落葉松八齒小蠹伴生長(zhǎng)喙殼真菌致病性研究

劉 亞，周勤政，王慧敏，王 正，呂 全*

(1. 國(guó)家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護(hù)研究所，北京 100091；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，北京 100193；3. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東 泰安 271018)

落葉松八齒小蠹（Ips subelongatusMotschulsky）為鞘翅目、小蠹亞科、齒小蠹屬昆蟲，在東亞廣泛分布，是中國(guó)北方3 種落葉松（興安落葉松、華北落葉松和長(zhǎng)白落葉松）的次期性嚴(yán)重為害的蛀干害蟲[1]，在種群暴發(fā)期可為害健康樹木。作為影響本土針葉樹并對(duì)非本土針葉樹有威脅的主要害蟲，該害蟲于2003 年被中國(guó)列入“全國(guó)林業(yè)危險(xiǎn)性有害生物名單”（國(guó)家林業(yè)局，2003年），于2005 年被歐洲地中海植物保護(hù)組織列入A2 預(yù)警名單（EPPO，2005）。此外，小蠹蟲攜帶的多種病原微生物，特別是長(zhǎng)喙殼真菌，在小蠹蟲為害過(guò)程中會(huì)加重對(duì)樹木的危害[2]。

長(zhǎng)喙殼真菌是一類包括蛇口殼目（Ophiostomatales）真菌及相似類群真菌的總稱，其中一些種類是引起林木病害的重要病原菌，如引起榆樹荷蘭病的Ophiostoma ulmi和Ophiostoma novo-ulmi、引起月桂枯萎病的Raffaelea lauricola及引起針葉樹黑根病的Leptographium wageneri[2-4]。已有研究證實(shí)，齒小蠹伴生真菌群落中的先鋒種Endoconidiophoraspp.，如Endoconidiophora fujiensis，對(duì)日本地區(qū)的落葉松毒力較強(qiáng)，可引發(fā)寄主壞死，或誘導(dǎo)寄主落葉松產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗性反應(yīng)[5]。Endoconidiophora polonica高密度接種在挪威云杉上，能導(dǎo)致其死亡[6]。

小蠹蟲和長(zhǎng)喙殼真菌在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中形成了復(fù)雜的伴生關(guān)系，二者之間的聯(lián)系在小蠹蟲定殖寄主過(guò)程中起著重要作用[7-8]。研究表明，長(zhǎng)喙殼真菌可以合成小蠹蟲生長(zhǎng)發(fā)育所必需的甾醇[9]、解毒寄主樹木的防御物質(zhì)[10-12]、釋放化學(xué)信息素吸引或排斥同種小蠹蟲[13-14]等。然而，一些寄主萜類化合物對(duì)小蠹蟲及其伴生真菌具有毒性，如針葉樹在受到小蠹蟲攻擊時(shí)會(huì)增加單萜類化合物的合成，以抵抗小蠹蟲的入侵，當(dāng)萜類物質(zhì)濃度高于小蠹蟲的生理耐受閾值時(shí)，抑制小蠹蟲的攻擊[15]；離體試驗(yàn)也表明，在培養(yǎng)基中添加α-pinene 和limonene 等單萜類物質(zhì)，可抑制長(zhǎng)喙殼真菌的生長(zhǎng)[14, 16]。

