單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞中的研究進(jìn)展

杜啟聯(lián) 宋恩峰 胡欽勇

腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞是指浸潤(rùn)腫瘤及周?chē)M織的免疫細(xì)胞,隨腫瘤進(jìn)展及治療發(fā)生動(dòng)態(tài)改變,但其亞群組成和功能目前尚不完全清楚。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)受限于無(wú)法區(qū)分細(xì)胞亞群異質(zhì)性及樣本規(guī)模較小等缺陷,不能詳細(xì)分析數(shù)量少的免疫細(xì)胞如中性粒細(xì)胞,并且多用于前期實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)能精確分析腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞在不同階段腫瘤中的免疫特征和功能狀態(tài)?，F(xiàn)就scRNA-seq在腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞中的研究進(jìn)展和臨床應(yīng)用做一綜述。

一、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

scRNA-seq基本研究流程包括樣本采集、單細(xì)胞分離、裂解、逆轉(zhuǎn)錄、互補(bǔ)DNA擴(kuò)增、文庫(kù)構(gòu)建、高通量測(cè)序、數(shù)據(jù)處理及分析。

1.單細(xì)胞分離:scRNA-seq的關(guān)鍵在于快速、高效、準(zhǔn)確地分離出高質(zhì)量單細(xì)胞。目前常用方法中微流控技術(shù)因其樣本消耗低、高靈敏度、費(fèi)用經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)而廣受歡迎[1]。基于液滴的微流控技術(shù)(微液滴)是目前scRNA-seq最常用的高通量測(cè)序平臺(tái),但微液滴受限于微孔直徑且對(duì)樣本要求高,新開(kāi)發(fā)的單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序把組織抽核后制備成單細(xì)胞核懸液進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,可以完全捕獲直徑較大或易破碎細(xì)胞的RNA信息,也可以對(duì)冷凍樣本測(cè)序[2]。

2.scRNA-seq測(cè)序技術(shù):單細(xì)胞分離后,需盡快提取RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增后生成cDNA庫(kù)。聚合酶鏈反應(yīng)和體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增是構(gòu)建穩(wěn)定cDNA文庫(kù)的方法,隨后對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。scRNA-seq測(cè)序方案主要分為兩類:3'或5'端轉(zhuǎn)錄本測(cè)序和全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本測(cè)序。(1)3'或5'端轉(zhuǎn)錄本測(cè)序:2015年發(fā)現(xiàn)的Drop-seq和in Drop-seq開(kāi)啟了微液滴技術(shù)的時(shí)代[3],這兩種基于液滴的技術(shù)通過(guò)帶有條形碼的磁珠分離單細(xì)胞且應(yīng)用唯一分子標(biāo)識(shí)符糾正偏差。目前scRNA-seq較為成熟的商用高通量測(cè)序平臺(tái)——10×Genomics,在降低成本、耗時(shí)少的同時(shí)顯著提高了細(xì)胞通量,已廣泛應(yīng)用于腫瘤研究[4]。為提高測(cè)序深度和基因檢測(cè)的效率,Seq-Well和Seq-WellS3(第二鏈合成)相繼被開(kāi)發(fā)[5]。scRNA-seq費(fèi)用隨樣本數(shù)量增加。在降低費(fèi)用方面,單細(xì)胞組合索引測(cè)序(sci-RNA-seq)和Sci-Plex的組合模式對(duì)于大規(guī)模的篩選實(shí)驗(yàn)更加劃算,但相對(duì)繁瑣的操作會(huì)增加損傷細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)[6]。綜上所述,3'或5'端轉(zhuǎn)錄本測(cè)序方法總體成本較低,能分析多重樣本但靈敏度相對(duì)較低,主要用于基因表達(dá)的定量。(2)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本測(cè)序:Smart-seq2 是scRNA-seq 分析的標(biāo)準(zhǔn)方法之一,能發(fā)現(xiàn)可變剪接事件和等位基因特異性表達(dá),在其基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了各有優(yōu)劣的Smart-seq3和Smart-seq3xpress[7]。Hahaut等[8]在Smart-seq3系列的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了新的全長(zhǎng)scRNA-seq方法,即FLASH-seq系列,能比Smart-seq3檢測(cè)更多的DNA分子,在減少資源消耗的同時(shí)還可以使用唯一分子標(biāo)識(shí)符糾正誤差。然而,Smart-seq和FLASH-seq系列都不能測(cè)序細(xì)胞中所有RNA,如微小RNA。雖然測(cè)序過(guò)程仍然受到各種實(shí)際挑戰(zhàn),VASA-seq仍是目前唯一集高靈敏度、高效、高通量和全面覆蓋總RNA于一體的新技術(shù)[9]。全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本測(cè)序轉(zhuǎn)錄組覆蓋率較高,但費(fèi)用和測(cè)序難度更高。

