響應(yīng)面優(yōu)化超臨界CO2萃取兩粵黃檀揮發(fā)油的工藝研究及成分分析

田歌 劉雙

摘要：兩粵黃檀作為一種名貴的香料，提高其揮發(fā)油的萃取率對(duì)工業(yè)生產(chǎn)具有重大意義。以兩粵黃檀為原料，采用超臨界CO2萃取兩粵黃檀揮發(fā)油，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化萃取工藝，并確定了最佳工藝條件，利用氣相色譜-離子遷移譜對(duì)兩粵黃檀揮發(fā)油的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析。研究表明，兩粵黃檀揮發(fā)油最佳萃取工藝為萃取壓力30 MPa、萃取溫度42 ℃、萃取時(shí)間3.8 h，在此條件下?lián)]發(fā)油得率為（7.23±0.03）%，與理論值（7.44±0.05）%相差不大。從兩粵黃檀揮發(fā)油中共鑒定出47種已知化合物，包含醛類17種、酮類3種、醇類5種、酯類11種、萜烯類7種、酸類2種、呋喃類1種、硫醚類1種，醛類、酯類和萜烯類是兩粵黃檀揮發(fā)油的主要揮發(fā)性成分。該研究對(duì)兩粵黃檀揮發(fā)油的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用有重要意義。

關(guān)鍵詞：兩粵黃檀；揮發(fā)油；超臨界CO2萃??；響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)：TS224.4????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號(hào)：1000-9973（2024）02-0152-05

Optimization of Supercritical CO2 Extraction Process of Volatile Oil from?Dalbergia benthamii by Response Surface Methodology and Its Component Analysis

Abstract： Dalbergia benthamii is a precious spice. Improving the extraction rate of its volatile oil is of great significance for industrial production. With Dalbergia benthamii as the raw material， supercritical CO2 extraction method is used to extract volatile oil from Dalbergia benthamii. Based on single factor test， response surface methodology is used to optimize the extraction process， and the optimal process conditions are determined. The volatile components of Dalbergia benthamii volatile oil are analyzed by gas chromatography-ion migration spectrometry. The results show that the optimal extraction process of volatile oil from Dalbergia benthamii is as follows：extraction pressure is 30 MPa， extraction temperature is 42 ℃ and extraction time is 3.8 h. The yield of volatile oil under these conditions is （7.23±0.03）%， which is close to the theoretical value of （7.44±0.05）%. A total of 47 known compounds are identified from volatile oil of Dalbergia benthamii， including 17 aldehydes， 3 ketones， 5 alcohols， 11 esters， 7 terpenes， 2 acids， 1 furan and 1 thioether. Aldehydes， esters and terpenes are the main volatile compounds in Dalbergia benthamii volatile oil. This study is of great significance for the further development and utilization of volatile oil from Dalbergia benthamii.

Key words： Dalbergia benthamii; volatile oil; supercritical CO2 extraction; response surface methodology

兩粵黃檀（Dalbergia benthamii）[1-2]是豆科蝶形花亞科黃檀屬植物，生于疏林或灌叢中，常攀援于樹(shù)上，主產(chǎn)于我國(guó)廣東、海南、廣西、云南等地及緬甸、印度尼西亞等地，因其產(chǎn)地少、多年成材，故非常名貴。由于其具有留香持久和揮發(fā)緩慢的特性，兩粵黃檀自古以來(lái)被用作名貴商用香料的原材料[3]，其木心的提取物也用于香精香料的調(diào)配[4]；同時(shí)其也是名貴的中藥材，古戰(zhàn)場(chǎng)上用于刀傷止血，《中國(guó)植物志》記載其“全株可藥用，治風(fēng)濕、跌打、扭挫傷，有消腫止痛之效”[5]，還具有治療心血管病、糖尿病、急性腸胃炎、抗氧化、抗菌、抗炎等多種功效及生物活性[6]。

