響應(yīng)面法優(yōu)化三孢布拉氏霉菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素工藝

丁長(zhǎng)河 樊俊敏 尹萌 李亞麗 魏書(shū)音 高軍

摘要：番茄紅素除了呈現(xiàn)鮮艷的顏色外，還具有比較強(qiáng)的抗氧化等功能性作用，因而廣泛應(yīng)用于食品、飲料等行業(yè)，與化學(xué)合成法相比，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的番茄紅素因?yàn)榘踩愿子诒幌M(fèi)者接受，因此提高天然番茄紅素產(chǎn)量意義重大。文章以三孢布拉氏霉菌為發(fā)酵菌種，通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，從而提高番茄紅素的產(chǎn)量與純度。經(jīng)過(guò)單因素分析和響應(yīng)面優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件為玉米粉20 g/L、黃豆粉25 g/L、磷酸二氫鉀0.6 g/L、硫酸鎂0.9 g/L、玉米油12 g/L、發(fā)酵液初始pH 6.5、接種量6%、裝液量40 mL/250 mL、正菌和負(fù)菌接種比例1∶15、培養(yǎng)溫度26 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、振蕩培養(yǎng)144 h，在42 h時(shí)加入0.4 g/L的2-氨基-6-甲基吡啶作為環(huán)化酶阻斷劑，在此條件下番茄紅素的產(chǎn)量為626.25 mg/L，比優(yōu)化前提高了25.6%，該研究結(jié)果可為番茄紅素工業(yè)化生產(chǎn)提供參考，有助于更好地應(yīng)用于肉品、飲料、保健品等行業(yè)。

關(guān)鍵詞：三孢布拉氏霉菌；番茄紅素；發(fā)酵工藝；響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)：TS201.3????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號(hào)：1000-9973（2024）02-0102-08

Optimization of Lycopene Produced by Fermentation of Blakeslea trispora by Response Surface Method

Abstract： Lycopene not only presents bright color， but also has strong antioxidation and other functional effects， making it widely used in food and beverage industries. Compared with chemical synthesis， lycopene produced by microbial fermentation is more easily accepted by consumers because of its safety， so it is of great significance to improve the yield of natural lycopene. In this paper， with Blakeslea trispora as the fermentation strain， the composition of the fermentation medium and the fermentation conditions are optimized by response surface methodology， so as to improve the yield and purity of lycopene. After single factor analysis and response surface optimization， the medium composition and culture conditions are as follows： corn flour is 20 g/L， soybean flour is 25 g/L， potassium dihydrogen phosphate is 0.6 g/L， magnesium sulfate is 0.9 g/L， corn oil is 12 g/L， initial pH of the fermentation broth is 6.5， inoculation amount is 6%， loading volume is 40 mL/250 mL， inoculation ratio of positive bacteria and negative bacteria is 1∶15， culture temperature is 26 ℃， rotational speed is 180 r/min， shaking culture for 144 h， and 0.4 g/L 2-amino-6-methylpyridine is added as a cyclase blocker at 42 h. Under such conditions， the yield of lycopene is 626.25 mg/L， which is 25.6% higher than that before optimization. The results of this study can provide references for the industrial production of lycopene， which is helpful for better application in meat， beverage and health care product industries.

Key words： Blakeslea trispora； lycopene； fermentation process； response surface method

番茄紅素分子式為C40H56，相對(duì)分子質(zhì)量為536.88，熔點(diǎn)為176 ℃，含有11個(gè)共軛鍵和2個(gè)非共軛鍵，是脂溶性類胡蘿卜素[1]。番茄紅素主要存在于番茄、西瓜、番石榴、木瓜、葡萄柚等紅色果蔬中[2]，是目前自然界中抗氧化能力極強(qiáng)的類胡蘿卜素，其單重態(tài)氧猝滅率是β-胡蘿卜素的2倍、α-生育酚的100倍[3]。一些報(bào)道表明，番茄紅素在抗癌[4-6]、抗炎[7-8]、預(yù)防心血管疾病[9—11]方面發(fā)揮著重要作用。

