低溫脅迫對(duì)不同耐寒紅樹植物幼苗光合生理和抗氧化特性的影響

許明海，馮 瑜，童宇艷，岳丹斐，張慧玉，鄭春芳*

(1. 平陽(yáng)縣自然資源和規(guī)劃局，浙江 溫州 325400；2. 城鎮(zhèn)水污染生態(tài)治理技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035；3. 奉港中學(xué)，浙江 寧波 315500；4. 武義縣實(shí)驗(yàn)小學(xué)，浙江 武義 321200)

紅樹林分布于熱帶和亞熱帶海灣、河口灘涂上以紅樹植物為主的常綠喬木、灌木組成的木本植物群落，具有促淤防浪護(hù)岸，護(hù)堤固灘、促淤固灘、凈化水體、美化景觀、維持濕地生物多樣性以及固碳儲(chǔ)碳等重要生態(tài)功能[1-2]。溫度是限制紅樹植物地理分布的重要因素[3]。中國(guó)紅樹林植物種類隨緯度的升高和平均溫度的下降而減少，其中，最南的海南省紅樹植物種類有24 種，而人工引種最北界浙江僅有1 種[4]。近些年來(lái)，全球變暖已經(jīng)成為不爭(zhēng)的事實(shí)，這勢(shì)必對(duì)紅樹林生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。紅樹林是嗜熱植物，主要分布在南北半球25 ℃等溫線內(nèi)，而以全球變暖為主要特征的全球氣候變化可促進(jìn)紅樹林向更高緯度引種，目前紅樹林的自然分布北界可由現(xiàn)在的福建福鼎北擴(kuò)至浙江，甚至已經(jīng)開始在杭州嘗試種植[5]。然而，另一方面，因氣候變化帶來(lái)的頻繁極端低溫災(zāi)害又對(duì)紅樹林生態(tài)系統(tǒng)造成了極大的傷害和嚴(yán)重威脅，尤其是生長(zhǎng)最北緣的紅樹植物[6-7]。多年引種經(jīng)驗(yàn)表明，限制我國(guó)高緯度地區(qū)紅樹分布的主要因素是溫度，其中極端最低溫度是主要限制因素之一[4]，這主要表現(xiàn)在極端低溫會(huì)引起紅樹植物光合器官受損，抗氧化系統(tǒng)失衡，光合電子傳遞受阻，生長(zhǎng)發(fā)育停滯，葉片發(fā)黃脫落，植株?duì)I養(yǎng)物質(zhì)損失，成熟植株提前落花落果，甚至死亡等[8-10]，詳見圖1。因此，解析紅樹林對(duì)低溫脅迫響應(yīng)與適應(yīng)機(jī)制已成為提高紅樹林抗寒性的重要課題。

圖1 2015 年不同樹齡紅樹林極端低溫傷害癥狀Fig. 1 The symptoms of extremely cold events damage on mangroves in 2015