3.數(shù)據(jù)處理及分析:高通量測(cè)序后獲得的大量數(shù)據(jù)需要高效的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行處理和分析。一般分析流程包括質(zhì)量控制、映射、標(biāo)準(zhǔn)化、聚類分析、后續(xù)分析。后續(xù)分析可進(jìn)行基因本體論、基因富集分析、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析,還可以通過(guò)擬時(shí)序軌跡分析追溯細(xì)胞分化軌跡等。

二、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞中的應(yīng)用潛力

1.發(fā)現(xiàn)新免疫細(xì)胞亞群及其功能:異質(zhì)性是腫瘤微環(huán)境的主要特征之一,scRNA-seq 可在單個(gè)細(xì)胞層面發(fā)現(xiàn)新的腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞亞群并明確其功能特征。scRNA-seq多應(yīng)用于研究CD8+T細(xì)胞的免疫特征[10],但其他免疫細(xì)胞的功能表型同樣重要。Hiroshi等[11]使用scRNA-seq對(duì)6例非小細(xì)胞肺癌腫瘤微環(huán)境進(jìn)行分析,鑒定了一簇發(fā)揮抗腫瘤作用的CD4+T細(xì)胞新亞群——輔助T細(xì)胞7R,能預(yù)測(cè)腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)和對(duì)程序性死亡受體1(PD-1)阻斷劑的敏感性。輔助T細(xì)胞不同亞群和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞之間的比例與免疫微環(huán)境的促瘤或抑瘤狀態(tài)相關(guān),可作為預(yù)測(cè)病人預(yù)后和免疫治療療效的標(biāo)志物[12]。在一項(xiàng)霍奇金淋巴瘤的研究中,scRNA-seq確定了高表達(dá)LAG3 抑制受體的罕見(jiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群體,是免疫抑制通路的介質(zhì)且有助于免疫逃逸,該亞群常出現(xiàn)在主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-Ⅱ陰性霍奇金淋巴瘤,與這種類型淋巴瘤病人不良預(yù)后相關(guān)。Chen等[13]在鼻咽癌中發(fā)現(xiàn)了一簇之前從未報(bào)道的表達(dá)CLEC9A髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞新亞群,CLEC9A+樹(shù)突狀細(xì)胞與能預(yù)測(cè)鼻咽癌病人預(yù)后的EB病毒DNA水平呈顯著負(fù)相關(guān),這可能是因?yàn)樗铇訕?shù)突狀細(xì)胞受到活躍EB病毒復(fù)制的影響。由CLEC9A+樹(shù)突狀細(xì)胞等髓系免疫細(xì)胞構(gòu)建的免疫特征與鼻咽癌病人生存結(jié)局的改善顯著相關(guān)。scRNA-seq能鑒定與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的新免疫細(xì)胞亞群,強(qiáng)調(diào)了未來(lái)多靶點(diǎn)聯(lián)合治療腫瘤的必要性。

