雙酶分步酶解鹽津?yàn)豕请u肉工藝及其氨基酸組成分析

艾媛媛 劉菲菲 王曉華 王雪峰 肖智超 王桂瑛 范江平

摘要：以云南鹽津?yàn)豕请u肉為原料，蛋白水解度為指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化鹽津?yàn)豕请u肉酶解條件；用氨基酸分析儀及凝膠滲透色譜法檢測(cè)酶解液的氨基酸組成和多肽分子量分布。結(jié)果表明，雙酶分步酶解最佳工藝條件為動(dòng)物蛋白酶酶解時(shí)間5 h、酶添加量2.6%、酶解pH值6.5，滅酶后，再加入木瓜蛋白酶酶解3 h、酶添加量2.5%、酶解溫度60 ℃。在該條件下，鹽津?yàn)豕请u肉水解度為（32.62±0.79）%；酶解液中含有17種氨基酸，總游離氨基酸含量可達(dá)6.02 mg/mL，且亮氨酸、精氨酸等呈味氨基酸含量較高，其中多肽的相對(duì)分子質(zhì)量主要集中分布在1 kDa以下。該研究結(jié)果可為后續(xù)鹽津?yàn)豕请u相關(guān)新型調(diào)味制品的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鹽津?yàn)豕请u肉；分步酶解；響應(yīng)面優(yōu)化；游離氨基酸；分子質(zhì)量分布

中圖分類號(hào)：TS201.25????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號(hào)：1000-9973（2024）02-0028-08

Double-Enzyme Stepwise Enzymatic Hydrolysis Process of Yanjin Silky Fowl Chicken and Its Amino Acid Composition Analysis

Abstract： With Yunnan Yanjin silky fowl chicken as the raw material， protein hydrolysis degree as the index， the enzymatic hydrolysis conditions of Yanjin silky fowl chicken is optimized by response surface analysis method. The amino acid composition and molecular weight distribution of polypeptides of hydrolysates are detected by amino acid analyzer and gel permeation chromatography. The results show that the optimal process conditions for double-enzyme stepwise enzymatic hydrolysis are as follows： the enzymatic hydrolysis time of animal protease is 5 h， the addition amount of enzyme is 2.6%， the pH is 6.5， after enzyme inactivation， papain is added for? 3 h enzymatic hydrolysis， the enzyme addition amount is 2.5%， and the enzymatic hydrolysis temperature is 60 ℃. Under such conditions， the hydrolysis degree of Yanjin silky fowl chicken is （32.62±0.79）%， there are 17 amino acids in the enzymatic hydrolysate， the content of total free amino acids could reach 6.02 mg/mL， the content of flavor amino acids such as leucine and arginine is higher， and the relative molecular weight of polypeptides is mainly concentrated below 1 kDa. The research results could provide some theoretical basis for the development of new seasoning products of Yanjin silky fowl chicken in the future.

Key words： Yanjin silky fowl chicken; stepwise enzymatic hydrolysis; response surface optimization; free amino acids; molecular weight distribution

云南獨(dú)特的地理氣候環(huán)境孕育了許多種質(zhì)特異的地方特色雞資源，如無(wú)量山烏骨雞、茶花雞、大圍山微型雞、武定雞、瓢雞和鹽津?yàn)豕请u[1]。其中，鹽津?yàn)豕请u因產(chǎn)自云南省昭通市鹽津縣而得名，其肉質(zhì)鮮嫩美味[2]、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高[3]，還具有保健藥用功能[4]。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，雞肉提供的優(yōu)質(zhì)蛋白在食品加工產(chǎn)業(yè)中被廣泛應(yīng)用[5]。研究表明，雞肉經(jīng)酶水解后的主要產(chǎn)物是多肽和游離氨基酸，不僅可以促進(jìn)呈味物質(zhì)的釋放[6-7]，用于調(diào)味產(chǎn)品的開發(fā)，而且具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和利用價(jià)值[8]。