番茄紅素在肉制品、飲料、保健品等行業(yè)也有廣泛應(yīng)用。番茄紅素通過(guò)添加乳化劑、抗氧化劑等輔料可以制成水溶性番茄紅素乳液，改善番茄紅素的色調(diào)，將其應(yīng)用于肉制品中可以使生鮮肉的色澤鮮艷，同時(shí)能保鮮保濕，延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期[12]。將番茄紅素作為食品添加劑添加到腌肉制品中，不僅能很好地起到護(hù)色作用，而且能在一定程度上代替亞硝酸鹽，減輕其對(duì)人體的傷害[13]。番茄紅素的添加能夠幫助降低大豆油的過(guò)氧化值，緩解油脂劣變[14]。李長(zhǎng)濱等[15]對(duì)比了添加番茄紅素前后飲料的酸價(jià)和過(guò)氧化值，發(fā)現(xiàn)添加番茄紅素可有效降低飲料的酸價(jià)和過(guò)氧化值。

番茄紅素在植物中的含量較低、提取過(guò)程復(fù)雜、提取成本高昂、提取率較低，并易受到地理、氣候、時(shí)間和空間的限制，無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)使用。而采用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)番茄紅素不受季節(jié)控制、操作工藝簡(jiǎn)便、用時(shí)少、生產(chǎn)成本較低，并且因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中不使用大量有毒有害化學(xué)品，使得生產(chǎn)出的番茄紅素更加安全，消費(fèi)者接受度高，對(duì)環(huán)境的危害更小[16]。目前生產(chǎn)番茄紅素的菌株主要有紅酵母[17]、三孢布拉氏霉菌、粗糙脈孢菌等，但紅酵母產(chǎn)量比三孢布拉氏霉菌低[18]，而粗糙脈孢菌產(chǎn)番茄紅素優(yōu)化后的產(chǎn)量?jī)H為9.64 mg/L[19]。

三孢布拉氏霉菌是目前胡蘿卜素工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的主要菌株，分為正菌和負(fù)菌，其中負(fù)菌是主要的色素生產(chǎn)菌[20]，合成機(jī)理為正、負(fù)菌種混合培養(yǎng)后產(chǎn)生大量性激素類物質(zhì)——三孢酸，進(jìn)而轉(zhuǎn)化合成終產(chǎn)物β-胡蘿卜素，而番茄紅素是中間產(chǎn)物，通常在發(fā)酵過(guò)程中加入番茄紅素環(huán)化酶阻斷劑使合成過(guò)程停止在番茄紅素積累階段[21]。該研究使用三孢布拉霉菌作為菌種，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前人的研究，以2-氨基-6-甲基吡啶作為環(huán)化酶阻斷劑，添加量為0.4 g/L、添加時(shí)間為發(fā)酵42 h時(shí)，研究發(fā)酵培養(yǎng)基中成分和發(fā)酵條件對(duì)番茄紅素產(chǎn)量和純度的影響，并選擇出對(duì)番茄紅素產(chǎn)量影響最大的3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，以期得到高產(chǎn)量的番茄紅素。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

三孢布拉霉正菌（CCTCC AF 97006）、負(fù)菌（CCTCC AF 96002）：購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；葵花籽油、玉米油：中糧福臨門(mén)股份有限公司；大豆油、低芥酸菜籽油、芝麻香油、花生油：益海嘉里金龍魚(yú)糧油食品股份有限公司；棕櫚油：天津聚龍嘉華投資集團(tuán)有限公司；玉米粉、黃豆：永輝超市。

1.1.2 主要試劑

石油醚、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、甲醇、乙腈、二氯甲烷：天津科密歐化學(xué)試劑廠；2-氨基-6-甲基吡啶：上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