2.追蹤腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞分化譜系和分布特點(diǎn):(1)免疫細(xì)胞譜系分化:細(xì)胞發(fā)育分化是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程,大多數(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)只能捕捉細(xì)胞發(fā)育軌跡的瞬時(shí)狀態(tài)?；诨虮磉_(dá)的級(jí)聯(lián)變化等特征,scRNA-seq能展示不同免疫細(xì)胞的分化軌跡及其潛在機(jī)制。目前,scRNA-seq探索免疫細(xì)胞譜系分化的分析方法主要有兩種,一種是RNA速度分析,原理是未剪接和剪接的 RNA 之間是否處于平衡狀態(tài)可以作為基因是處于誘導(dǎo)狀態(tài)還是抑制狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo);另一種是常用的擬時(shí)序分析,常用機(jī)器學(xué)習(xí)計(jì)算方法包括Monocle3 、SCORPIUS和TSCAN等,主要通過(guò)不同免疫細(xì)胞群體中的表達(dá)差異推測(cè)可能的分化軌跡[14]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞亞群通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮促進(jìn)或抑制腫瘤的作用,因此,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分化軌跡對(duì)腫瘤進(jìn)展意義重大。不同腫瘤的scRNA-seq研究證明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞經(jīng)常同時(shí)表達(dá)經(jīng)典的M1和M2基因[15-16]。擬時(shí)序分析發(fā)現(xiàn),腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在M1(促炎)和M2(促腫瘤)表型之間相互轉(zhuǎn)換。IRF2、IRF8、STAT2等轉(zhuǎn)錄因子可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化為抗腫瘤表型[17]。scRNA-seq還可以聯(lián)合抗原T細(xì)胞受體(TCR)庫(kù)進(jìn)一步追蹤T細(xì)胞發(fā)育軌跡。T細(xì)胞分化軌跡可通過(guò)不同狀態(tài)細(xì)胞的TCR重疊率表示。例如,腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞主要來(lái)源于干細(xì)胞樣CD8+T細(xì)胞的局部擴(kuò)增,scRNA-seq聯(lián)合TCR測(cè)序在多種腫瘤中證明CD103+CD69+組織駐留記憶T細(xì)胞和GZMK+GZMA+效應(yīng)記憶T細(xì)胞也能分化為腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞,這兩簇細(xì)胞從癌旁組織遷移至腫瘤組織后經(jīng)常發(fā)生狀態(tài)轉(zhuǎn)換[18-20]?？傊?腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的分化狀態(tài)及其功能隨腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移動(dòng)態(tài)改變,scRNA-seq可以多時(shí)間、多部位采集腫瘤微環(huán)境的免疫特征。(2)免疫細(xì)胞分布異質(zhì)性:腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞在腫瘤中的作用尚不完全清楚,挑戰(zhàn)之一是不同腫瘤中免疫細(xì)胞的分布異質(zhì)性顯著。高分辨率的scRNA-seq可揭示不同組織中免疫細(xì)胞的分布特點(diǎn)。首先,腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞在不同個(gè)體樣本中分布不一致。腫瘤免疫微環(huán)境中幼稚狀態(tài)、細(xì)胞毒性狀態(tài)和功能障礙狀態(tài)的CD8+T細(xì)胞相對(duì)豐度波動(dòng)很大。在黑色素瘤不同樣本的scRNA-seq研究中,耗竭T細(xì)胞可占到總T細(xì)胞浸潤(rùn)比例的5%至80% ,但一些低比例耗竭T細(xì)胞的樣本中免疫抑制狀態(tài)更明顯[21]。其次,免疫細(xì)胞在不同腫瘤亞型中具有明顯異質(zhì)性。乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)陰性頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤浸潤(rùn)性B細(xì)胞更少。在一項(xiàng)鼻咽癌的scRNA-seq研究中,HPV陰性腫瘤樣本中腫瘤中浸潤(rùn)的B細(xì)胞豐度甚至超過(guò)了T細(xì)胞[22]。通過(guò)scRNA-seq技術(shù),He等[23]發(fā)現(xiàn),血清AFP陽(yáng)性(AFP≥20 ng/mL)比AFP陰性病人腫瘤微環(huán)境的免疫抑制程度更高,包括不同T細(xì)胞亞群的耗竭和SPP1+腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的積累,小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)AFP和SPP1+腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通過(guò)SPP1-CD44 軸促進(jìn)T細(xì)胞耗竭。再次,免疫細(xì)胞在腫瘤組織和癌旁組織及正常組織的分布也不同。參與免疫抑制微環(huán)境形成的腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞亞群,如耗竭T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性B細(xì)胞、LAMP3+樹(shù)突狀細(xì)胞[11,24-27]等,在腫瘤組織中的浸潤(rùn)比例明顯更高。最后,腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞亞群具有時(shí)間特異性,在不同臨床分期對(duì)腫瘤作用可能相反。scRNA-seq發(fā)現(xiàn)血漿樣B細(xì)胞抑制早期非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展,但促進(jìn)晚期腫瘤進(jìn)展[26]。所以,scRNA-seq可推進(jìn)腫瘤病人精準(zhǔn)個(gè)體化治療的發(fā)展。