秋茄（Kandelia obovateSheue et al.）為紅樹科秋茄樹屬常綠灌木或小喬木，是我國(guó)境內(nèi)分布最廣、緯度分布最高、最耐寒的紅樹植物，在我國(guó)引種成林的最北緣為浙江西門島[11]。紅欖李（Lumnitzera littore(Jack.)Voigt）是使君子科欖李屬的紅樹植物，主要分布于東非到西太平洋、澳大利亞亞熱帶地區(qū)和中南半島，目前我國(guó)野生種數(shù)量?jī)H有9 株，唯一分布地在三亞鐵爐港[12]。紅欖李生長(zhǎng)于易受人為干擾的高潮帶，是嗜熱窄分布的瀕危紅樹植物[13-14]。研究認(rèn)為，紅欖李瀕危的主要原因主要包括：種群遺傳性多樣性較低，野生個(gè)體數(shù)量較少，有性生殖存在障礙等[15]。一般來(lái)說(shuō)，紅欖李對(duì)溫度的要求也較為苛刻。據(jù)調(diào)查，紅欖李僅能生長(zhǎng)在年平均溫度為21～25 ℃，且全年無(wú)霜的灘涂上，這導(dǎo)致紅欖李對(duì)低溫的影響較為敏感。目前，對(duì)紅樹植物低溫脅迫的研究主要集中在秋茄、白骨壤、桐花樹等[16-17]上，而將我國(guó)分布最南（低溫敏感）的紅欖李與最北（耐寒）秋茄置于相同低溫下比較其對(duì)溫度耐性的生理機(jī)制研究還報(bào)道甚少。本研究以低溫敏感型紅欖李和耐寒型秋茄幼苗為試驗(yàn)材料，通過(guò)比較分析兩種紅樹植物在不同低溫時(shí)間處理下的光合生理參數(shù)、熒光參數(shù)、光合色素含量、活性氧含量、抗氧化系統(tǒng)中關(guān)鍵酶活性以及葉綠體超微結(jié)構(gòu)、氣孔開放特征等變化，探討兩種紅樹植物響應(yīng)低溫的光合生理和抗氧化特性差異，以期為我國(guó)紅樹林資源保護(hù)與抗寒機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2021 年10 月初，分別將來(lái)自福建漳江口紅樹林國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)（117°24′～117°30′ E，23°53′～23°56′ N）和三亞鐵爐港紅樹林自然保護(hù)區(qū)（109°42′～109°44′ E，18°15′～18°17′ N）已培育1 a 的健壯秋茄、紅欖李幼苗（生長(zhǎng)在規(guī)格為13 cm × 13 cm 營(yíng)養(yǎng)杯中）裝入高30 cm、直徑為20 cm 的聚乙烯塑料桶內(nèi)。小心剪開營(yíng)養(yǎng)杯的底部，使幼苗根系能夠直接接觸塑料桶底部，加入一定量的Hoagland’s 營(yíng)養(yǎng)液，使塑料桶底部營(yíng)養(yǎng)液3 cm 左右深。將其擺放在人工氣候室（晝夜溫度28 ℃/25 ℃）內(nèi)培養(yǎng)，適應(yīng)恢復(fù)15 d。恢復(fù)期間每2 d 更換一次Hoagland’s 營(yíng)養(yǎng)液。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇大小一致的秋茄和紅欖李幼苗，移至?xí)円箿囟葹?5 ℃ /20 ℃，光照周期為12 h /12 h，光強(qiáng)為 400 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度為65%～70%的智能培養(yǎng)箱內(nèi)，適應(yīng)10 d。隨后將兩種紅樹植物幼苗均分成2 組，一組仍保留在溫度25 ℃ (晝) /20 ℃ (夜)的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，作為對(duì)照；另一組移入溫度為7 ℃（晝）/4 ℃（夜）的冷光源植物生長(zhǎng)箱（DGX-260E）進(jìn)行低溫脅迫處理（簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)S)，在低溫處理24、48 h 時(shí)，分別取對(duì)照和兩種紅樹植物幼苗頂端完全展開的倒三對(duì)葉片進(jìn)行光合、熒光以及生理指標(biāo)測(cè)定；每個(gè)處理3 盆，3 次重復(fù)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 光合參數(shù)的測(cè)定 使用Li-6400 型便攜式光合儀于9:30—11:30 測(cè)定頂端完全展開的倒三對(duì)葉片的凈光合速率（Pn）、細(xì)胞間隙CO2濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率參數(shù)。測(cè)定時(shí)設(shè)定內(nèi)置紅藍(lán)光源光強(qiáng)為400 μmol·m-2s-1，CO2濃度均為（410 ± 3）μmol·mol-1，氣體流速設(shè)為500 μmol·s-1。氣孔限制值（Ls）計(jì)算公式為：Ls=1-Ci/Ca

1.3.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù) 使用FMS2 調(diào)制式熒光測(cè)定儀（英國(guó)Hansatech 公司）進(jìn)行葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定。測(cè)定時(shí)先測(cè)定光適應(yīng)下的穩(wěn)態(tài)熒光（Fs）、最大熒光（Fm’）等參數(shù)，暗環(huán)境下適應(yīng)30 min 后，測(cè)定初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）和PSII 最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）。根據(jù)Yuan 等[18]的方法計(jì)算PSII 實(shí)際光化學(xué)效率（ФPSII）、光化學(xué)猝滅系數(shù)（qP）以及非光化學(xué)猝滅系數(shù)（NPQ）。

