轉(zhuǎn)基因棉花耐除草劑鑒定及遺傳穩(wěn)定性分析

馬克鶴，鄭 凱，陳全家

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830000）

傳統(tǒng)的作物生產(chǎn)中，使用除草劑進(jìn)行田間雜草處理已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)不可缺少的一部分，除草劑雖能防除雜草，但也會(huì)對(duì)作物生長產(chǎn)生影響[1]。隨著轉(zhuǎn)基因抗蟲棉培育成功，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗病、抗除草劑、品質(zhì)優(yōu)異的相關(guān)基因?qū)氲矫藁ㄖ械难芯吭絹碓蕉郲2-3]，并大規(guī)模投入生產(chǎn)。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前應(yīng)用最廣泛的遺傳轉(zhuǎn)化方法，能夠?qū)⑼暾幕蚱螌?dǎo)入到受體中，且在后代中穩(wěn)定遺傳[4]。本試驗(yàn)前期通過將抗性標(biāo)記基因、目的基因與表達(dá)載體重組構(gòu)建，將重組載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后，將菌液通過授粉的方式把外源基因?qū)胫潦荏w中，已有研究人員通過該方法經(jīng)除草劑篩選以及PCR 分子鑒定獲得了轉(zhuǎn)基因植株[5-6]，但所用的除草劑為草甘膦，而草銨膦除草劑見效快，在除草速度、除草范圍、除草效果及雜草再生期等田間表現(xiàn)方面均優(yōu)于草甘膦。Bar基因可使植物抵抗以PPT 為活性的草銨膦除草劑，此類除草劑能夠使植株葉綠體解體，導(dǎo)致葉片干枯，最終死亡。HCT 是一種木質(zhì)素合成酶，在木質(zhì)素單體的合成中起著上下游調(diào)節(jié)作用。調(diào)控HCT基因的表達(dá)量進(jìn)而調(diào)節(jié)植物中木質(zhì)素含量，由此可以證實(shí)HCT 可促進(jìn)纖維發(fā)育。本試驗(yàn)將目的基因與抗除草劑基因一同導(dǎo)入到棉花受體的轉(zhuǎn)基因后代通過草銨膦除草劑篩選及PCR 鑒定，能夠快速篩選出目的基因成功整合的單株，研究轉(zhuǎn)基因材料的遺傳穩(wěn)定性，分析GbHCT基因的導(dǎo)入對(duì)棉花的農(nóng)藝性狀產(chǎn)生的表型影響，初步探討GbHCT基因在棉花發(fā)育中的作用，為后續(xù)該轉(zhuǎn)基因材料的環(huán)境安全釋放、篩選更為優(yōu)異的品種提供了可靠的分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)基因材料是前期采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)噴花法將目的基因GbHCT13、GbHCT15導(dǎo)入到陸地棉Y1169，轉(zhuǎn)GbHCT13、GbHCT15基因棉花表達(dá)載體均由本課題組實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，本試驗(yàn)所用的受體品種為Y1169，其目的基因GbHCT來自海島棉新海21。本研究所用引物（見表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；PCR 反應(yīng)試劑Taq DNA 聚合酶為MBI Fermentas公司產(chǎn)品；DNA Marker、dNTP Mix 為天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

本試驗(yàn)前期利用BglⅡ與BstE Ⅱ?qū)CAMBIA3301載體雙酶切，然后將帶有pCAMBIA3301-GbHCT13/GbHCT15重組載體的農(nóng)桿菌菌液通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)噴花法轉(zhuǎn)化到棉花中，其中載體所含標(biāo)記基因bar基因（草銨膦除草劑抗性基因）長為475 bp，GbHCT13基因長為1 311 bp，GbHCT15基因長為1 248 bp。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間

大田試驗(yàn)于2021 年在新疆維吾爾自治區(qū)塔城地區(qū)沙灣市新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花育種基地進(jìn)行；室內(nèi)試驗(yàn)于2022 年在新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 除草劑篩選