種子培養(yǎng)基：玉米粉44 g/L，黃豆粉19 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，VB1 0.004 g/L，pH 6.5，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉20 g/L，黃豆粉45 g/L，大豆油16 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4 0.6 g/L，VB1 0.004 g/L，pH 6.5，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004N電子天平 上海菁海儀器有限公司；LDZX-75KBS立式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；MVS-1漩渦混合器 北京金北德工貿(mào)有限公司；SW-CJ-1F無(wú)菌操作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SHZ-2AGA數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器 金壇華峰儀器有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ZKXF-2電熱真空干燥箱 上海樹(shù)立儀器儀表有限公司；EL20-K pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；90-2型定時(shí)恒溫磁力攪拌器 上海滬西分析儀器廠；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；1-14型離心機(jī) Sigma-Aldrich公司；KQ-250超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;UV-6000PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;Agilent 1260高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 三孢布拉氏霉菌發(fā)酵工藝優(yōu)化

菌種活化：將斜面保藏的菌種用劃線的方式接種到新的培養(yǎng)基上，然后將其放入26 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。

種子培養(yǎng)：在250 mL的錐形瓶中加入50 mL的種子培養(yǎng)基，并將其與生理鹽水一起進(jìn)行高壓滅菌處理。將經(jīng)過(guò)滅菌處理的種子培養(yǎng)基和生理鹽水放置在無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行冷卻。在無(wú)菌環(huán)境下，采用5 mL生理鹽水進(jìn)行反復(fù)抽吸和沖洗，將B. trispora正菌和負(fù)菌接種在斜面培養(yǎng)基上。隨后，將正、負(fù)菌孢子懸浮液振蕩混勻，并各取1 mL加入到種子培養(yǎng)基中，在26 ℃、180 r/min的振蕩條件下培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：在250 mL錐形瓶中裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，高壓滅菌后放置在無(wú)菌操作臺(tái)上冷卻。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前人的研究結(jié)果，將B. trispora正菌和負(fù)菌種子培養(yǎng)基以1∶5（體積比）進(jìn)行混合，混合均勻，在26 ℃、180 r/min條件下，需振蕩培養(yǎng)144 h，在42 h時(shí)加入0.4 g/L的2-氨基-6-甲基吡啶。

在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別考察不同玉米粉添加量（10，20，30，40，50 g/L）、黃豆粉添加量（15，25，35，45，55 g/L）、磷酸二氫鉀添加量（0.3，0.6，0.9，1.2，1.5 g/L）、硫酸鎂添加量（0.3，0.6，0.9，1.2，1.5 g/L）、不同種類植物油及其添加量（4，8，12，16，20 g/L）、發(fā)酵液初始pH（5.0，5.5，6.0，6.5，7.0）、接種量（4%、6%、8%、10%、12%、14%）、裝液量（30，40，50，60，70 mL/250 mL）、接種比例（1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20）對(duì)番茄紅素產(chǎn)量、純度及發(fā)酵生物量的影響。采用單因素實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)番茄紅素產(chǎn)量影響最大的3個(gè)因素。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

1.3.2 測(cè)定方法

參考文獻(xiàn)[22]的方法提取番茄紅素：稱取10 mL發(fā)酵液，以3 500 r/min離心10 min，棄去上清液后用蒸餾水沖洗菌體沉淀物，洗滌3次，在同樣條件下離心后棄去上清液。在45 ℃真空干燥箱中干燥至恒重。在黑暗環(huán)境下，稱取一定量干燥后的菌體在研缽中加入石英砂快速研磨成粉，轉(zhuǎn)移到棕色具塞錐形瓶中，加入20 mL石油醚，置于振蕩器中，在室溫下以180 r/min振蕩提取1 h，從研磨至振蕩過(guò)程需避光。

參考文獻(xiàn)[23]的方法測(cè)定番茄紅素產(chǎn)量：通過(guò)高效液相色譜法對(duì)番茄紅素的含量進(jìn)行定性定量分析，采用Agilent 1260高效液相色譜儀，色譜柱C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；高效液相色譜條件：流動(dòng)相A：5%超純水；流動(dòng)相B：12%甲醇；流動(dòng)相C：60%乙腈；流動(dòng)相D：23%二氯甲烷；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)469 nm，柱溫28 ℃。