1.3.3 光合色素的測(cè)定 稱取0.1 g 秋茄、紅欖李幼苗葉片剪碎放入25 mL 的1:1 無(wú)水乙醇和丙酮提取液中。置于黑暗環(huán)境下提取至葉片發(fā)白，測(cè)定提取液在665、649 和470 nm 處的吸光值，參照李合生[19]方法計(jì)算葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素以及類胡蘿卜素含量。

1.3.4 超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）活性和丙二醛（MDA）含量的測(cè)定 分別取1.0 g 秋茄、紅欖李幼苗葉片，加3 mL 50 mmol·L-1pH7.5 Tris-HCL 緩沖液后進(jìn)行冰浴研磨，離心30 min，取上清液待測(cè)。用氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）法測(cè)定SOD 活性[20]，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD 活性[20]；按Du 和Bramlage[21]方法測(cè)定MDA 含量。

1.3.5 過(guò)氧化氫（H2O2）與超氧陰離子（O2·-）含量的測(cè)定 參照彭建等[22]鉬酸銨法測(cè)定樣品過(guò)氧化氫酶活性。利用羥胺氧化法[23]測(cè)定樣品O2·-含量。

1.3.6 葉綠體超微結(jié)構(gòu)和氣孔掃描電鏡 分別取各實(shí)驗(yàn)小組葉片進(jìn)行裁剪為長(zhǎng)條形1 × 2 mm（避開主脈），將取樣葉片正反面標(biāo)記進(jìn)行真空處理，確保樣品沉入固定液中，其中葉綠體透射電鏡標(biāo)本采用5% 戊二醛固定液，氣孔掃描電鏡標(biāo)本選用2.5%的戊二醛固定液。使用JEOL JEM-1230 透射電鏡和Zeiss Gemini 300 掃描電鏡進(jìn)行樣本觀察。

測(cè)量之前先用圖片中的10 μm 微尺定標(biāo)，利用ImageJ 軟件測(cè)量單個(gè)氣孔的氣孔長(zhǎng)、氣孔寬，并按照張翠等[24]方法計(jì)算氣孔開度。同時(shí)，利用軟件中的polygon 工具測(cè)量氣孔面積。每個(gè)處理測(cè)量3 個(gè)樣本，每個(gè)樣本測(cè)量10 個(gè)視野。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)SPSS 10.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行數(shù)據(jù)比較，采用Duncan’s 法檢驗(yàn)處理間差異的顯著水平（P＜0.05）。圖中數(shù)據(jù)均為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)偏差，通過(guò)SigmaPlot 10.0 繪圖軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)兩種紅樹植物幼苗生長(zhǎng)和葉片氣體交換參數(shù)的影響

由圖2 可知，在低溫脅迫48 h 時(shí)，秋茄幼苗葉片并未產(chǎn)生明顯的變化，而同樣低溫處理下紅欖李幼苗葉片出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，即葉片明顯下垂。

圖2 低溫脅迫對(duì)兩種紅樹植物幼苗生長(zhǎng)情況的影響Fig. 2 Effects of low temperature stress on growth of two mangrove seedlings

由表1 可知，秋茄和紅欖李幼苗葉片凈光合速率（Pn）均隨著低溫脅迫時(shí)間的增長(zhǎng)而顯著下降，甚至低溫脅迫48 h 處理下紅欖李幼苗葉片Pn甚至降至-0.33 μmol·m-2·s-1。與對(duì)照相比，低溫脅迫下兩種紅樹植物葉片Pn下降幅度存在著較大的差異，且降低幅度隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而增加。例如，與對(duì)照相比，低溫脅迫48 h 處理下，秋茄幼苗葉片Pn下降幅度約為82.1%，而紅欖李幼苗葉片Pn下降幅度約為105.2%。此外，低溫脅迫48 h 處理下，秋茄幼苗葉片Pn下降幅度為紅欖李約為79%，表明秋茄耐寒性較高于紅欖李。

表1 低溫脅迫對(duì)兩種紅樹植物幼苗葉片氣體交換參數(shù)的影響Table 1 Effects of low temperature stress on gas exchange parameters in leaves of two mangrove seedlings