蛋白酶酶解主要是蛋白酶作用于蛋白質(zhì)的肽鍵，利用單一蛋白酶水解原料時(shí)，水解度低，風(fēng)味物質(zhì)釋放不充分[9]；復(fù)合酶水解能夠使不同的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)，從而提升酶解液的水解度，還能降低酶解液的苦味，增加特征香味[10]，因此多采用復(fù)合酶水解制備呈味基料[11]。Li等[12]利用雙酶酶解低值小龍蝦后，暴露出更多的酶切位點(diǎn)，酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量集中在0.5 kDa以下，主要以游離氨基酸和二肽形式存在。桂海佳等[13]利用木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分步酶解制備牛肉酶解液，最佳工藝條件下水解度達(dá)（41.48±0.34）%。目前有關(guān)鹽津?yàn)豕请u的研究主要集中在品質(zhì)特性[14]和風(fēng)味物質(zhì)上[15]，對(duì)鹽津?yàn)豕请u呈味肽的研究較少。本試驗(yàn)以云南鹽津?yàn)豕请u肉為原料，利用雙酶分步酶解雞肉并進(jìn)行工藝優(yōu)化，然后測(cè)定酶解液中游離氨基酸和多肽的分子質(zhì)量分布，以期為鹽津?yàn)豕请u的高值化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

云南鹽津?yàn)豕请u：購(gòu)自云南本城農(nóng)業(yè)科技有限公司，剔除雞身所有油脂、皮、筋、腱、膜。

1.2 試劑

動(dòng)物蛋白水解酶（5×104 U/g，食品級(jí)）：廣東康達(dá)生物科技有限公司；風(fēng)味蛋白酶（5×104 U/g，食品級(jí)）：河南萬(wàn)邦化工科技有限公司；中性蛋白酶（5×104 U/g，食品級(jí)）、木瓜蛋白酶（1×105 U/g，食品級(jí)）：南寧龐博生物工程有限公司；復(fù)合蛋白酶（1×105 U/g，食品級(jí)）：河南省萬(wàn)盛實(shí)業(yè)有限公司；甘氨酸：Biosharp生物科技公司；磷酸二氫鉀：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；D-果糖：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；磷酸氫二鈉、茚三酮：廣東光華科技股份有限公司。

1.3 主要儀器

PH828型pH計(jì) 東莞市?，攦x表有限公司；XMTD-7000型電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；SPH120型消解儀 濟(jì)南阿爾瓦儀器有限公司；Multiskan GO多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；A300氨基酸分析儀 德國(guó)曼默博爾公司；PL-GPC220凝膠滲透色譜儀 美國(guó)Agilent公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 雞肉酶解液的分步酶解工藝流程

原料預(yù)處理→加水混合→調(diào)節(jié)pH值→加第一種酶→水浴酶解→沸水浴滅酶10 min→調(diào)節(jié)pH值→加第二種酶→水浴酶解→沸水浴滅酶10 min→離心→取上清液→測(cè)水解度。

1.4.2 水解度的測(cè)定

參考肖雪等[16]的方法，采用茚三酮顯色法測(cè)定雞肉酶解液的游離氨基酸態(tài)氮含量。得到線性回歸方程A=0.021 9C-0.000 6，R2=0.999 7。參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[17]對(duì)雞肉中氮含量進(jìn)行測(cè)定。按照下式計(jì)算水解度：

式中：c為甘氨酸濃度，μg/mL；n為稀釋倍數(shù)；V為濾液體積，mL；N為氮含量，g/100 g；m為樣品質(zhì)量，g。

1.4.3 蛋白酶的篩選

以水解度為指標(biāo)，固定料液比為1∶4、酶添加量為1.5%、酶解時(shí)間為4 h，在5種蛋白酶的最適pH值和最適溫度下對(duì)雞肉進(jìn)行酶解，蛋白酶的種類及酶解條件見表1。對(duì)不同蛋白酶的酶解效果進(jìn)行比較，選擇水解度最高的兩種蛋白酶進(jìn)行雙酶分步酶解試驗(yàn)。

1.4.4 單因素試驗(yàn)