研究明確小蠹蟲傳播的真菌是否會(huì)引起植物病害以及植物是否會(huì)對(duì)小蠹蟲及其伴生真菌產(chǎn)生抗性，是關(guān)于小蠹蟲傳播病菌的2 個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。本研究將2010—2018 年采集分離的12 種落葉松八齒小蠹伴生長(zhǎng)喙殼真菌代表性菌株接種到5 年生落葉松苗上[17]，觀察不同真菌或菌株之間的致病力是否存在差異，并分析寄主防御相關(guān)代謝物質(zhì)的變化，以探究落葉松八齒小蠹及其伴生長(zhǎng)喙殼真菌復(fù)合物對(duì)落葉松的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 本試驗(yàn)選用的12 種長(zhǎng)喙殼真菌為由2010—2018 年采集的落葉松八齒小蠹蟲體和坑道中分離純化得到的菌株[17]，分別為E.fujiensis、E.laricicola、Ophiostoma hongxingense、Ophiostoma peniculi、Ophiostoma pseudobicolor、Ophiostoma subelongati、Ophiostoma genhense、Ophiostoma lotiforme、Ophiostoma rufum、Ophiostoma minus、Ophiostoma multisynnematum和Ophiostoma xinganense，每種真菌各選用2 個(gè)菌株用于致病力試驗(yàn)（表1）。

表1 供試菌株信息 Table 1 The information of tested strains

1.1.2 寄主植物 選擇移栽于中國(guó)林科院內(nèi)的5 年生長(zhǎng)白落葉松（Larix olgensisA. Henry）作為試驗(yàn)材料。這些落葉松高2.0～3.0 m，平均2.49 m，地徑2.05～4.77 cm，平均3.05 cm。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接種 菌株在2% MEA 培養(yǎng)基上25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，用經(jīng)滅菌的直徑6 mm 軟木塞打孔器在新培養(yǎng)菌落邊緣打取菌苔。于2019 年7 月9 日隨機(jī)選擇60 棵落葉松，在離地30 cm 處的樹干上，用經(jīng)滅菌的直徑6 mm 的軟木塞打孔器打孔至木質(zhì)部，用無(wú)菌牙簽將菌苔接入接種孔，然后蓋上樹皮，用封口膜纏繞，并用膠帶固定。以2% MEA 培養(yǎng)基作為接種對(duì)照。每棵樹上設(shè)1 個(gè)接種點(diǎn)，每個(gè)處理各設(shè)5 次重復(fù)。

1.2.2 接種發(fā)病調(diào)查 接種60 d 后，撕開接種點(diǎn)的膠帶和封口膜，用壁紙刀刮去接種點(diǎn)周圍病斑區(qū)域的外樹皮，測(cè)量病斑的長(zhǎng)和寬，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2.3 病原菌的再次分離 測(cè)量病斑大小后，每個(gè)處理隨機(jī)選擇3 個(gè)重復(fù)，在接種植株病健交界處取約1 cm2樣品放至15 mL 無(wú)菌離心管并帶回實(shí)驗(yàn)室，于-4 ℃冰箱保存。次日，樣品表面經(jīng)2%次氯酸鈉消毒1 min，然后用無(wú)菌水沖洗3 次，經(jīng)無(wú)菌濾紙吸去表面水分后取約1 mm2組織碎片放置在2% MEA 培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)菌落形態(tài)學(xué)和核酸β-微管蛋白（BT）基因片段序列比較鑒定是否為原始接種的長(zhǎng)喙殼菌株。