不同低溫脅迫處理下兩種紅樹植物葉片氣孔導(dǎo)度（Gs）變化趨勢(shì)與Pn相似（表1）。與對(duì)照相比，低溫脅迫24 h 處理下，秋茄和紅欖李幼苗葉片Gs分別下降25%和55%，而低溫脅迫48 h 處理下兩種紅樹植物葉片Gs分別下降70%和90%，這表明紅欖李幼苗葉片Gs對(duì)低溫響應(yīng)比秋茄更為敏感。

由表1 可知，隨低溫處理時(shí)間延長(zhǎng)秋茄幼苗葉片胞間CO2濃度（Ci）呈先增后降的趨勢(shì)，而紅欖李幼苗葉片Ci卻逐漸增加。在低溫脅迫24 h 處理下，秋茄、紅欖李幼苗葉片Ci為對(duì)照的1.19 倍和1.28 倍。然而，與對(duì)照相比，低溫脅迫48 h 處理下，秋茄幼苗葉片Ci降低了21%，而紅欖李幼苗葉片Ci則增加了55%。

隨低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，紅欖李幼苗葉片氣孔限制值（Ls）持續(xù)降低，而秋茄幼苗葉片氣孔限制值呈先降后增的趨勢(shì)（表1）。與對(duì)照相比，低溫脅迫24 h 處理下，秋茄、紅欖李幼苗葉片Ls分別降低44% 和45%；低溫脅迫48 h 處理下秋茄植物葉片Ls上升了120%，而紅欖李植物葉片氣孔限制值降低了87%。

2.2 低溫脅迫對(duì)兩種紅樹植物幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由表2 可知，隨著低溫脅迫的時(shí)間延長(zhǎng)，秋茄和紅欖李幼苗葉片F(xiàn)v/Fm、ΦPSⅡ和qP 均逐漸減少。低溫脅迫下，紅欖李幼苗葉片F(xiàn)v/Fm、ΦPSⅡ和qP 下降幅度均大于秋茄，且隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，各值降低幅度更大。與對(duì)照相比，低溫脅迫24 h 下，秋茄幼苗葉片F(xiàn)v/Fm、ΦPSII、qP 分別降低18%、21% 以及25%，而紅欖李幼苗葉片F(xiàn)v/Fm、ΦPSⅡ和qP 則分別降低32%、41% 以及27%；低溫脅迫48 h 處理下，秋茄幼苗葉片F(xiàn)v/Fm、ΦPSⅡ、qP 分別降低39%、38% 以及44%，而紅欖李幼苗葉片F(xiàn)v/Fm、ΦPSⅡ、qP 分別降低達(dá)70%、77%以及51%。隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，秋茄幼苗葉片NPQ 呈逐漸增加的趨勢(shì)，而紅欖李幼苗葉片NPQ 卻先增后降（表2）。與對(duì)照相比，低溫脅迫24 h 和48 h 下，秋茄幼苗葉片NPQ 分別增加26%和49%，低溫脅迫24 h 下紅欖李幼苗葉片NPQ 為對(duì)照1.28 倍，而低溫脅迫48 h 處理下葉片NPQ 為對(duì)照的36%。

表2 低溫脅迫對(duì)兩種紅樹植物幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Table 2 Effects of low temperature stress on chlorophyll fluorescence parameters of leaves of two mangrove seedlings

2.3 低溫脅迫對(duì)兩種紅樹植物幼苗葉片光合色素含量的影響

由表3 可知，隨低溫脅迫延長(zhǎng)秋茄和紅欖李幼苗葉片葉綠素（Chl）含量、類胡蘿卜素(Car)含量、Chl a/Chl b 值均逐漸減少（表3）。低溫處理下兩種紅樹植物相比，秋茄幼苗葉片Chl 含量、Car 含量、Chl a/Chl b 值以及Car/Chl 值均比紅欖李的值高。

表3 低溫脅迫對(duì)兩種紅樹植物幼苗葉片光合色素的影響Table 3 Effects of low temperature stress on photosynthetic pigments in leaves of two mangrove seedlings