目前對(duì)植物心材揮發(fā)油的提取方法主要有傳統(tǒng)提取方法如水蒸氣蒸餾法[4]、溶劑萃取法、壓榨法[7]和新型提取方法如超聲波輔助提取法、固相微萃取法、離子液體提取法、超臨界萃取法和亞臨界萃取法等[8-10]。作為名貴的香料，提高其揮發(fā)油的萃取率對(duì)工業(yè)生產(chǎn)具有重大意義。提升兩粵黃檀揮發(fā)油的萃取率應(yīng)從兩個(gè)方面著手：一是要選取高效率的提取方法；二是通過(guò)工藝優(yōu)化來(lái)提升提取率。Hui等[11]在比較超臨界CO2萃取與有機(jī)溶劑萃取法提取地錢科植物揮發(fā)油時(shí)發(fā)現(xiàn)，超臨界CO2萃取可以更好地保留有效成分，減少有機(jī)溶劑的殘留。宋歡等[12]發(fā)現(xiàn)，超臨界CO2萃取比水蒸氣蒸餾法的提取率更高，揮發(fā)油的有效成分更多。楊君等[13]綜述得出，超臨界CO2萃取具有可室溫操作、提取原料中大部分有效成分、減少殘留、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，可見(jiàn)超臨界CO2萃取法在揮發(fā)油提取中的應(yīng)用有一定優(yōu)勢(shì)。

近年來(lái)，對(duì)于黃檀屬植物揮發(fā)油及功能性成分的研究主要集中于降香黃檀、斜葉黃檀，關(guān)于兩粵黃檀的相關(guān)研究文獻(xiàn)極少，僅梁天堅(jiān)等[6]采用乙醇提取兩粵黃檀，其焦點(diǎn)在于兩粵黃檀提取物的功能性成分分析，并研究了抗炎活性。盧澄生等[2]采用超臨界CO2萃取不同產(chǎn)地兩粵黃檀揮發(fā)油并進(jìn)行了成分分析，未對(duì)超臨界CO2提取工藝進(jìn)行深入研究。2018年張?zhí)K慧等對(duì)斜葉黃檀的超臨界CO2提取工藝進(jìn)行了研究，但是工藝優(yōu)化后精油提取率最高僅達(dá)到4.757 3%[14]。本研究對(duì)黃檀屬植物兩粵黃檀揮發(fā)油的超臨界CO2萃取工藝進(jìn)行深入研究，得到兩粵黃檀揮發(fā)油的最佳提取工藝，并采用氣相色譜-離子遷移譜（GC-IMS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)其揮發(fā)油成分進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

兩粵黃檀：由海南景和農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司提供，置于烘箱中恒溫烘干（40 ℃）至恒重，粉碎后過(guò)40目篩備用；高純二氧化碳（純度99.999%）：太原市泰能氣體有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

超臨界CO2萃取裝置 江蘇溫奧機(jī)械設(shè)備有限公司；FlavourSpec 氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用儀 德國(guó) G.A.S 公司；五谷雜糧中藥材打碎機(jī) 溫嶺市奧力中藥機(jī)械有限公司；DHG-9023A型臺(tái)式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海壘固儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 兩粵黃檀揮發(fā)油提取及提取率計(jì)算

稱取40 g左右粉末樣品，用醫(yī)用紗布包裹兩層，用棉線封口后置于萃取釜中。設(shè)定所需萃取溫度、萃取壓力，待萃取壓力與萃取溫度穩(wěn)定達(dá)到設(shè)定值后計(jì)時(shí)，開(kāi)始對(duì)物料進(jìn)行超臨界CO2萃取，萃取結(jié)束后收集揮發(fā)油，計(jì)算提取率。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 萃取壓力對(duì)兩粵黃檀揮發(fā)油提取率的影響

采用萃取溫度為45 ℃，萃取壓力分別為20，25，30，35，40 MPa，萃取2 h，計(jì)算不同萃取壓力條件下的萃取率，探索最佳的萃取壓力。

1.3.2.2 萃取溫度對(duì)兩粵黃檀揮發(fā)油提取率的影響

采用萃取壓力為30 MPa，萃取溫度分別為30，35，40，45，50 ℃，萃取2 h，計(jì)算不同萃取溫度條件下的萃取率，探索最佳的萃取溫度。

1.3.2.3 萃取時(shí)間對(duì)兩粵黃檀揮發(fā)油提取率的影響

采用萃取溫度為45 ℃，萃取時(shí)間分別為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 h，萃取壓力為30 MPa，計(jì)算不同萃取時(shí)間條件下的萃取率，探索最佳萃取時(shí)間。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以兩粵黃檀揮發(fā)油萃取率（Y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert V8.0.6.1軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)方案，選取萃取壓力（A）、萃取溫度（B）、萃取時(shí)間（C）為自變量，采用三因素三水平響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)分析，因素水平見(jiàn)表1，以此對(duì)兩粵黃檀揮發(fā)油萃取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.4 兩粵黃檀揮發(fā)油成分分析

