鵝細小病毒強毒株的分離鑒定與遺傳進化分析

王志強 黃宇翔 鄒躍 張紅 楊昊天 董佳強 楊坤

摘 要：為了了解齊齊哈爾地區(qū)鵝細小病毒（GPV）現(xiàn)地強毒株的流行及抗原變異情況，試驗從齊齊哈爾龍江縣某養(yǎng)殖場采集疑似小鵝瘟病死雛鵝的肝脾病料進行病毒分離培養(yǎng)，對獲得的疑似尿囊液進行PCR檢測、血凝性檢測、動物回歸試驗及VP3基因序列分析。結(jié)果表明，分離到的病毒株能使12日齡鵝胚在144 h內(nèi)死亡；血凝性檢測未檢測出血凝價；動物回歸試驗，可復(fù)制該病，致使5日齡雛鵝在96～144 h內(nèi)全部死亡；VP3基因PCR擴增條帶大約為1 600 bp，與目的條帶大小相符；對其進行序列分析，判定該分離株為鵝細小病毒毒株，與我室之前分離鑒定的鵝細小病毒HH10強毒株核苷酸同源性為98.17%，與標(biāo)準(zhǔn)B株核苷酸同源性為97.13%。說明鵝細小病毒基因保守。

關(guān)鍵詞：鵝細小病毒；現(xiàn)地株分離鑒定；動物回歸試驗；遺傳進化分析

鵝細小病毒（Goose parvovirus， GPV）易感譜很窄，在自然感染條件下，只感染雛鵝和雛番鴨。感染雛鵝引發(fā)的疫病，我們通常稱為小鵝瘟，流行范圍很廣，世界各地均有發(fā)生該病的報道。小鵝瘟是一種極烈性傳染病，對20日齡以內(nèi)的雛鵝，不僅傳染速度快，病死率高，而且越小日齡感染率和病死率越高，甚至可達100%[1]。該病毒感染后可引起雛鵝多器官炎癥，如急性腸炎、肝炎、腎炎等[2]。特征性病變是小腸中下段比正常腸管粗2～3倍，腸道內(nèi)形成灰白色或淡黃色栓狀凝固物。被感染的雛鵝表現(xiàn)出精神沉郁、食欲不振、嚴重下痢、呼吸困難、角弓反張等癥狀[3]。本病的發(fā)生率和死亡率與年齡有很大的相關(guān)性，1周齡以內(nèi)雛鵝感染死亡率達到100%，2～3周齡的雛鵝發(fā)病率雖然很高、但死亡率可能低于10%，而4～5周齡雛鵝感染后，造成的損失可能不大，但如果飼養(yǎng)管理不善，繼發(fā)其他細菌、真菌或病毒感染，可使最終死亡率大幅上升[4]。

2022年5月，龍江縣某養(yǎng)殖場7日齡雛鵝暴發(fā)疑似小鵝瘟疫情，損失非常嚴重。本研究在該養(yǎng)殖場采集疑似鵝細小病毒感染的病料，用鵝胚分離出疑似鵝細小病毒，并通過PCR試驗進行實驗室確診，同時擴增出分離毒株的VP3基因，進行遺傳進化分析，為齊齊哈爾地區(qū)鵝細小病毒現(xiàn)地強毒株的流行及抗原變異情況提供科學(xué)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 病料

病死雛鵝肝臟、脾臟等組織，均采自黑龍江省龍江縣某養(yǎng)鵝場。

1.2? 毒株與試驗動物

HH10株為本實驗室于2010年自黑河市病例中分離鑒定的鵝細小病毒現(xiàn)地強毒株；FY89、YAN98株為本實驗室分離致弱的鵝細小病毒株；12日齡鵝胚與1日齡雛鵝均為鵝細小病毒非免疫本地鵝蛋孵化，其鵝細小病毒瓊擴（AGP）抗體陰性。

1.3? 主要試劑

2×GoTaq? Green Master Mix，購自Promega公司；磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；DAN凝膠回收試劑盒、pMDTM19-T載體克隆試劑盒、質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒，均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.4? ?病毒的分離培養(yǎng)

采集龍江縣某養(yǎng)殖場疑似暴發(fā)鵝細小病毒病死亡雛鵝的肝、脾組織，用研缽研磨，按每克病料加入1 mL生理鹽水的比例稀釋；反復(fù)凍融3次后，14 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后，取0. 2 mL接種于12日齡鵝胚，置于孵化器中繼續(xù)孵化，收取24 h后死亡鵝胚的尿囊液。連傳2代，收取第二代尿囊液，暫命名為LJ22株，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5? ?病毒PCR鑒定

以Zadori等[5]發(fā)表的鵝細小病毒B株核苷酸序列作為參照，應(yīng)用引物設(shè)計軟件oligo6設(shè)計出一對鵝細小病毒VP3基因引物，由上海生工工程有限公司合成，引物序列見表1。以F2代及陰性對照的尿囊液DNA為模板，以設(shè)計合成的引物作為擴增VP3基因的引物，利用PCR法鑒定病毒。PCR反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)條件為：首先95 ℃預(yù)變性5 min；其次95 ℃變性1 min，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，共進行30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察并記錄結(jié)果。