與對(duì)照相比，低溫脅迫24 h 和48 h 處理下，秋茄幼苗葉片Chl 含量分別下降16%和18%；低溫脅迫24 h 處理下，秋茄幼苗葉片葉片Car/Chl值上升18%，而低溫脅迫48 h 處理下秋茄幼苗葉片Car/Chl 值無(wú)顯著性差異；兩個(gè)低溫脅迫處理相比，秋茄幼苗葉片Chl 含量無(wú)顯著差異變化，而Car/Chl 值顯著下降（P＜0.05）。與對(duì)照相比，低溫脅迫24 h 處理下，秋茄幼苗葉片Car 含量和Chl a/Chl b 值均無(wú)顯著差異變化，而低溫脅迫48 h 處理下秋茄幼苗葉片Car 含量和Chl a/Chl b 值均顯著下降（P＜0.05）。

與對(duì)照相比，低溫脅迫24 h 和48 h 處理下，紅欖李幼苗葉片Chl 含量分別降低23% 和41%，Car/Chl 值分別上升10% 和30%；兩個(gè)低溫脅迫處理相比，低溫脅迫24 h 處理下紅欖李幼苗葉片Chl 含量顯著高于低溫脅迫48 h 處理（P＜0.05），兩個(gè)低溫脅迫處理下紅欖李幼苗葉片Car/Chl 值均上升。與對(duì)照相比，低溫脅迫24 h 處理下紅欖李幼苗葉片Car 含量和Chl a/Chl b 值均無(wú)顯著差異變化，而低溫脅迫48 h 處理下紅欖李幼苗葉片Car 含量和Chl a/Chl b 值均顯著下降（P＜0.05）。

2.4 低溫脅迫對(duì)秋茄和紅欖李幼苗葉片抗氧化系統(tǒng)與膜脂過(guò)氧化程度的影響

秋茄和紅欖李幼苗葉片SOD 活性均隨低溫脅迫延長(zhǎng)逐漸降低，且紅欖李幼苗下降的幅度較大（表4）。比如，與對(duì)照相比，低溫脅迫24 h 和48 h 處理下，秋茄幼苗葉片SOD 活性分別降低2%和61%，而紅欖李幼苗葉片SOD 活性分別降低51%和85%。不同低溫處理間相比，低溫脅迫24 h 處理下，秋茄葉片SOD 活性顯著高于低溫脅迫48 h 處理，而與對(duì)照之間無(wú)顯著差異；低溫脅迫24 h 處理下，紅欖李幼苗葉片SOD 活性與對(duì)照和低溫脅迫48 h 處理均存在顯著差異（P＜0.05）。

隨低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，秋茄幼苗葉片POD 活性先增后降，而紅欖李幼苗葉片POD 活性一直持續(xù)下降（表4）。與對(duì)照相比，低溫脅迫24 h 和48 h 處理下，秋茄幼苗葉片POD 活性增加了113%和42%，而紅欖李幼苗葉片POD 活性分別降低53%和94%。

隨著低溫脅迫延長(zhǎng)兩種紅樹植物葉片MDA 含量均逐漸增加，且紅欖李幼苗葉片MDA 含量高于秋茄（表4）。低溫脅迫24 h、48 h 處理下，秋茄幼苗葉片MDA 含量分別為對(duì)照的1.35 倍和1.63 倍，而紅欖李幼苗葉片MDA 含量分別為對(duì)照1.53 倍和1.88 倍。

2.5 低溫脅迫對(duì)秋茄、紅欖李幼苗葉片H2O2 含量和O2-含量的影響

由表5 可知，隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，秋茄和欖李幼苗葉片H2O2和O2·-含量均逐漸增加。與對(duì)照相比，低溫脅迫24 h 和48 h 處理下秋茄幼苗葉片H2O2、O2·-含量分別增加了20%、27%和44%、32%；低溫脅迫24 h、48 h 處理下紅欖李幼苗葉片H2O2和O2·-含量分別增加了31%、37%與60%、43%。

表5 低溫脅迫對(duì)兩種紅樹植物葉片過(guò)氧化氫（H2O2）含量和超氧陰離子（O2·-）的影響Table 5 Effects of low temperature stress on the contents of hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide anion (O2·-) in leaves of two mangrove plants

