程度增加而升高,與Han等[3]研究結(jié)果一致。lncRNA TUG1是一種與肝臟病理性損傷密切相關(guān)的lncRNA,其表達下調(diào)可顯著抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1/smad信號通路激活,進而逆轉(zhuǎn)肝星狀細胞活化,發(fā)揮抗肝纖維化作用[14]。據(jù)此推測,本研究中l(wèi)ncRNA TUG1表達升高可能有利于激活肝星狀細胞,推動肝纖維化病理進程。Li等[15]研究顯示,TUG1的沉默顯著抑制增生性瘢痕纖維化中的細胞外基質(zhì)生物合成,推測lncRNA TUG1也可能與肝纖維化過程中的細胞外基質(zhì)合成有關(guān),其表達上調(diào)可能有利于細胞外基質(zhì)生物合成,進而促進肝纖維化進展。

研究表明,肝功能指標(biāo)及肝纖維化指標(biāo)均與肝硬化病人病情進展有密切聯(lián)系,肝硬化存在以及病人病情加重可造成上述指標(biāo)異常增高[5,16]。Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),血清lncRNA TUG1與肝功能指標(biāo)、肝纖維化指標(biāo)及HBV DNA均呈顯著正相關(guān),證實血清lncRNA TUG1水平可一定程度反映肝硬化病人肝功能損傷和肝纖維化程度。ROC曲線分析結(jié)果提示,lncRNA TUG1水平可評估肝硬化病人肝纖維化程度,當(dāng)其檢測水平高于截斷值2.61時,病人肝纖維化可能進展為重度。

綜上所述,肝硬化病人血清lncRNA TUG1、肝功能指標(biāo)及肝纖維化指標(biāo)水平均明顯升高,lncRNA TUG1與病人肝功能、肝纖維化程度密切相關(guān),其水平隨肝纖維化程度增加而升高。臨床中尋找有效拮抗lncRNA TUG1途徑的相關(guān)物質(zhì),可能有助于逆轉(zhuǎn)或消退肝硬化病人肝纖維化。本研究未納入丙肝肝硬化病人進行對比分析,且未能對治療后病人血清lncRNA TUG1表達水平變化進行動態(tài)檢測,今后將增加樣本量進行對比分析。