1.7? 血凝特性鑒定

按照文獻[6]方法，采用血凝試驗（HA）測定現(xiàn)地株LJ22的血凝性。

1.8? 動物回歸試驗

將10只1日齡體內(nèi)檢測無鵝細小病毒抗體的雛鵝，隨機平均分成兩組，一組為攻毒組，一組為空白對照組。5日齡時對攻毒組進行強毒感染，所用強毒為現(xiàn)地株LJ22，攻毒方式為頸部皮下注射，攻毒劑量為0.2 mL/羽，空白對照組與攻毒組攻毒方式和攻毒劑量相同，只是將現(xiàn)地株LJ22強毒換成無菌生理鹽水。隔離飼養(yǎng)，每天觀察雛鵝的發(fā)病及死亡情況。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 病毒分離及PCR檢測結(jié)果

將保存?zhèn)溆玫牟×辖臃N鵝胚并傳代，結(jié)果顯示：第一代鵝胚接種后144 h出現(xiàn)死亡，共接種5枚鵝胚，死亡2枚。第二代鵝胚接種后120 h出現(xiàn)死亡，共接種10枚鵝胚，至144 h全部死亡。死亡鵝胚胚體出血明顯，尿囊膜水腫增厚。以F2代病毒尿囊液中的DNA為模板，進行PCR擴增，結(jié)果顯示，擴增得到大小約為1 600 bp的目的片段，與預(yù)期片段大小相符。結(jié)果表明分離病毒為鵝細小病毒。結(jié)果見圖1。

2.2? 血凝試驗結(jié)果

采用微量法測定現(xiàn)地株LJ22株的血凝性，結(jié)果顯示，該分離株不能凝集公雞紅細胞，符合鵝細小病毒沒有血凝性的特點。

2.3? 動物回歸試驗結(jié)果

攻毒組雛鵝發(fā)病率和死亡率均為100%（5/5），對照組雛鵝未見發(fā)病。死亡雛鵝喙發(fā)紺，剖檢見鵝細小病毒典型癥狀，即腸道內(nèi)形成淡黃色栓狀凝固物。結(jié)果見圖2。

2.4? 遺傳進化分析結(jié)果

測定LJ22株的VP3結(jié)構(gòu)基因序列各堿基隨機分布于整個序列，無缺失和插入，少數(shù)發(fā)生替換。使用DNAMAN軟件，對LJ22株與強毒株B株和HH10株、弱毒株FY89、YAN98株一起繪制遺傳進化樹（圖3），結(jié)果顯示LJ22株與強毒株HH10株親緣關(guān)系較近，核苷酸同源性為98.17%；與B株稍遠，為97.13%。與弱毒株YAN98的核苷酸同源性為95.85%，弱毒株FY89為95.66%。

3? 討論

近幾年來在現(xiàn)地服務(wù)過程中發(fā)現(xiàn)，雖然養(yǎng)殖場對小鵝瘟防控工作都十分重視，但依然有小鵝瘟疫情散在發(fā)生，造成很大的經(jīng)濟損失。所以小鵝瘟雖然在1956年就由我國學(xué)者方定一教授分離并命名[2]，但直到今天，防控形勢依然不容樂觀。

鵝細小病毒基因組結(jié)構(gòu)相對簡單，只有兩個主要的開放閱讀框架，位于左側(cè)的開放閱讀框編碼兩種非結(jié)構(gòu)蛋白，NS1和NS2，位于右側(cè)的開放閱讀框編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白，VP1、VP2和VP3[7-9]。鵝細小病毒結(jié)構(gòu)蛋白與病毒的毒力及致病性有關(guān)，其中VP3蛋白暴露于病毒粒子表面，約占病毒衣殼蛋白總含量的80%，是主要抗原蛋白，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性抗體來中和病毒，因此，VP3基因在鵝細小病毒研究中具有重要意義[10-13]。

本研究分離到的LJ22現(xiàn)地強毒株與HH10強毒株核苷酸同源性為98.17%，表明鵝細小病毒基因變異相對較少。至今鵝細小病毒只有一個血清型，它們的基因在漫長的歷史演化過程中嚴格保守，不隨時間和地域的不同而發(fā)生大的改變[2， 14]，本結(jié)果進一步說明鵝細小病毒基因組的這個特點。由于鵝細小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP基因沒有非結(jié)構(gòu)蛋白NS基因保守，相對來講是鵝細小病毒基因組中核苷酸序列最容易出現(xiàn)突變的區(qū)域，因此推測LJ22現(xiàn)地強毒株整個基因組變異不大。細小病毒是所有病毒中基因組最小的病毒之一，鵝細小病毒全基因組只有5 000多個核苷酸，為了更加經(jīng)濟有效的利用，有些核苷酸甚至同時編碼三個蛋白，它們之間不僅相互作用，而且受到彼此制約，鵝細小病毒本身又是DNA病毒，基因組比較穩(wěn)定，因此不易發(fā)生變異[15-18]。由于鵝細小病毒基因組非常小，基因組中的每一個核苷酸都被充分利用，任何重要的核苷酸變化，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變，進而導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生任何變化，都有可能改變病毒的屬性，從而危及到病毒自身的存亡，這是病毒在其進化過程中所不能允許的[14]。

4? 結(jié)論

本研究成功分離鑒定出1株鵝細小病毒現(xiàn)地強毒株LJ22株，并針對其VP3基因進行了序列分析，結(jié)果顯示VP3基因僅有個別核苷酸發(fā)生改變，雖然鵝細小病毒也在有效免疫的選擇壓力下，但其基因組趨于保守，并未引起強毒株基因組變異，雖未變異，但防控形勢依然不容樂觀。本研究為鵝細小病毒病的流行病學(xué)調(diào)查提供了一定的參考依據(jù)，并為進一步制定鵝細小病毒病的防控方法奠定了基礎(chǔ)。

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