2.6 低溫脅迫對(duì)兩種紅樹植物幼苗葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

由圖3 可知，對(duì)照條件下，秋茄（圖3A）和紅欖李（圖3B）幼苗葉片葉綠體緊密分布在細(xì)胞壁周圍且結(jié)構(gòu)完整，呈現(xiàn)為餅狀或者凸透鏡狀，基粒片層排列較為緊密有序，膜清晰可辨，可以觀察到葉綠體內(nèi)有淀粉粒（S）和嗜鋨體（OG）。與對(duì)照相比，低溫脅迫48 h 處理下秋茄（圖3 a）和紅欖李（圖3 b）的葉綠體與對(duì)照相比，其葉綠體明顯膨脹，淀粉粒腫脹變大且基粒片層間距加大，葉綠體膜較對(duì)照狀態(tài)下出現(xiàn)不清晰或破裂等現(xiàn)象，其中紅欖李幼苗葉片葉綠體結(jié)構(gòu)受低溫脅迫傷害更大，如葉綠體數(shù)目、單位基粒數(shù)和基粒片層數(shù)均減少，淀粉粒異常膨大。

圖3 低溫脅迫下兩種紅樹植物葉綠體超微結(jié)構(gòu)Fig. 3 Effects of low temperature stress on the ultrastructure of chloroplasts in two mangrove plants

2.7 低溫脅迫對(duì)秋茄和紅欖李幼苗葉片氣孔結(jié)構(gòu)特征的影響

由圖4 可知，低溫脅迫下秋茄和紅欖李幼苗葉片氣孔開張度均明顯小于對(duì)照。通過(guò)計(jì)算，低溫脅迫下秋茄幼苗葉片氣孔長(zhǎng)、寬以及開張度均顯著高于紅欖李（P＜0.05）。與對(duì)照相比，低溫脅迫48 h 處理下秋茄、紅欖李幼苗葉片氣孔長(zhǎng)、寬以及開張度長(zhǎng)并未顯著變化。同樣，秋茄幼苗葉片氣孔開張度寬均顯著高于紅欖李（P＜0.05）。與對(duì)照相比，低溫脅迫48 h 處理下秋茄和紅欖李幼苗氣孔開張度寬分別降低37%和80%，氣孔面積分別上升了25%和24%。

圖4 低溫脅迫對(duì)兩種紅樹植物葉片氣孔形態(tài)的影響Fig. 4 Effects of low temperature stress on the leaf stomata of two mangrove plants

3 討論

光合作用是植物生長(zhǎng)發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)，而低溫脅迫下植物則通過(guò)光合作用強(qiáng)弱可以反映其抗寒能力[25-26]。研究認(rèn)為，逆境脅迫引起的植物光合作用限制因子可分為氣孔限制和非氣孔限制，其中氣孔限制導(dǎo)致的葉片光合速率下降主要表現(xiàn)氣孔關(guān)閉引起Ci、Gs均降低，Ls升高；而非氣孔限制則主要表現(xiàn)為Ci升高，Ls下降，這歸因于逆境會(huì)破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，使光合色素合成受到抑制，電子傳遞受阻等[27-30]。前期研究還發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫會(huì)使紅樹植物秋茄的葉綠體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，基粒溶解、基層片層斷裂，膜破裂，甚至解體，最終引起葉片凈光合速率降低，這也是非氣孔限制的主要表現(xiàn)之一[25]。然而，低溫如何影響紅欖李幼苗葉片光合能力的研究仍未有相關(guān)報(bào)道。在本研究中，48 h 7 ℃（晝）/4 ℃（夜）處理對(duì)秋茄幼苗影響較小，其植株未有低溫傷害癥狀，而在同樣溫度下紅欖李幼苗卻出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，且葉片凈光合速率值為負(fù)值，表明秋茄耐寒性遠(yuǎn)高于紅欖李。本研究還發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫24 h 處理下秋茄幼苗葉片Pn、Gs以及Ls均降低，而Ci升高；低溫脅迫48 h 處理下，秋茄幼苗葉片Pn、Gs以及Ci均降低，而Ls升高，表明低溫脅迫24 h 處理下秋茄幼苗葉片Pn的下降主要受到非氣孔限制的影響，這可能是秋茄對(duì)低溫的應(yīng)急反應(yīng)。當(dāng)脅迫時(shí)間延遲至48 h 時(shí)，其Pn的降低由氣孔限制影響，主要表現(xiàn)在氣孔開張度減少（圖4B 和表6），與此同時(shí)，非氣孔限制仍存在，如葉綠體超微結(jié)構(gòu)（圖3a）受到輕微傷害。與秋茄不同，低溫脅迫24 h 和48 h 處理下紅欖李幼苗葉片Pn、Gs以及Ls均降低，而Ci均升高，表明低溫脅迫下，紅欖李幼苗葉片Pn的降低主要由非氣孔限制起著主要作用，表現(xiàn)在葉綠體超微結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，如葉綠體數(shù)目、單位基粒數(shù)和基粒片層數(shù)均減少，淀粉粒異常膨大等（圖3b），葉片氣孔基本關(guān)閉（圖4D）。綜上所述，非氣孔限制是影響紅欖李幼苗不耐寒的一個(gè)重要因素。