按照1.4.3中的方法設(shè)定參考條件為料液比1∶4、動(dòng)物蛋白酶添加量1.5%、酶解時(shí)間4 h、酶解溫度55 ℃、酶解pH 7.0；木瓜蛋白酶添加量1.5%、酶解時(shí)間4 h、酶解溫度55 ℃、酶解pH 6.0。分別考察加酶量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、酶解溫度（45，50，55，60，65 ℃）、酶解時(shí)間（2，3，4，5，6 h）、酶解pH值（4.0，5.0，6.0，7.0，8.0）對(duì)酶解雞肉水解度的影響，確定各酶解條件的最適范圍。

1.4.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在動(dòng)物蛋白酶、木瓜蛋白酶單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，動(dòng)物蛋白酶選取3個(gè)因素：酶添加量（A）、酶解時(shí)間（B）、pH值（C）；木瓜蛋白酶選取3個(gè)因素：酶添加量（A′）、酶解時(shí)間（B′）、酶解溫度（C′）；以水解度作為響應(yīng)值，分別進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平見表2和表3。

1.4.6 雞肉酶解液的游離氨基酸組成分析

取4 mL酶解液，加入1 mL 10%磺基水楊酸沉淀多肽及蛋白，置于2～8 ℃冰箱中冷藏靜置60 min。用離心機(jī)以4 500 r/min離心15 min，用濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣20 μL上機(jī)分析[18]，參照GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》中的方法進(jìn)行氨基酸測(cè)定[19]。

1.4.7 雞肉酶解液的多肽分子量分布

雞肉酶解液凍干后得到雞肉多肽。采用凝膠滲透色譜法檢測(cè)多肽相對(duì)分子質(zhì)量分布。色譜柱：2×PLgel 8 μm aquagel-OH Mixed-M 7.5 mm×300 mm，流動(dòng)相：水，示差折光檢測(cè)器。標(biāo)準(zhǔn)品：PEG。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，采用GraphPad Prism 8對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖；采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)；采用IBM SPSS Statistics 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（P<0.05表示差異顯著）；試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 蛋白酶的篩選

由圖1可知，在5種蛋白酶中，動(dòng)物蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解效果最好，水解度分別為23.05%和9.78%。所以本試驗(yàn)選擇動(dòng)物蛋白酶、木瓜蛋白酶作為雞肉酶解最佳用酶，且按照先動(dòng)物蛋白酶后木瓜蛋白酶的順序酶解。

2.1.2 酶添加量對(duì)水解度的影響

由圖2可知，動(dòng)物蛋白酶和木瓜蛋白酶水解液的水解度整體呈先升高后降低的趨勢(shì)；當(dāng)酶添加量為2.5%時(shí)，動(dòng)物蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度分別為27.81%和27.70%，均達(dá)到最高值。造成這一現(xiàn)象的主要原因是：在反應(yīng)前期，隨著酶添加量的不斷增加，酶與底物的結(jié)合率提高，此時(shí)水解速率與酶濃度的增加成正比；而當(dāng)酶添加量高于2.5%時(shí)，底物逐漸被消耗而酶濃度過(guò)量，此時(shí)酶解反應(yīng)達(dá)到飽和狀態(tài)[20]，所以進(jìn)一步提高酶用量不能直接提高水解度。因此，動(dòng)物蛋白酶和木瓜蛋白酶添加量均為2.5%。

2.1.3 酶解pH值對(duì)水解度的影響

由圖3可知，隨著pH值的升高，動(dòng)物蛋白酶水解液的水解度呈先升高后急劇降低的趨勢(shì)。動(dòng)物蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度在pH值為7.0時(shí)達(dá)到最大值，木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度在pH值為6.0時(shí)達(dá)到最大值。pH值的變化會(huì)對(duì)酶活性中心上必需基團(tuán)的解離產(chǎn)生影響。pH值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響酶的活性和穩(wěn)定性。因此，蛋白酶隨著pH值的變化有不同的反應(yīng)狀態(tài)，從而影響酶和底物之間的結(jié)合與催化。只有在最佳pH值下，才能使酶的活性達(dá)到最高[21]。因此，動(dòng)物蛋白酶酶解鹽津?yàn)豕请u肉的最佳pH值為7.0，木瓜蛋白酶的最佳pH值為6.0。