參考文獻(xiàn)[24]的方法測(cè)定番茄紅素純度：

式中：S1為番茄紅素峰面積，mAU；S2為總色素峰面積，mAU。

參考文獻(xiàn)[25]的方法測(cè)定菌體生物量：菌體在45 ℃真空干燥箱中干燥至恒重。

式中：w為菌體干重，g；v為發(fā)酵液體積，mL。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Origin 2018作圖，采用SPSS 24.0軟件中的LSD、Duncan進(jìn)行顯著性分析，采用Design Expert Box-Behnken法進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 玉米粉添加量對(duì)B. trispora番茄紅素產(chǎn)量的影響

據(jù)報(bào)道，以B. trispora為菌種生產(chǎn)類胡蘿卜素的培養(yǎng)基成分中，從碳源的選擇來(lái)判斷，玉米粉優(yōu)于葡萄糖、蔗糖、乳糖等[9]，故選擇玉米粉作為碳源。選定黃豆粉添加量為45 g/L，大豆油添加量為16 g/L，KH2PO4 添加量為1.5 g/L，MgSO4添加量為0.6 g/L，VB1添加量為0.004 g/L，發(fā)酵液初始pH為6.5，裝液量為50 mL/250 mL，接種比例為正菌∶負(fù)菌為1∶5（體積比），接種量為10%，考察不同玉米粉添加量對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，隨著玉米粉添加量的逐漸增加，番茄紅素產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)玉米粉添加量為20 g/L時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到最大值350.27 mg/L。隨著玉米粉添加量的繼續(xù)增加，番茄紅素產(chǎn)量、生物量和純度均下降，可能是因?yàn)橛衩追壑泻写罅康矸酆凸绦挝镱w粒，煮沸后淀粉糊化導(dǎo)致培養(yǎng)基黏稠度增加[26]，溶氧不足不利于菌體生長(zhǎng)，從而影響了番茄紅素的合成。

2.1.2 黃豆粉添加量對(duì)B. trispora番茄紅素產(chǎn)量的影響

大量研究發(fā)現(xiàn)，在B. trispora生產(chǎn)類胡蘿卜素中選擇有機(jī)氮源更有利于產(chǎn)量的提高[27]，而黃豆是最常見(jiàn)易得的有機(jī)氮源，故以黃豆粉作為氮源。選定玉米粉添加量為20 g/L，大豆油添加量為16 g/L，KH2PO4添加量為1.5 g/L，MgSO4添加量為0.6 g/L，VB1添加量為0.004 g/L，發(fā)酵液初始pH為6.5，裝液量為50 mL/250 mL，接種比例為正菌∶負(fù)菌為1∶5（體積比），接種量為10%，考察不同黃豆粉添加量對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨著黃豆粉添加量的逐漸增加，番茄紅素產(chǎn)量呈先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)黃豆粉添加量為25 g/L時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量、純度和菌體生物量均達(dá)到最大值，番茄紅素產(chǎn)量達(dá)358.13 mg/L。有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)碳源添加量一定時(shí)，限制氮源可以提高類胡蘿卜素在細(xì)胞內(nèi)的積累[25]，但隨著黃豆粉添加量的繼續(xù)增加，菌體生物量和番茄紅素產(chǎn)量均呈下降趨勢(shì)，可能是過(guò)量的黃豆粉導(dǎo)致溶氧不足從而影響菌體生長(zhǎng)，使番茄紅素產(chǎn)量下降。

2.1.3 KH2PO4添加量對(duì)B. trispora番茄紅素產(chǎn)量的影響

磷酸二氫鉀為微生物生長(zhǎng)提供K和P兩種營(yíng)養(yǎng)元素，并且磷酸鹽在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)發(fā)酵液起到緩沖作用，選定玉米粉添加量為20 g/L，黃豆粉添加量為25 g/L，大豆油添加量為16 g/L，MgSO4添加量為0.6 g/L，VB1添加量為0.004 g/L，發(fā)酵液初始pH為6.5，裝液量為50 mL/250 mL，接種比例為正菌∶負(fù)菌為1∶5（體積比），接種量為10%，考察不同磷酸二氫鉀添加量對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，隨著磷酸二氫鉀添加量的逐漸增加，番茄紅素產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)磷酸二氫鉀添加量為0.6 g/L時(shí)，菌體生物量和番茄紅素產(chǎn)量最高，番茄紅素產(chǎn)量為301.75 mg/L。隨著磷酸二氫鉀添加量的繼續(xù)增加，番茄紅素產(chǎn)量和生物量逐漸下降，說(shuō)明其添加量的增加使發(fā)酵液偏堿性[23]，影響了三孢布拉氏霉菌的生長(zhǎng)和代謝。