取兩粵黃檀揮發(fā)油10 mL置于20 mL頂空瓶中，90 ℃孵育20 min后進(jìn)樣。

氣相色譜-離子遷移譜條件：美國(guó)Restek公司W(wǎng)ax色譜柱，柱長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑0.53 mm，膜厚1 μm，柱溫60 ℃，載氣/漂移氣為N2，進(jìn)樣體積100 μL，孵育時(shí)間20 min，孵育溫度90 ℃，進(jìn)樣針溫度95 ℃，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差以及百分?jǐn)?shù)表示。運(yùn)用Design-Expert V8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，氣相色譜-離子遷移譜數(shù)據(jù)采用儀器配套的數(shù)據(jù)庫(kù)和人工譜圖解析進(jìn)行定性分析，采用峰面積歸一法分析各化合物的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 萃取壓力對(duì)兩粵黃檀揮發(fā)油提取率的影響

在萃取溫度45 ℃、萃取時(shí)間2.0 h的條件下，改變萃取壓力后萃取率變化見(jiàn)圖1。

由圖1可知，萃取壓力大于20 MPa時(shí)，提取率隨著壓力的增大而提升；當(dāng)萃取壓力大于30 MPa時(shí)，提取率反而降低。萃取壓力增大時(shí)，溶劑分子運(yùn)動(dòng)速度增加，且萃取物在超臨界CO2中的溶解度增大，使得提取率不斷提高，但當(dāng)萃取壓力增大到一定程度時(shí)，CO2密度過(guò)大，影響了CO2的傳質(zhì)效率，萃取能力反而降低，同時(shí)也增加了設(shè)備的成本[15-16]。

2.1.2 萃取溫度對(duì)兩粵黃檀揮發(fā)油提取率的影響

在萃取壓力30 MPa、萃取時(shí)間2.0 h的條件下，改變萃取溫度后萃取率變化見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨著萃取溫度的升高，萃取率不斷提高，當(dāng)萃取溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，隨著萃取溫度的升高，萃取率開(kāi)始下降，可以看出萃取溫度是萃取率的關(guān)鍵因素之一。萃取溫度提高有助于增加CO2的流動(dòng)性，使揮發(fā)油更容易溶出，從而提高萃取率；溫度過(guò)高時(shí)，揮發(fā)油在超臨界CO2中的溶解度降低，反而降低了提取率[17]。

2.1.3 萃取時(shí)間對(duì)兩粵黃檀揮發(fā)油提取率的影響

在萃取壓力30 MPa、萃取溫度45 ℃的條件下，改變萃取時(shí)間后萃取率變化見(jiàn)圖3。

由圖3可知，萃取時(shí)間在1～5 h變化時(shí)，提取率先升高，當(dāng)萃取時(shí)間達(dá)到3 h后萃取率隨著時(shí)間的增加變化幅度不大。一般情況下，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，萃取率逐漸提高，待萃取率達(dá)到峰值后，再延長(zhǎng)萃取時(shí)間，萃取率不再增加，反而消耗CO2，使得生產(chǎn)成本提高。

2.2 兩粵黃檀揮發(fā)油超臨界CO2萃取的工藝優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面分析法對(duì)兩粵黃檀揮發(fā)油提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 方差分析及顯著性檢驗(yàn)

采用Design-Expert V8.0.6.1軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，其中兩粵黃檀揮發(fā)油得率（Y）與萃取壓力（A）、萃取溫度（B）、萃取時(shí)間（C）的擬合方程Y=7.18+1.31A－0.48B+0.46C+0.35AB－0.025AC－0.15BC－2.48A2－0.95B2－0.38C2。

模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，F(xiàn)值越大，P值越小，表示其對(duì)應(yīng)響值變異性影響越大[18]。本試驗(yàn)構(gòu)建的響應(yīng)面回歸模型的P<0.01，表明影響極顯著；失擬項(xiàng)的P=0.175 0>0.05，影響不顯著，說(shuō)明回歸方程與實(shí)際擬合度較好，能夠用于兩粵黃檀揮發(fā)油萃取試驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)。由表3方差分析可知，3個(gè)單因素對(duì)萃取率都有極顯著影響，交互項(xiàng)AB的影響顯著，AC和BC的影響不顯著。

2.2.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)曲面圖可以表現(xiàn)A、B、C 3個(gè)因素兩兩之間的交互作用對(duì)Y值的影響。由三維響應(yīng)面圖中的坡度可以判斷顯著性，坡面越陡越顯著[19]。各因素之間交互作用的三維響應(yīng)面圖見(jiàn)圖4～圖6。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