表6 低溫脅迫對(duì)兩種紅樹植物葉片氣孔指標(biāo)的影響Table 6 Effects of low temperature stress on leaf stomatal indexes of two mangrove plants

植物葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm、ΦPSII、qP 等）可作為判定植物耐寒能力的重要指標(biāo)，其中電子傳遞有效性和光化學(xué)效率的差異是影響植物耐寒性的主要原因[31]。研究認(rèn)為，低溫脅迫直接降低秋茄葉片F(xiàn)v/Fm、ΦPSII和qP 等，引起PSII 反應(yīng)中心出現(xiàn)過(guò)剩的激發(fā)能，致使葉片發(fā)生PSII 光抑制，最終導(dǎo)致葉片Pn下降[25]。本研究中，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，秋茄、紅欖李幼苗葉片F(xiàn)v/Fm、ΦPSII和qP 均下降，且低溫脅迫48 h 處理下紅欖李幼苗葉片各熒光參數(shù)下降幅度均高于秋茄，表明低溫脅迫會(huì)使兩種紅樹植物的PSII 反應(yīng)中心發(fā)生部分失活或傷害，降低反應(yīng)中心對(duì)激發(fā)能捕獲能力，影響葉片凈光合速率。然而，低溫脅迫對(duì)紅欖李的傷害更為嚴(yán)重，這也驗(yàn)證了紅欖李葉片Pn下降是由于非氣孔限制引起。前期研究還發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫提高秋茄幼苗葉片NPQ 值，表明植株通過(guò)以熱耗散方式散失過(guò)多的光能，從而減輕光系統(tǒng)傷害[32]，這與本研究結(jié)果一致。然而，紅欖李幼苗僅在低溫脅迫24 h 處理下，葉片NPQ 顯著高于對(duì)照，而低溫脅迫48 h 處理下，其值卻顯著下降，這表明低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)后紅欖李已不能通過(guò)增加熱耗散來(lái)避免傷害，從而喪失了防御能力。