2.1.4 MgSO4添加量對(duì)B. trispora番茄紅素產(chǎn)量的影響

鎂元素不參與任何細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的組成，但鎂離子是許多酶的激活劑，能參與菌體的生長(zhǎng)代謝[28]，對(duì)番茄紅素合成起著重要作用，故選定玉米粉添加量為20 g/L，黃豆粉添加量為25 g/L，大豆油添加量為16 g/L，KH2PO4 添加量為0.6 g/L，VB1添加量為0.004 g/L，發(fā)酵液初始pH為6.5，裝液量為50 mL/250 mL，接種比例為正菌∶負(fù)菌為1∶5（體積比），接種量為10%，考察不同MgSO4添加量對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，隨著硫酸鎂添加量的逐漸增加，番茄紅素產(chǎn)量總體上呈先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)MgSO4添加量為0.9 g/L時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量最高，為269.82 mg/L。隨著MgSO4添加量的繼續(xù)增加，番茄紅素產(chǎn)量緩慢下降，番茄紅素的純度和生物量變化不大。

2.1.5 不同植物油對(duì)B. trispora番茄紅素產(chǎn)量的影響

在B. trispora的發(fā)酵過(guò)程中，外源性植物油被菌體分泌的胞外脂肪酶水解，水解產(chǎn)物為脂肪酸和甘油，脂肪酸通過(guò)氧化后成為乙酰輔酶A，乙酰輔酶A不僅可以進(jìn)入三羧酸循環(huán)，為細(xì)胞生長(zhǎng)代謝提供能量，而且可以作為番茄紅素和脂質(zhì)的共同前體物質(zhì)[24]。細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)去飽和度的增加有利于番茄紅素的溶解，添加外源性植物油，特別是亞油酸和亞麻酸含量較高的植物油，可以提高?；视椭舅岬娜ワ柡投?，從而增加番茄紅素的溶解度，而且脂肪酸組成與真菌相似的油脂在改變細(xì)胞內(nèi)脂肪酸組成和提高番茄紅素產(chǎn)量方面更具優(yōu)勢(shì)[29-31]。選定玉米粉添加量為20 g/L，黃豆粉添加量為25 g/L，植物油添加量為16 g/L，KH2PO4添加量為0.6 g/L，MgSO4添加量為0.9 g/L，VB1添加量為0.004 g/L，發(fā)酵液初始pH為6.5，裝液量為50 mL/250 mL，接種比例為正菌∶負(fù)菌為1∶5（體積比），接種量為10%，考察不同植物油種類對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知， 添加大豆油、葵花籽油、玉米油時(shí)，菌體生物量、番茄紅素產(chǎn)量和純度高于其他植物油，可能是因?yàn)檫@3種植物油中亞油酸、亞麻酸和油酸含量較高。當(dāng)添加玉米油時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量最高，所以選擇玉米油作為外源性植物油，考察其添加量對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，隨著玉米油添加量的逐漸增加，番茄紅素產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)玉米油添加量為12 g/L時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到最高，為361.50 mg/L，隨著玉米油添加量的繼續(xù)增加，番茄紅素的產(chǎn)量逐漸下降，這可能是過(guò)量的植物油改變了細(xì)胞膜的通透性，使部分色素溶出[32]。