大田試驗(yàn)將草銨膦原液Basta 600、700、800μL，與表面活性黏附劑吐溫20 1 600μL 和純凈水1 L 配制成3 個(gè)體積分?jǐn)?shù)，分別對(duì)大田轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)行噴灑，3～9 d 后觀察變色葉片及死亡植株，標(biāo)記未變色植株，依據(jù)變色程度將葉片反應(yīng)分為3 種類型（見圖1），收集大田中轉(zhuǎn)基因抗性植株并經(jīng)PCR 鑒定為陽性的植株種子，記錄編號(hào)，確定單株株系，在室內(nèi)按株系種植。室內(nèi)試驗(yàn)同樣按照大田適用體積分?jǐn)?shù)將除草劑涂抹于幼苗植株的葉片上，連續(xù)3 d 相同葉片，3 d后統(tǒng)計(jì)棉花葉片枯萎情況（見圖2），拔除葉片干枯的植株。

圖1 不同體積分?jǐn)?shù)草銨膦除草劑噴灑3 d 后棉花葉片的反應(yīng)

圖2 室內(nèi)涂抹體積分?jǐn)?shù)為800μL/L 的草銨膦除草劑

1.3.2 PCR鑒定

1)取新鮮的棉花嫩葉，參照改良的DNA 提取技術(shù)提取轉(zhuǎn)基因棉花的基因組，所提取的DNA 取1μL 放置核酸濃度檢測儀上進(jìn)行檢測。

2)取適量DNA 樣品稀釋，稀釋至200 ng/μL，PCR反應(yīng)體系25μL，取上下游引物各1μL、ddH2O 10μL、DNA 樣品1μL、Mix 混合液（含Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、10×Reaction buffer）12.5μL。

3)按照PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，經(jīng)過35 個(gè)循環(huán)后72 ℃終延伸10 min，將所獲得的PCR 產(chǎn)物于4 ℃保存；隨后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，照膠顯影，觀察目的條帶。

1.3.3 轉(zhuǎn)基因棉花農(nóng)藝性狀分析

對(duì)PCR 檢測為陽性的T2代轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查，在棉花吐絮時(shí)期，每個(gè)轉(zhuǎn)基因品系隨機(jī)測取5 株的株高、果枝數(shù)、有效果枝數(shù)、鈴數(shù)和有效鈴數(shù)等農(nóng)藝性狀，用SPSS 軟件對(duì)所測得的農(nóng)藝性狀進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 除草劑篩選轉(zhuǎn)基因品系棉花

通過圖1 可以看出，由于除草劑產(chǎn)生藥害需3 d左右，當(dāng)除草劑體積分?jǐn)?shù)為600μL/L 時(shí)，3 d 后未轉(zhuǎn)基因棉花葉片無明顯變化，6 d 后植株葉片出現(xiàn)淺黃色斑點(diǎn)，9 d 后葉片干枯；當(dāng)除草劑體積分?jǐn)?shù)為700μL/L時(shí)，未轉(zhuǎn)基因棉花葉片3 d 后有淺黃色斑點(diǎn)，6 d 后葉片干枯；當(dāng)除草劑體積分?jǐn)?shù)為800μL/L 時(shí)，3 d 后未轉(zhuǎn)基因棉花葉片明顯黃化，且莖尖生長點(diǎn)干枯，第6 天時(shí)整株棉花死亡。轉(zhuǎn)基因植株葉片經(jīng)3 個(gè)體積分?jǐn)?shù)除草劑噴灑后葉片均無變化。為能夠高效快速進(jìn)行篩選，選擇體積分?jǐn)?shù)為800 μL/L 的除草劑作為篩選體積分?jǐn)?shù)，噴灑后第3 天進(jìn)行觀察。

由圖2 可以明顯看出，在幼苗期對(duì)每株植株的同一葉片涂抹大田適用的草銨膦除草劑，編號(hào)為1 的植株涂抹除草劑后葉片未有任何反應(yīng)，初步鑒定為陽性，而編號(hào)為2、3、4 的植株涂抹除草劑后出現(xiàn)了變化，未轉(zhuǎn)基因植株葉片不僅明顯黃化且生長受到抑制。