1.2.4 單萜類物質(zhì)測(cè)定 對(duì)MJG55 （E.fujiensis）和TRL63（E.laricicola）菌株和對(duì)照接種1、7、14、30 和60 d 后的5 棵落葉松進(jìn)行單萜類物質(zhì)測(cè)定，以評(píng)估寄主防御反應(yīng)強(qiáng)弱。用聚乙烯薄膜（48 cm × 60 cm，雷諾公司，美國(guó)）包裹接種點(diǎn)周圍樹干，用特氟龍管將含有100 mg Porapak-Q 吸附劑（默克公司，德國(guó)）的玻璃管連接在小型真空泵上形成閉環(huán)動(dòng)態(tài)頂空采樣系統(tǒng)，以500 mL·min-1的流速持續(xù)1 h 收集寄主揮發(fā)性物質(zhì)。將含有揮發(fā)物的玻璃管兩端用錫紙包裹并纏繞封口膜，放入裝有干冰的保溫箱并帶回實(shí)驗(yàn)室。用2 mL 色譜級(jí)正己烷洗脫寄主揮發(fā)物，用溫和的氮?dú)鈱悠窛饪s至50 μL，置于-20 ℃冰箱保存直至氣相色譜檢測(cè)。氣相色譜分析方法同Liu 等人描述[18]。將樣品放置在配有火焰離子檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器的氣相色譜儀（GC-FID，安捷倫，美國(guó)）上，使用口徑0.25 mm × 0.2 μm，30 m 長(zhǎng)的HP-5 色譜柱進(jìn)行分析，每次進(jìn)樣1 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Rajtar 等[19]的方法，計(jì)算接種點(diǎn)病斑面積（長(zhǎng) × 寬）。單萜類化合物釋放速率根據(jù)處理組和健康組的差值(Δ)進(jìn)行分析。使用IBM SPSS Statistics19 針對(duì)不同菌株產(chǎn)生的病斑、MJG55 和TRL63 菌株處理的落葉松在同一時(shí)間產(chǎn)生的單萜類化合物釋放速率、MJG55 或TRL63 菌株處理在不同時(shí)間產(chǎn)生的單萜類化合物釋放速率，進(jìn)行單因素方差分析（LSD test，α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種不同菌株后落葉松發(fā)病情況

接種兩個(gè)月后的落葉松沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的病害癥狀和枯萎現(xiàn)象。剝開外層樹皮，不同長(zhǎng)喙殼菌株接種落葉松后產(chǎn)生的褐色至黑色壞死病斑如圖1，病斑面積大小見圖2。比較發(fā)現(xiàn)，E.laricicola的2 個(gè)菌株（TRL63 和KBLK9）產(chǎn)生的病斑最大，面積分別為3.51 ± 0.18 cm2和2.89 ± 0.19 cm2。單因素方差分析結(jié)果顯示E.laricicola產(chǎn)生的病斑顯著大于其他處理（圖2）。E.fujiensis的2 個(gè)菌株（MJG55 和MJG29）、O.hongxingense的2 個(gè)菌株（HXS70 和HXS72）、O.peniculi的GH77 菌株和O.xinganense的CFCC52680 菌株產(chǎn)生的病斑顯著大于對(duì)照處理（1.28 ± 0.15 cm2）。其余菌株接種產(chǎn)生的病斑與對(duì)照無(wú)差異，且接種點(diǎn)中間未呈現(xiàn)壞死狀態(tài)（圖2）。

圖1 落葉松接種長(zhǎng)喙殼真菌后產(chǎn)生的病斑Fig. 1 The lesions produced on larch after inoculation with ophiostomatoid fungi

圖2 落葉松接種長(zhǎng)喙殼真菌后產(chǎn)生的病斑大小Fig. 2 Size of lesions produced on larch inoculated with ophiostomatoid fungi

2.2 菌株接種后病菌再分離

對(duì)人工接種產(chǎn)生病斑的病菌再分離和鑒定，得到每個(gè)菌株處理的3 個(gè)隨機(jī)病變樣本平均再分離率為83.3%，證實(shí)了落葉松接種點(diǎn)處產(chǎn)生的壞死病斑是由原始接種的長(zhǎng)喙殼真菌引起。

2.3 萜類測(cè)定結(jié)果

為了研究落葉松對(duì)長(zhǎng)喙殼真菌的抗性反應(yīng)，針對(duì)接種了E.fujiensis（MJG55）和E.laricicola（TRL63）菌株的落葉松，在接種后的1、7、14、30 和60 d 分別進(jìn)行了單萜類物質(zhì)測(cè)定。共檢測(cè)到(-)-α-pinene、camphene、β-pinene、myrcene、3-carene 和(-)-limonene 6 種單萜物質(zhì)，結(jié)果如圖3 所示?？傮w而言，TRL63 處理的單萜釋放速率最高，MJG55 處理次之，這兩種處理與對(duì)照均存在顯著差異。不同處理后單萜類物質(zhì)釋放速率隨時(shí)間的變化規(guī)律略有不同，TRL63 處理中各萜類物質(zhì)呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)；MJG55 和MEA 處理的myrcene 也呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，(-)-α-pinene、camphene 和3-carene 呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。