2.1.6 發(fā)酵液初始pH對(duì)B. trispora番茄紅素產(chǎn)量的影響

pH值對(duì)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成的影響是不可忽視的。pH值的變化會(huì)影響菌體內(nèi)部酶活、細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及對(duì)培養(yǎng)基的利用速率[33]，從而影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成，故選定玉米粉添加量為20 g/L，黃豆粉添加量為25 g/L，玉米油添加量為12 g/L，KH2PO4添加量為0.6 g/L，MgSO4添加量為0.9 g/L，VB1添加量為0.004 g/L，裝液量為50 mL/250 mL，接種比例為正菌∶負(fù)菌為1∶5（體積比），接種量為10%，考察不同發(fā)酵液初始pH對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知，當(dāng)發(fā)酵液初始pH為5.0～6.0時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量偏低，pH為6.5時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量最高，為301.98 mg/L，而菌體生物量也在發(fā)酵液初始pH為6.5時(shí)達(dá)到最大值，可能是pH值的變化影響了菌體生長(zhǎng)，從而影響番茄紅素的產(chǎn)量和純度，所以要嚴(yán)格控制發(fā)酵液初始pH。

2.1.7 接種量對(duì)B. trispora番茄紅素產(chǎn)量的影響

接種量的大小決定了生產(chǎn)菌種在發(fā)酵過(guò)程中生長(zhǎng)繁殖的速度，較大的接種量可以縮短菌絲繁殖達(dá)到高峰的時(shí)間，提前合成產(chǎn)物，并可減少雜菌的生長(zhǎng)，故選定玉米粉添加量為20 g/L，黃豆粉添加量為25 g/L，玉米油添加量為12 g/L，KH2PO4添加量為0.6 g/L，MgSO4添加量為0.9 g/L，VB1添加量為0.004 g/L，裝液量為50 mL/250 mL，接種比例為正菌∶負(fù)菌為1∶5（體積比），發(fā)酵液初始pH為6.5，考察不同接種量對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7可知，隨著接種量的增加，番茄紅素產(chǎn)量呈先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)接種量為6%時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量最高，為492.85 mg/L。當(dāng)接種量超過(guò)6%時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量和純度持續(xù)下降，而生物量增加，說(shuō)明接種量過(guò)大使錐形瓶中菌絲生長(zhǎng)過(guò)快、數(shù)量過(guò)多，導(dǎo)致發(fā)酵液的黏度增大，影響發(fā)酵基質(zhì)的傳氧速率，從而造成溶氧不足，影響番茄紅素的合成[34]。

2.1.8 裝液量對(duì)B. trispora番茄紅素產(chǎn)量的影響

B. trispora是高度嗜氧菌，在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)溶氧的要求很高。故選定玉米粉添加量為20 g/L，黃豆粉添加量為25 g/L，玉米油添加量為12 g/L，KH2PO4添加量為0.6 g/L，MgSO4添加量為0.9 g/L，VB1添加量為0.004 g/L，接種量為6%，接種比例為正菌∶負(fù)菌為1∶5（體積比），發(fā)酵液初始pH為6.5，考察不同裝液量對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8。

由圖8可知，隨著裝液量逐漸增加，番茄紅素產(chǎn)量呈先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)裝液量為40 mL/250 mL時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量最高，達(dá)424.58 mg/L，裝液量繼續(xù)增加，番茄紅素產(chǎn)量和生物量呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明發(fā)酵培養(yǎng)基在一定轉(zhuǎn)速下，裝液量過(guò)多會(huì)造成發(fā)酵液溶氧不足，進(jìn)而影響菌體生長(zhǎng)和番茄紅素的合成。

2.1.9 接種比例對(duì)B. trispora番茄紅素產(chǎn)量的影響

類胡蘿卜素在三孢布拉氏霉菌正、負(fù)菌最適接種比例下才能大量積累，因此以何種比例將正、負(fù)菌接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中是關(guān)乎類胡蘿卜素產(chǎn)量的又一關(guān)鍵控制點(diǎn)[19]，故選定玉米粉添加量為20 g/L，黃豆粉添加量為25 g/L，玉米油添加量為12 g/L，KH2PO4添加量為0.6 g/L，MgSO4添加量為0.9 g/L，VB1添加量為0.004 g/L，接種量為6%，裝液量為40 mL/250 mL，發(fā)酵液初始pH為6.5，考察不同正、負(fù)菌接種比例對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖9。