光合色素能夠在植物光合作用中參與吸收、傳遞光能或引起原初光化學(xué)反應(yīng)，其含量的變化可反映植物光合作用的強(qiáng)弱。光合色素主要包括Chl（Chl a 和Chl b）和Car，其中Chl 在光合作用的光吸收中其核心作用，而Car 不僅具有天線色素作用，而且還可以減少ROS[33]。前期研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下Chl a/Chl b 值能反映光合能力強(qiáng)弱，且Chl a/Chl b 值與秋茄抗寒性有正相關(guān)[34]。研究還認(rèn)為，葉綠素含量的降低主要是低溫脅迫通過(guò)增加葉綠素酶活性，促進(jìn)葉綠素的降解[35]。本研究中，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，秋茄和紅欖李幼苗葉片葉綠素含量、Chl a/Chl b 值均呈下降的趨勢(shì)，且低溫脅迫24 h 和48 h 處理下，秋茄幼苗葉片葉綠素含量和Chl a/Chl b 值均無(wú)顯著性差異，而紅欖李幼苗葉片葉綠素含量卻存在顯著差異，這表明低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)可能也會(huì)加快紅欖李幼苗葉片葉綠素酶活性，促進(jìn)葉綠素的降解，而相同低溫脅迫下秋茄幼苗卻未有相似現(xiàn)象，這可能歸因于較高的Chl a/Chl b 值，即秋茄的抗寒能力高于紅欖李。對(duì)兩種紅樹葉片Car 含量變化分析，秋茄幼苗葉片Car 合成對(duì)低溫脅迫時(shí)間較紅欖李敏感，即在低溫脅迫下秋茄幼苗葉片Car 參與清除ROS 的作用相比于紅欖李較強(qiáng)，如低溫脅迫24 h和48 h 處理下秋茄幼苗葉片Car 含量存在顯著差異，而紅欖李幼苗而無(wú)顯著差異。Car/Chl 值與植物清除活性氧的能力有關(guān)，逆境下植物Car/Chl 值變化可與清除ROS 的抗氧化酶活性一致[36]。低溫脅迫24h 處理下，秋茄幼苗葉片Car/Chl 值顯著增加，而隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，其值卻下降。這主要是因?yàn)榍锴延酌缡艿捷p微低溫脅迫時(shí)，植株出現(xiàn)應(yīng)急反應(yīng)，迅速提升Car/Chl值，進(jìn)而減輕ROS對(duì)細(xì)胞的傷害；之后隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，這種自我保護(hù)作用減弱。與秋茄不同，隨著低溫時(shí)間延長(zhǎng)紅欖李幼苗葉片Car/Chl 值一直持續(xù)增加，這可能與低溫脅迫下紅欖李幼苗葉片ROS 大量積累有關(guān)。

低溫脅迫會(huì)使不耐寒紅樹植物體內(nèi)大量ROS累積，引起細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，破壞膜結(jié)構(gòu)，而耐寒紅樹植物卻在低溫脅迫下植株呈現(xiàn)較輕的傷害程度，這與清除ROS 的抗氧化酶活性和Car 含量有關(guān)[12]。研究認(rèn)為，當(dāng)植物抵抗低溫脅迫時(shí)，其首先啟動(dòng)SOD，將O2·-轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，POD和CAT 則進(jìn)一步將H2O2分解為H2O 和O2，從而減輕活性氧對(duì)膜系統(tǒng)的傷害，增強(qiáng)植株的抗寒性[37]。本研究中，一方面，隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)秋茄、紅欖李幼苗葉片SOD 活性均降低，致使清除O2·-能力降低，使其含量增加。另一方面，在兩種紅樹植物體內(nèi)SOD 催化O2·-歧化為H2O2和O2后，POD 對(duì)清除H2O2將起著重要作用；相同低溫脅迫下秋茄幼苗葉片POD 活性顯著增加，而紅欖李幼苗葉片POD 活性顯著降低。此外，秋茄幼苗葉片MDA 含量增加幅度小于紅欖李。說(shuō)明POD 在低溫脅迫下兩種紅樹植物抗氧化清除酶系統(tǒng)中起著主要作用[16]，其中低溫脅迫會(huì)抑制紅欖李幼苗葉片抗氧化酶活性，提高了H2O2含量，增加了膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 積累，從而加劇膜的損傷；相反，秋茄卻有較強(qiáng)的防御機(jī)制，這也是其耐寒性高于紅欖李的原因之一。

4 結(jié)論

隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)秋茄和紅欖李幼苗葉光合能力均逐漸降低，但紅欖李光合作用降低的幅度更大，尤其是在低溫脅迫48 h 處理下，表明秋茄耐寒性較紅欖李高。這可能是因?yàn)椋旱蜏孛{迫48 h 處理下，紅欖李幼苗葉片光合色素下降，葉綠體超微結(jié)構(gòu)受到破壞，氣孔開張度減少，光合電子傳遞效率降低，PSII 反應(yīng)中心受到傷害，ROS增加，膜系統(tǒng)受損，致使光合能力下降，而秋茄受到的低溫傷害較紅欖李輕。研究結(jié)果不僅豐富了我國(guó)紅樹林抗寒研究?jī)?nèi)容，而且也為高緯度紅樹林引種提供了重要參考依據(jù)。