圖3 不同處理下落葉松的單萜釋放速率Fig. 3 Release rates of six monoterpenes by larch in different treatments

3 討論

真菌致病性是指真菌侵染活體植物組織后在其體內(nèi)存活和發(fā)育并引起病害的能力[20-21]。致病性用毒力來(lái)量化，毒力是通過(guò)測(cè)量寄主可視化癥狀的發(fā)展來(lái)確定的，包括病斑長(zhǎng)度、邊材干燥和藍(lán)變面積、樹脂反應(yīng)以及樹木的死亡率[22-23]。病斑指寄主植物感染點(diǎn)周圍韌皮部組織產(chǎn)生的變暗、凸起或輕微凹陷以及壞死等現(xiàn)象，用于評(píng)估真菌對(duì)寄主樹的影響[24]。長(zhǎng)喙殼真菌的致病性一般是通過(guò)在成年樹或幼苗上人工接種真菌來(lái)評(píng)估[6,25-26]。盡管在成年樹上接種更接近小蠹蟲高密度攻擊后的自然接種，但幼苗接種是控制實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件的另一選擇[22,24]。此外，在接種量相當(dāng)?shù)那闆r下，幼苗接種更適合于確定小蠹蟲伴生長(zhǎng)喙殼真菌的毒力[22]。因此，本研究選用5 年生的落葉松苗木驗(yàn)證12 種落葉松八齒小蠹伴生長(zhǎng)喙殼真菌的致病性。結(jié)果表明，5 種真菌對(duì)長(zhǎng)白落葉松表現(xiàn)出不同程度的致病力，E.laricicola致病力最強(qiáng)，E.fujiensis和O.hongxingense次之，O.peniculi和O.xinganense較弱（圖2），表明這幾種真菌對(duì)落葉松存在潛在危害風(fēng)險(xiǎn)。其余7 種Ophiostoma真菌在接種點(diǎn)處形成的韌皮部變色與對(duì)照無(wú)差異，未表現(xiàn)出明顯致病性。

本研究從亞洲落葉松八齒小蠹蟲體上分離到E.laricicola真菌，與之前關(guān)于E.laricicola和歐洲落葉松八齒小蠹（Ips cembrae）特異性伴生的認(rèn)識(shí)存在差異[27]，這可能是小蠹蟲和真菌在擴(kuò)散中形成了新的伴生關(guān)系。Redfern 等人最早發(fā)現(xiàn)I.cembrae與E.laricicola存在伴生關(guān)系，且由這種伴生關(guān)系導(dǎo)致的復(fù)合侵染使落葉松發(fā)生頂梢枯死[28]。E.laricicola能在歐洲赤松韌皮部形成壞死病斑，誘導(dǎo)木質(zhì)素和樹脂的積累，同時(shí)減少歐洲赤松細(xì)胞壁游離原花青素、低分子量碳水化合物和非木質(zhì)素成分的含量，表明其能抑制寄主傷口反應(yīng)早期階段的木質(zhì)化，從而延緩寄主對(duì)于損傷的自我修復(fù)[29]。本研究中，E.laricicola接種在落葉松韌皮部形成的壞死病斑最大，其誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生的萜類物質(zhì)呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，表明該菌具有較強(qiáng)致病力。因此，E.laricicola與亞洲落葉松八齒小蠹形成的伴生關(guān)系可能更有利于小蠹蟲的入侵，對(duì)落葉松造成較強(qiáng)的破壞力。