由圖9可知，隨著負(fù)菌接種比例的增加，番茄紅素產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)正菌∶負(fù)菌為1∶15時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量最高，為397.75 mg/L，負(fù)菌比例繼續(xù)增加，番茄紅素產(chǎn)量下降。這是因?yàn)锽. trispora正菌主要誘導(dǎo)產(chǎn)生三孢酸刺激負(fù)菌色素的合成，負(fù)菌是類胡蘿卜素的主要生產(chǎn)者[33]。在發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素時(shí)，為了提高負(fù)菌比例使其在混合培養(yǎng)中成為優(yōu)勢(shì)菌株，負(fù)菌數(shù)量通常高于正菌。當(dāng)正、負(fù)菌接種比例大于1∶15時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量下降，這可能是負(fù)菌比例過(guò)大導(dǎo)致正菌數(shù)量逐漸減少[34]。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)番茄紅素產(chǎn)量選擇接種量（A）、裝液量（B）、接種比例（C）進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程：R1=567.15－99.86A－32.87B－13.52C－51.01AB－3.50AC－20.30BC－60.24A2－146.15B2－173.48C2。此模型可用來(lái)預(yù)測(cè)B. trispora發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的最大產(chǎn)量。

2.2.1 番茄紅素產(chǎn)量響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析

由表4可知，模型的F值為67.41且其P值小于0.000 1，表明此模型極顯著。失擬項(xiàng)的P值為0.321 2，表示失擬項(xiàng)相對(duì)于純誤差不顯著。決定系數(shù)R2為0.988 6，表明該模型與實(shí)驗(yàn)值擬合較好，有98.86%的變化可以由該模型解釋，調(diào)整后R2為0.973 9，說(shuō)明該模型不能解釋2.61%的響應(yīng)值變化。較低的C.V.（6.24%）表示該模型的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有高度可靠性。由表4可知，A、B、AB、A2、B2、C2對(duì)番茄紅素產(chǎn)量有極顯著影響（P<0.01）。

接種量、裝液量和接種比例的交互作用對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖10～圖12。

由圖10可知，A（接種量）與B（裝液量）之間有極顯著的交互作用，而接種量與接種比例、裝液量與接種比例之間的交互作用對(duì)番茄紅素的產(chǎn)量影響較小。

2.2.2 響應(yīng)面最優(yōu)條件的確定與驗(yàn)證

響應(yīng)面回歸方程模型預(yù)測(cè)最佳發(fā)酵條件為接種量4.31%、裝液量40.36 mL/250 mL、正、負(fù)菌接種比例1∶14.84，在此條件下番茄紅素的理論產(chǎn)量為608.885 mg/L。根據(jù)上述分析并結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作條件，將發(fā)酵條件改為接種量4.3%、裝液量40.4 mL/250 mL、正、負(fù)菌接種比例1∶14.8。在此發(fā)酵條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，番茄紅素的產(chǎn)量為626.25 mg/L，與理論值接近，結(jié)果較理想。

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析優(yōu)化，確定B.trispora生產(chǎn)番茄紅素的最佳條件為玉米粉20 g/L、黃豆粉25 g/L、磷酸二氫鉀0.6 g/L、硫酸鎂0.9 g/L、玉米油12 g/L、發(fā)酵液初始pH 6.5、接種量6%、裝液量40 mL/250 mL、正、負(fù)菌接種比例1∶15。接種量和裝液量之間有極顯著交互作用；接種量對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響最顯著，其次是裝液量，接種比例不顯著。最佳發(fā)酵條件為接種量4.31%、裝液量40.36 mL/250 mL、正、負(fù)菌接種比例1∶14.84，在此條件下，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到番茄紅素的產(chǎn)量為626.25 mg/L，比未優(yōu)化時(shí)番茄紅素產(chǎn)量提高了25.6%，說(shuō)明此回歸模型可靠，優(yōu)化效果良好，能為番茄紅素的工業(yè)化生產(chǎn)提供參數(shù)借鑒，從而更好地應(yīng)用于肉制品、飲料、保健食品等行業(yè)中。

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