2.2 轉(zhuǎn)基因棉花農(nóng)藝性狀分析

對(duì)農(nóng)藝性狀進(jìn)行分析（見表2），得出轉(zhuǎn)GbHCT13品系的株高與對(duì)照Y1169 相比顯著增加，而轉(zhuǎn)GbHCT15品系的株高與對(duì)照Y1169 相比略有增加；轉(zhuǎn)GbHCT15品系的果枝數(shù)與對(duì)照Y1169 相比顯著增加，在有效果枝數(shù)方面，轉(zhuǎn)GbHCT15品系相比對(duì)照Y1169也顯著增加，而轉(zhuǎn)GbHCT13品系在果枝數(shù)與有效果枝數(shù)方面比對(duì)照組略有升高；鈴數(shù)方面，轉(zhuǎn)GbHCT15品系的掛鈴數(shù)更多，與對(duì)照差異達(dá)到極顯著水平；轉(zhuǎn)GbHCT13品系和轉(zhuǎn)GbHCT15品系的有效鈴數(shù)與對(duì)照相比顯著增加。由以上結(jié)果得出，目的基因?qū)氲绞荏w后，其各性狀都發(fā)生了顯著變化，各項(xiàng)農(nóng)藝性狀均有提高。綜上，轉(zhuǎn)GbHCT15品系和其他轉(zhuǎn)基因材料在與對(duì)照相比時(shí)，在果枝數(shù)、有效果枝數(shù)、鈴數(shù)和有效鈴數(shù)方面差異顯著。

表2 轉(zhuǎn)基因品系農(nóng)藝性狀與對(duì)照之間的比較

3 討論與結(jié)論

在2 片真葉期噴灑大田體積分?jǐn)?shù)適宜的除草劑，非抗性材料真葉受傷無法進(jìn)行光合作用，生長點(diǎn)受到抑制最終芽尖枯死，而轉(zhuǎn)基因抗除草劑材料葉雖會(huì)表現(xiàn)出水浸狀，但子葉與生長點(diǎn)未受影響。在幼苗期利用適宜體積分?jǐn)?shù)的除草劑既可去除田間雜草，也不影響棉花正常生長，還能在田間大規(guī)模篩選出轉(zhuǎn)基因抗性植株。此篩選方法雖然簡單，但容易出現(xiàn)假陽性及誤篩，可作為轉(zhuǎn)基因植株的初步篩選，獲得更為準(zhǔn)確的結(jié)果還需進(jìn)行分子水平的鑒定。

根據(jù)草銨膦除草劑抗性基因bar同時(shí)也可作為標(biāo)記基因?qū)纱D(zhuǎn)基因抗性植株進(jìn)行PCR 鑒定，試驗(yàn)結(jié)果表明，T3代轉(zhuǎn)基因抗性植株有部分存在目的基因的缺失，研究表明，推測在子代遺傳的減數(shù)分裂過程中，外源Bar基因與目的基因插入早期沒有在染色體中穩(wěn)定，從而呈現(xiàn)不規(guī)律分離，但隨著代數(shù)的增加，轉(zhuǎn)化的目的基因大多能夠穩(wěn)定遺傳給子代。因此，如何穩(wěn)定地將外源基因遺傳給下一代，仍是當(dāng)前轉(zhuǎn)基因技術(shù)的難題之一。本次試驗(yàn)中，T2代陽性植株的農(nóng)藝性狀表明，外源基因的插入使農(nóng)藝性狀發(fā)生了明顯改變，其中轉(zhuǎn)GbHCT15品系的棉花在果枝數(shù)、鈴數(shù)等方面與對(duì)照相比顯著增加，以往研究中，HCT基因在莖稈的纖維發(fā)育中具有重要作用，能夠促進(jìn)纖維細(xì)胞的生長與分化。因此本試驗(yàn)推測HCT基因的導(dǎo)入促使棉花植株生長發(fā)育，使轉(zhuǎn)基因品系株高均高于對(duì)照組，同時(shí)2 個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的結(jié)鈴數(shù)均明顯高于對(duì)照組，HCT基因的導(dǎo)入具有提高棉花產(chǎn)量的潛力。