以前有研究表明，在人工接種條件下E.fujiensis能使30 年生的健康日本落葉松死亡[5]。該菌對(duì)長(zhǎng)白落葉松也表現(xiàn)出一定致病力，并能引起長(zhǎng)白落葉松的防御反應(yīng)[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，E.fujiensis菌株接種后落葉松韌皮部形成的壞死病斑顯著大于對(duì)照處理，但與E.laricicola相比病斑較小，在5 個(gè)調(diào)查時(shí)間段內(nèi)大多數(shù)萜類物質(zhì)的變化也較小。這與致病力更強(qiáng)的真菌誘導(dǎo)宿主防御萜類物質(zhì)發(fā)生較大變化的結(jié)論一致[16,18,31]，說(shuō)明E.fujiensis菌株對(duì)長(zhǎng)白落葉松的致病力較弱。本文研究結(jié)果與Yamaoka[5]和周秀華等[30]的研究結(jié)果不同，可能與樹木的個(gè)體發(fā)育有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，與成年樹相比，幼樹具有更強(qiáng)的化學(xué)防御能力，在抵抗病原菌侵染時(shí)產(chǎn)生更強(qiáng)烈的抗性反應(yīng)[32-33]。因此，本研究在5 年生落葉松上設(shè)定的單一接種量有限，可能不足以造成嚴(yán)重影響，以后將考慮增加接種量。

長(zhǎng)喙殼真菌入侵寄主后，寄主體內(nèi)防御性萜類物質(zhì)釋放增加，這些萜類化合物影響真菌的生長(zhǎng)，同時(shí)真菌也具有解毒能力，甚至利用寄主產(chǎn)生的防御性化合物。Fang 等人研究發(fā)現(xiàn)，α-pinene、limonene 和carene 等8 種單萜類物質(zhì)會(huì)抑制E.fujiensis的生長(zhǎng)[16]。Cale 等人發(fā)現(xiàn)，在額外添加α-pinene 的培養(yǎng)基上山松大小蠹伴生菌Grosmannia clavigera生長(zhǎng)也受抑制[31]；而limonene 的存在會(huì)促進(jìn)G.clavigera和Ophiostoma ips真菌的生長(zhǎng)。此外，不同濃度的萜類對(duì)真菌生長(zhǎng)的影響也存在差異，如低濃度的myrcene 能促進(jìn)O.ips的生長(zhǎng)，而高濃度myrcene 對(duì)O.ips生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)影響[30]。Liu 等人認(rèn)為長(zhǎng)喙殼真菌能夠利用寄主揮發(fā)物中的氮能來(lái)促進(jìn)真菌的生長(zhǎng)發(fā)育并合成小蠹蟲生長(zhǎng)發(fā)育所必需的麥角甾醇[34]。小蠹蟲和長(zhǎng)喙殼真菌復(fù)合侵染對(duì)寄主造成的危害遠(yuǎn)高于小蠹蟲自身鉆蛀樹木造成的危害[35]，因此，研究小蠹蟲和伴生真菌的內(nèi)在聯(lián)系以及伴生真菌對(duì)寄主防御的影響，對(duì)于防治小蠹蟲暴發(fā)危害具有重要理論指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)人工接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小蠹蟲伴生長(zhǎng)喙殼真菌的不同菌株在落葉松接種點(diǎn)處產(chǎn)生的病斑大小存在差異，有5 種長(zhǎng)喙殼真菌對(duì)長(zhǎng)白落葉松表現(xiàn)出不同程度的致病力，E.laricicola菌株致病力最強(qiáng)，E.fujiensis和O.hongxingense次之，O.peniculi和O.xinganense較弱。Endoconidiophora真菌能夠誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生防御反應(yīng)，釋放的萜類物質(zhì)增加，且在E.laricicola接種14 d 左右達(dá)到峰值。長(zhǎng)喙殼真菌被小蠹蟲攜帶至新的寄主植物上，在小蠹蟲坑道周圍產(chǎn)生的壞死病斑與寄主植物的死亡存在密切關(guān)系。本研究通過(guò)人工接種長(zhǎng)喙殼真菌后測(cè)量病斑大小來(lái)評(píng)估真菌致病力，對(duì)于優(yōu)化小蠹蟲綜合治理策略提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。