一株耐鹽高效脫氮微生物的篩選和鑒定

伏春燕 閻佩佩 張亨 商延 高慶濤 李霞 劉雪蘭

摘 要：隨著養(yǎng)殖污水排放量的增加，降低養(yǎng)殖污水中氮素水平，防止水體富營(yíng)養(yǎng)化，已經(jīng)成為當(dāng)今水環(huán)境污染防治的熱點(diǎn)問題。為了篩選出具有耐鹽高效脫氮作用的微生物，通過選擇性培養(yǎng)基結(jié)合極限稀釋法以及平板劃線法，從6個(gè)不同樣本中篩選到了7株耐鹽脫氮微生物，通過對(duì)這些微生物脫氮效率的復(fù)篩，得到一株脫氮效果最好的菌株（A1），通過表觀分類鑒定、生理生化鑒定及測(cè)序分析相結(jié)合獲得可靠的鑒定結(jié)果。經(jīng)鑒定，菌株A1與鹽單胞菌屬（Halomonas）相似度最高，在30 g/L鹽濃度條件下氨氮去除率達(dá)到38.33%。通過對(duì)菌株進(jìn)行相關(guān)性質(zhì)及影響因素的研究，確定了菌種脫氮的最適溫度為25 ℃，最適pH為5。

關(guān)鍵詞：氨氮；脫氮微生物；耐鹽；鹽單胞菌屬

近年來，隨著城市化進(jìn)程的迅速發(fā)展，以及工業(yè)、農(nóng)業(yè)等活動(dòng)的加快，水體中的氮素污染現(xiàn)象日益嚴(yán)重，危及到人類及牲畜的飲水問題，其中養(yǎng)殖污水又是氮素污染的主要原因之一[1]。畜禽養(yǎng)殖污水中的大量含氮（尤其氨氮）、磷、有機(jī)物等污染物，尤其是污水中氮素的去除，若不經(jīng)過合理處理，其進(jìn)入水體將引起水體富營(yíng)養(yǎng)化，必將對(duì)水體生態(tài)環(huán)境造成極大破壞[2-5]。因此，水中氮素的去除已成為當(dāng)今水環(huán)境污染防治的熱點(diǎn)問題。養(yǎng)殖污水成分復(fù)雜，存在許多有機(jī)鹽、無機(jī)鹽、抗生素、尿素、大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等，此種復(fù)雜條件對(duì)生物脫氮提出了更高的要求[6-11]。因此，針對(duì)養(yǎng)殖污水中高鹽的特點(diǎn)，對(duì)6個(gè)樣品進(jìn)行耐鹽脫氮菌的篩選，旨在篩選出在高鹽條件下仍具有較高脫氮能力的微生物，為脫氮微生物的菌落篩選及生存條件研究等方面提供理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 樣品來源? A樣品來自東營(yíng)鹽堿農(nóng)田土壤，已經(jīng)過預(yù)處理，菌樣足夠；B樣品來自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院長(zhǎng)期運(yùn)行的人工濕地基質(zhì)；C樣品來自濟(jì)南污水處理廠的活性污泥；D樣品取自水田（水稻田）土壤；E樣品為旱地（棉花地）土壤；F樣品為河流底泥。

1.1.2? 培養(yǎng)基? （1）富集培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 30 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min。

（2）分離培養(yǎng)基：葡萄糖 5 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，K2HPO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，NaCl 30 g/L，CaCl2·H2O 0.03 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g/L，pH 7.2～7.4。加入20%的瓊脂制成固體培養(yǎng)基，用于菌種的分離純化。其中以（NH4）2SO4作為氮的來源[12]。

（3）種子培養(yǎng)基（液）：LB培養(yǎng)基：LB粉25 g/L、NaCl 30 g/L、pH 7.2 斜面培養(yǎng)基加2%瓊脂[13]。

（4）好氧反硝化培養(yǎng)基（DM）：葡萄糖5 g，KNO3 0.5 g，NaNO2 0.5 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.2 g，微量鹽溶液2 mL，蒸餾水1 L，pH 7.2，固體培養(yǎng)基加2%的瓊脂[14-15]。

（5）微量鹽溶液：乙二胺四乙酸50 g，ZnSO4 2.2 g，CaCl2 5.5 g，CuSO4·5H2O 1.57 g，MnCl2·4H2O 5.56 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 g，CoCl2·6H2O 1.61 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2[16]。

（6）脫NH4+-N發(fā)酵培養(yǎng)基（液）：葡萄糖 5 g/L，（NH4）2SO4 0.7g/L，NaCl 30 g/L，F(xiàn)eSO4·7SO4

0.05 g/L，K2HPO4 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，pH 7.2～7.4[17-18]。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 細(xì)菌的篩選分離? （1）耐鹽脫氮微生物的篩選：取樣品各2 g，分別接入無菌水中，于30 ℃ 180 rpm條件下振蕩培養(yǎng)3 h，靜置，取細(xì)菌懸液5 mL轉(zhuǎn)入100 mL富集培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)48 h，得到富集菌液；制備一系列該培養(yǎng)液的稀釋液（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6），取100 ?L涂布在倒置的分離培養(yǎng)基中，于30 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h，每天觀察記錄菌體長(zhǎng)勢(shì)。挑取菌落形態(tài)各異的菌株，進(jìn)行劃線分離；經(jīng)多次劃線分離后，得到純菌株。