運(yùn)用Design-Expert V8.0.6.1 軟件優(yōu)化工藝條件，最佳工藝參數(shù)為萃取壓力28.88 MPa、萃取溫度42.40 ℃、萃取時(shí)間3.80 h，此時(shí)揮發(fā)油提取率達(dá)到最高7.44%?？紤]到實(shí)際提取時(shí)的局限性及方便性，各工藝參數(shù)四舍五入取整：萃取壓力30 MPa，萃取溫度42 ℃，萃取時(shí)間3.8 h，在此條件下進(jìn)行兩粵黃檀揮發(fā)油提取驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，揮發(fā)油平均得率為7.23%，與理論值7.44%基本相符，說(shuō)明該模型的預(yù)測(cè)性良好、可靠，能夠用于實(shí)際操作。

2.3 兩粵黃檀揮發(fā)油的組成分析

對(duì)上述最佳工藝條件下萃取得到的兩粵黃檀揮發(fā)油進(jìn)行氣相色譜-離子遷移譜分析，得氣相色譜-離子遷移譜圖，見(jiàn)圖7。橫坐標(biāo)代表離子遷移時(shí)間，縱坐標(biāo)代表氣相色譜的保留時(shí)間，圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物，顏色的深淺代表物質(zhì)的濃度大小，顏色越淺代表濃度越小。

由圖7可知，兩粵黃檀揮發(fā)油揮發(fā)性組分能夠通過(guò)GC-IMS 技術(shù)很好地分離，結(jié)果顯示兩粵黃檀揮發(fā)油中共分離出105個(gè)峰，包括部分化合物的單體及其二聚體，共鑒定出47種化合物。47種化合物中含醛類17種、酮類3種、醇類5種、酯類11種、萜烯類7種、酸類2種、呋喃類1種、硫醚類1種，可以看出醛類、酯類和萜烯類是兩粵黃檀揮發(fā)油的主要揮發(fā)性成分。采用峰面積歸一法分析各化合物的相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，采用超臨界CO2萃取得到的兩粵黃檀揮發(fā)油中主要易揮發(fā)性成分有己醛、異戊醛、苯甲醛、丁醛、糠醛、丙醛、正戊醛、（Z）-丙酸-3-己烯酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、正丁醇、α-蒎烯、α-異松油烯、β-蒎烯、檸檬烯、二甲基硫醚。α-蒎烯是一種雙環(huán)單萜分子，具有保護(hù)腦組織、減少腦水腫和梗塞范圍、改善神經(jīng)行為的功能，此外，Li等[20]還發(fā)現(xiàn)其能夠增加抗氧化酶活性，減輕酒精誘導(dǎo)的小鼠肝損傷。檸檬烯是一種天然單萜烯，在抑制微生物生長(zhǎng)繁殖、抗炎、抗腫瘤、止咳平喘、緩解抑郁等方面都有作用[21]。此外，α-異松油烯、β-蒎烯等也具有抗炎、抑菌活性[22-23]。α-蒎烯、α-異松油烯、β-蒎烯、莰烯、檸檬烯和其中的一些酯類、醛類都能夠賦予兩粵黃檀揮發(fā)油草香、藥香、木香等氣味。此研究結(jié)果對(duì)明確兩粵黃檀揮發(fā)油易揮發(fā)性成分的構(gòu)成及含量，以及對(duì)兩粵黃檀揮發(fā)油的藥用價(jià)值及保健功能的進(jìn)一步研究具有重要意義。

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化了超臨界CO2萃取兩粵黃檀揮發(fā)油的萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間等工藝條件，得到最佳工藝條件為萃取壓力28.88 MPa、萃取溫度42.40 ℃、萃取時(shí)間3.80 h，在此條件下預(yù)測(cè)揮發(fā)油得率為7.44%?？紤]到實(shí)際提取時(shí)的局限性及方便性，經(jīng)驗(yàn)證，在萃取壓力30 MPa、萃取溫度42 ℃、萃取時(shí)間3.8 h的條件下?lián)]發(fā)油得率為7.23%，可以看出采用超臨界CO2萃取兩粵黃檀揮發(fā)油的得率高，對(duì)易揮發(fā)性功能成分破壞小。采用氣相色譜-離子遷移譜對(duì)兩粵黃檀揮發(fā)油易揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，共鑒定出47種已知成分，包含醛類17種、酮類3種、醇類5種、酯類11種、萜烯類7種、酸類2種、呋喃類1種、硫醚類1種。其中醛類、酯類、萜烯類化合物占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，由于兩粵黃檀具有草藥香、木香等揮發(fā)性成分及生物活性成分，故可作為藥物和精油的原材料，本研究也為兩粵黃檀進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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