3.探究泛癌中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的共性和可塑性:泛癌研究是對(duì)多種腫瘤類型或亞型整合分析,旨在識(shí)別在異種腫瘤中共有或特異的特征,這些可能是由特定的分子機(jī)制驅(qū)動(dòng)的。scRNA-seq是研究腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞泛癌特征的強(qiáng)有力工具。T細(xì)胞腫瘤免疫微環(huán)境中數(shù)量最多的細(xì)胞群體。Zheng等[28]整合分析21種腫瘤類型共三百多例腫瘤、癌旁組織、外周血液樣本中的T細(xì)胞發(fā)現(xiàn),腫瘤反應(yīng)T細(xì)胞主要是高異質(zhì)性的耗竭T細(xì)胞、IFNG+卵泡輔助T細(xì)胞和TNFRSF9+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,其中TNFRSF9+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例與免疫治療成功率正相關(guān)。盡管不同腫瘤中腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞異質(zhì)性明顯,但T細(xì)胞耗竭主要通過(guò)效應(yīng)記憶T細(xì)胞和組織駐留記憶T細(xì)胞兩條途徑。研究人員根據(jù)預(yù)后情況把腫瘤樣本分為兩組:終末耗竭CD8+ T 細(xì)胞占比高組和組織駐留記憶CD8+ T 細(xì)胞占比高組,研究結(jié)果顯示后者總體上生存時(shí)間更長(zhǎng)。自然殺傷(NK)細(xì)胞在抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的先天免疫中的作用不可或缺。嵌合抗原受體-NK細(xì)胞治療淋巴瘤和白血病取得了顯著的臨床成功。因?yàn)閷?shí)體瘤中腫瘤浸潤(rùn)NK細(xì)胞了解并不全面,所以相應(yīng)治療在實(shí)體瘤中療效有限。2023年8月,Tang等[29]收集整理分析了24種腫瘤病人和健康人NK細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù),首次在泛癌水平系統(tǒng)地鑒定到14類NK細(xì)胞亞群并詳細(xì)分析了每個(gè)亞群的功能特征。研究者把表達(dá)殺傷性下降、抑制受體上升、高表達(dá)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白等功能失調(diào)特征的表型命名為腫瘤相關(guān)NK細(xì)胞,該細(xì)胞群富集在腫瘤組織中和LAMP3+樹(shù)突狀細(xì)胞相互作用,與多種癌癥類型的不良預(yù)后及免疫治療的耐藥顯著相關(guān)。這些腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的特征為臨床治療提供了重要參考[30]?？傊?泛癌scRNA-seq揭示了異種腫瘤免疫細(xì)胞的共性及可塑性,為未來(lái)腫瘤免疫微環(huán)境相關(guān)研究提供了基線參考和潛在方向。

三、結(jié)語(yǔ)和展望

腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞是影響腫瘤進(jìn)展的主要因素之一。scRNA-seq不僅能確定免疫細(xì)胞亞群和功能特征,還能追蹤細(xì)胞分化軌跡和分布及異種腫瘤的免疫細(xì)胞共性。未來(lái)研究應(yīng)集中于以下幾點(diǎn):(1)進(jìn)一步明確腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞分化軌跡和表型;(2)鑒定不同免疫細(xì)胞亞群在不同腫瘤中的作用;(3)繼續(xù)探索腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞和免疫治療的相關(guān)性。綜上所述,scRNA-seq是解析腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的細(xì)胞和分子特征的強(qiáng)大工具,有望全面闡明腫瘤免疫微環(huán)境異質(zhì)性并促進(jìn)病人精準(zhǔn)個(gè)體化治療。

利益沖突 :所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 :杜啟聯(lián):研究選題設(shè)計(jì)、收集資料、論文撰寫(xiě)、論文修改,宋恩峰:研究選題設(shè)計(jì)、論文撰寫(xiě)、論文修改;胡欽勇:研究選題設(shè)計(jì)、論文撰寫(xiě)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持