（2）好氧反硝化篩選：將純化出的菌株通過劃線方式接入好氧反硝化培養(yǎng)基，篩選出具有好氧反硝化能力的菌株[19]。

（3）高效耐鹽脫氮微生物篩選：將純化后的各菌株分別接入富集培養(yǎng)基活化1 d，再取5 mL接入100 mL分離培養(yǎng)基中，于30 ℃ 180 rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h，分別于24 、48 h取樣通過納氏比色法測(cè)定培養(yǎng)基中 NH4+-N的濃度，計(jì)算總脫氮率和氨氮降解率。每個(gè)菌種設(shè)三組。根據(jù)總脫氮率和氨氮降解率，挑選脫氮效果好且生長(zhǎng)速度快的菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2.2? 菌株保藏? 選擇轉(zhuǎn)化率最高的菌株，作為目的菌株，接種于LB斜面培養(yǎng)基上，4 ℃冰箱保藏。

1.2.3? 耐鹽高效脫氮微生物適宜培養(yǎng)條件研究? ? （1）溫度對(duì)菌株的影響：取保存的菌種以5%（V/V）的接種量接種至NH4+-N發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別置于20 、25 、30 、35 ℃ 和40 ℃，150 rpm搖床震蕩培養(yǎng)1 d，檢測(cè)樣品氨氮含量和菌液光密度[20]。

（2）pH對(duì)菌株的影響：分別配制pH值為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的脫NH4+-N發(fā)酵培養(yǎng)基，取保存的菌種按5%（V/V）的接種量接種于上述培養(yǎng)基中，30 ℃、150 rpm搖床震蕩培養(yǎng)，1 d后檢測(cè)樣品氨氮含量和菌液光密度[21]。

（3）鹽度對(duì)菌株的影響：取保存的菌種，按5%（V/V）的接種量分別接種至鹽度值為5、10、20和30的脫NH4+-N發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、150 rpm搖床震蕩培養(yǎng)，1 d后檢測(cè)樣品氨氮含量和菌液光密度[22]。

1.2.4? 耐鹽高效脫氮微生物鑒定? 包括菌株形態(tài)觀察、革蘭氏染色、16S rRNA測(cè)序和分析、生理生化鑒定等。16S rRNA委托山東力戈科技公司進(jìn)行，序列同源性分析在NCBI采用blast軟件檢索，參考序列取自Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)。生理生化鑒定包括甘油試驗(yàn)、葡萄糖糖發(fā)酵試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、MR-VP試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)[16]。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 耐鹽脫氮微生物的篩選結(jié)果及其菌落特征分析

對(duì)6個(gè)樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)、梯度稀釋（10-1～10-6）后涂布在倒置的分離培養(yǎng)基平板上，并反復(fù)分離純化，得到單菌株，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，見圖1。

2.2? 反硝化的篩選結(jié)果

接入反硝化培養(yǎng)基的七種菌均無菌落長(zhǎng)出，證明七種菌均無好氧反硝化作用。

2.3? 耐鹽高效脫氮微生物篩選結(jié)果

通過納氏比色法測(cè)定接有各菌種的培養(yǎng)基中不同時(shí)間的吸光度值如表2，計(jì)算各菌種48 h脫氮率如表3。菌株A1具有較高的脫氮效率，其氨氮降解率達(dá)到38.33%，明顯高出其他菌種，可作為目標(biāo)菌種，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.4? 適宜培養(yǎng)條件研究結(jié)果

2.4.1? 溫度條件? 通過測(cè)定，A1在25 ℃條件下脫氮能力最強(qiáng)（圖2），氨氮降解率為33.2%，在30 ℃時(shí)菌體細(xì)胞密度最大（圖3）。

2.4.2? pH條件? 通過測(cè)定，A1在pH為5條件下脫氮能力最強(qiáng)（圖4），氨氮降解率為39.7%；在pH為8時(shí)OD600最高，與其他幾個(gè)梯度顏色差異較為明顯，考慮到培養(yǎng)基顏色對(duì)吸光度值的影響，此處認(rèn)為pH為6～7時(shí)菌體細(xì)胞密度最大（圖5）。

2.4.3? 鹽度條件? 隨著鹽度的升高，菌體脫氮能力逐漸降低，在鹽度為5、10、20、30時(shí)，氨氮去除率分別為50.44％、47.5％、46.31％、40.32％，顯示A1在鹽度為30的情況下仍具有較好的脫氮能力（圖6）。

據(jù)圖7可知，鹽度在10～20的條件下，菌液細(xì)胞密度變化不明顯；鹽度為20時(shí)，菌液細(xì)胞密度達(dá)到最高值，故可得出A1菌體生長(zhǎng)的最適鹽度為10～20。

2.5? 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

A1菌株的16S rRNA擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果為591 bp，將測(cè)序結(jié)果與Genbank上已登錄的基因序列作比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與鹽單胞菌屬（Halomonas）同源性最高，為97.71%。利用MEGA6軟件，將分離菌株與部分參考菌株基于16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其進(jìn)化地位。

2.6? ?生理生化鑒定結(jié)果

分離菌株A1的生理生化鑒定結(jié)果見表4。根據(jù)菌株A1的染色結(jié)果見（圖8）及生理生化測(cè)定（表4）結(jié)果，A1菌為革蘭氏陽性的桿菌，運(yùn)動(dòng)型，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性，葡萄糖發(fā)酵陰性，明膠液化試驗(yàn)陰性。

3? 結(jié)論

本研究從東營(yíng)鹽堿土地中篩選出一株具有耐鹽高效脫氮的革蘭氏陽性桿菌菌株A1，屬鹽單胞菌屬，脫氮最適溫度為25 ℃、最適pH為5、最適鹽度為30，對(duì)于去除畜禽污水中氮素、水環(huán)境污染防治具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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