2.1.4 酶解溫度對(duì)水解度的影響

由圖4可知，隨著溫度的逐漸升高，動(dòng)物蛋白酶在55 ℃時(shí)水解度達(dá)到最大，當(dāng)溫度大于55 ℃后水解度急劇下降后趨于平緩；木瓜蛋白酶在60 ℃時(shí)水解度達(dá)到最大。這是由于酶在酶解時(shí)存在一個(gè)最適溫度，適當(dāng)?shù)厣郎赜欣诿附馑俣鹊募涌欤^(guò)高的溫度則會(huì)導(dǎo)致酶失活，從而降低產(chǎn)物的水解度[22]。因此，動(dòng)物蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解鹽津?yàn)豕请u肉的最佳酶解溫度分別為55 ℃和60 ℃。

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

由圖5可知，隨著酶解時(shí)間的增加，動(dòng)物蛋白酶的水解度呈現(xiàn)先升高后降低又升高再降低的趨勢(shì)，在酶解時(shí)間為5 h時(shí)水解度達(dá)到最大值。木瓜蛋白酶的水解度呈現(xiàn)先升高后降低再趨于平緩的趨勢(shì)，在酶解3 h時(shí)水解度達(dá)到最大。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，底物與酶的結(jié)合更加充分，水解度總體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到一定程度時(shí)，底物被消耗，酶解產(chǎn)物增多，酶分子的有效含量降低，導(dǎo)致水解度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[23]。由此可得，動(dòng)物蛋白酶和木瓜蛋白酶的最佳酶解時(shí)間分別為5 h和3 h。

2.2 雞肉酶解條件響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果及方差分析

分別選擇對(duì)水解度影響較大的3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，動(dòng)物蛋白酶和木瓜蛋白酶試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分別見表4和表5。采用多元回歸擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到水解度對(duì)自變量編碼值的回歸方程：Y1=29.69+1.62A+0.81B－1.36C+1.11AB+1.03AC－0.95BC－3.76A2－4.16B2－1.34C2。Y2=26.87－0.35A′－0.22B′－0.18C′－0.73A′B′－0.60A′C′－0.75B′C′－1.17A′2－1.16B′2－1.31C′2。

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6和表7。

由表6和表7可知，兩個(gè)模型的P值均小于0.000 1，失擬系數(shù)反映了模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間的擬合程度。失擬項(xiàng)的P值分別為0.053 7（>0.05）和0.207 6（>0.05），說(shuō)明該模型具有較好的擬合能力，此模型可用。相關(guān)系數(shù)R2分別為0.984 2和0.976 9，模型的校正RAdj2與預(yù)測(cè)R2相差較?。≧2=0.984 2，RAdj2=0.963 9；R2=0.976 9，RAdj2=0.947 3），表明該模型可用來(lái)預(yù)測(cè)雞肉的水解程度和優(yōu)化酶解工藝。

對(duì)模型一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交互項(xiàng)的P值進(jìn)行分析，其中一次項(xiàng)A、C和二次項(xiàng)A2、B2 、C2對(duì)響應(yīng)值Y1（動(dòng)物蛋白酶水解度）的影響極顯著（P<0.01），交互項(xiàng)A′B′、A′C′、B′C′和二次項(xiàng)A′2、B′2、C′2對(duì)響應(yīng)值Y2（木瓜蛋白酶水解度）的影響極顯著（P<0.01）。因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度可以通過(guò)F值大小來(lái)判斷，因此可得影響次序?yàn)槊柑砑恿?pH值>酶解時(shí)間（動(dòng)物蛋白酶）；酶添加量>酶解時(shí)間>酶解溫度（木瓜蛋白酶）。

2.2.2 交互作用分析及驗(yàn)證試驗(yàn)

3D曲面圖坡度越陡、等高線呈橢圓形且越密集，表明該交互項(xiàng)對(duì)雞肉酶解工藝的影響越大[24]。由圖6和圖7可知，其水解度隨因素水平的增加呈先上升后降低的趨勢(shì)，與單因素試驗(yàn)結(jié)果相符；且等高線圖整體呈橢圓形，表明存在顯著的交互作用，該結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。通過(guò)該模型得到最佳工藝條件：第一步為動(dòng)物蛋白酶酶解5 h、酶添加量2.6%、pH 6.5，第二步為木瓜蛋白酶酶解3 h、酶添加量2.5%、酶解溫度60 ℃，水解度為30.16%。在此條件下通過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)，所得水解度平均值為（32.62±0.79）%，與預(yù)測(cè)值較接近，表明該工藝具有可行性。

2.2.3 雙酶分步酶解順序

在雙酶分步酶解工藝中，采用不同的酶處理順序?qū)λ饨Y(jié)果有一定的影響。根據(jù)動(dòng)物蛋白酶和木瓜蛋白酶的試驗(yàn)結(jié)果，在其最優(yōu)反應(yīng)條件下，按照反應(yīng)的先后次序?qū)﹄u肉進(jìn)行分步酶解試驗(yàn)。由表8可知，先使用動(dòng)物蛋白酶酶解，滅酶后再加入木瓜蛋白酶酶解水解度較高，選取此酶解順序進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 酶解液游離氨基酸分析

氨基酸作為蛋白質(zhì)的主要組成成分和重要風(fēng)味前體物質(zhì)，其在食品中的種類和含量被作為一個(gè)重要指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)產(chǎn)品品質(zhì)和感官特性[25]，按照呈味特征可以分為鮮味、甜味、苦味及無(wú)味氨基酸。對(duì)雞肉酶解液中游離氨基酸進(jìn)行分析，結(jié)果見表9。

雞肉酶解液中游離氨基酸總量為6.02 mg/mL，呈味氨基酸總含量為5.75 mg/mL，占游離氨基酸總量的95.51%。其中鮮味氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，含量分別占游離氨基酸總量的1.83%、4.98%，是雞肉酶解液鮮味呈現(xiàn)的重要物質(zhì)。甜味氨基酸占游離氨基酸總量的18.60%，甜味氨基酸本身具有的鮮味對(duì)酸味和苦味有一定的消減作用，并能與其他風(fēng)味物質(zhì)協(xié)同增鮮?？辔栋被嵴加坞x氨基酸總量的69.93%，此結(jié)果與Zheng等[26]、于亞輝等[27]的研究結(jié)果相似，在雞肉酶解液中苦味氨基酸是主要的呈味氨基酸。在鹽津?yàn)豕请u肉酶解液中共檢測(cè)出7種人體必需氨基酸，其總含量為2.99 mg/mL，占游離氨基酸總量的49.67%，表明雞肉酶解液具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

2.4 雞肉酶解液中多肽分子量分布

最佳酶解工藝條件下雞肉酶解液中多肽分子量的分布情況見圖8。

由圖8可知，5～10 kDa的肽含量?jī)H為1.95%，而小于3 kDa的肽占91.33%，平均相對(duì)分子量為1 128 Da，酶解液的營(yíng)養(yǎng)、呈味特性與其所含的小分子肽具有密切關(guān)系。此研究結(jié)果與侯鈺柯等[28]利用肉雜雞雞骨架酶解后分子量分布具有相同趨勢(shì)，小于1 kDa的分子量占比最高，酶解過(guò)程為后續(xù)美拉德反應(yīng)奠定了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。Liang等[29]研究發(fā)現(xiàn)雞湯中小于1 kDa的組分的鮮味較高，且小分子量組分的總體味道更加協(xié)調(diào)。吳明澤等[30]研究發(fā)現(xiàn)中華圓田螺肉中分子量小于1 kDa的肽抗氧化活性最強(qiáng)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)得到分步酶解鹽津?yàn)豕请u肉最優(yōu)工藝：先使用動(dòng)物蛋白酶水解（酶解時(shí)間5 h、酶添加量2.6%、pH值6.5），滅酶后，再加入木瓜蛋白酶水解（酶解時(shí)間3 h、酶添加量2.5%、酶解溫度60 ℃）。此條件下水解度可達(dá)（32.62±0.79）%，所得酶解液中的游離氨基酸種類豐富，總量達(dá)到6.02 mg/mL，其中人體必需氨基酸含量占游離氨基酸總量的49.67%。此外，酶解產(chǎn)物中小于3 kDa的肽含量高于90%。酶解液中產(chǎn)生的游離氨基酸、多肽等呈味物質(zhì)為鹽津?yàn)豕请u肉調(diào)味產(chǎn)品的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

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