腺苷A2B受體激活減輕膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷及肺微血管內(nèi)皮炎癥損傷

王慧霞, 安友仲

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由肺炎、非肺部感染、創(chuàng)傷、輸血、燒傷、誤吸或休克等危險(xiǎn)因素誘發(fā),導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮和上皮通透性增加而引起的急性、彌漫性、炎癥性肺損傷[1]。膿毒癥是并發(fā)ARDS病因之一,同時(shí)若膿毒癥患者繼發(fā)ARDS可導(dǎo)致病死率顯著增高[2]。目前,膿毒癥并發(fā)ARDS發(fā)生機(jī)制尚未明晰,且具有高度異質(zhì)性,其中肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷及內(nèi)皮屏障通透性改變是其病理生理機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)[3-4]。腺苷受體(adenosine receptor,AR),包括A1、A2A、A2B和A3受體,以組織依賴性方式在多種組織和細(xì)胞中表達(dá),在免疫系統(tǒng)功能障礙、情感障礙及炎癥等方面具有潛在藥理學(xué)作用[5-6]。肺內(nèi)最主要的AR是腺苷A2B受體(adenosine A2Breceptor,A2BR),在微血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)[7],親和力低,在缺血缺氧及炎癥損傷時(shí)可被激活。但A2BR激活對(duì)急性肺損傷(acute lung injury,ALI)及肺微血管內(nèi)皮損傷的影響仍有待進(jìn)一步探討。本研究建立盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and perforation,CLP)致膿毒癥引發(fā)的ALI動(dòng)物模型,在動(dòng)物體內(nèi)水平探索A2BR對(duì)ALI的影響。另通過(guò)TNF-α處理原代培養(yǎng)的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonary microvascular endothelial cells,HPMECs),在體外從細(xì)胞水平研究A2BR激活對(duì)ALI肺微血管內(nèi)皮的影響及其可能的作用機(jī)制,為尋找新的潛在治療靶點(diǎn)策略奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠24只(6～8周齡,體重200～220 g),購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度設(shè)為(22±2)℃,自然光暗周期,實(shí)驗(yàn)期間自由飲食。

1.2細(xì)胞及主要試劑 原代培養(yǎng)HPMECs及內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(endothelial cell medium,ECM)購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司;蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色液購(gòu)自昆明云科生物技術(shù)有限公司;Transwell購(gòu)自美國(guó)Corning公司;腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司;放射性免疫沉淀分析(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、二辛可定酸法(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司;兔抗IL-1β多克隆抗體、小鼠抗人細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)抗體、兔抗人促血管生成素(angiopoietin,ANGPT)抗體、兔抗人血管內(nèi)皮鈣黏連蛋白(vascular endothelial-cadherin,VE-cadherin)抗體、小鼠抗-3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Recombinant Human TNF-α購(gòu)自美國(guó)PEPROTECH公司;A2BR靶向激動(dòng)劑BAY60-6583、A2BR抑制劑PSB1115購(gòu)自美國(guó)ApexBio公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及模型制備 將24只SPF級(jí)SD雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(sham組)、ALI模型組(ALI組)、A2BR激動(dòng)劑BAY60-6583干預(yù)組(ALI+BAY組)和A2BR抑制劑PSB1115干預(yù)組(ALI+PSB組),每組6只。采用CLP法建立膿毒癥致ALI大鼠模型[8]:大鼠麻醉后開腹,尋找盲腸末端,用無(wú)菌4號(hào)線進(jìn)行結(jié)扎,14G針頭貫穿盲腸,擠出糞便及腸內(nèi)容物后回納腹腔,關(guān)腹。sham組僅進(jìn)行開腹和關(guān)腹操作。ALI+BAY組及ALI+PSB組在術(shù)前30 min分別腹腔內(nèi)注射100 μL生理鹽水+2 mg/kg BAY60-6583、100 μL生理鹽水+10 mg/kg PSB1115,其余各組經(jīng)腹腔給予等量生理鹽水,24 h后過(guò)量麻醉處死。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn),并經(jīng)北京大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(批號(hào):2019PHC014)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)方法 HPMECs快速解凍后,使用添加了5%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑、100 IU/mL青霉素、100 IU/mL鏈霉素的ECM培養(yǎng),培養(yǎng)箱環(huán)境條件設(shè)置為95%空氣、5% CO2、37 ℃,及時(shí)更換培養(yǎng)基以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)需要,待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行消化傳代,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后取3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。藥物干預(yù)前血清饑餓24 h,并予1 kU/L腺苷脫氨酶預(yù)處理,以去除內(nèi)源性腺苷,除外內(nèi)源性激動(dòng)腺苷受體的作用。將細(xì)胞分為6組:對(duì)照組、TNF-α組、BAY組、PSB組、BAY+TNF-α組和PSB+TNF-α組。BAY+TNF-α組提前1 h加入1 μmol/L的BAY60-6583預(yù)處理,PSB+TNF-α組提前1 h加入1 μmol/L的PSB1115預(yù)處理,TNF-α組、BAY+TNF-α組、PSB+TNF-α組加入TNF-α 100 ng/mL刺激24 h,收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.3.3 肺組織HE染色 大鼠過(guò)量麻醉處死,開胸取右上肺,置于中性甲醛中固定,脫水,石蠟包埋切片后行HE染色。光鏡下觀察肺組織病理改變并采用Smith法進(jìn)行評(píng)分。Smith法是對(duì)肺水腫、肺泡以及間質(zhì)炎癥、肺泡及間質(zhì)出血、肺不張和透明膜形成分別進(jìn)行0～4分半定量分析。無(wú)損傷為0分,病變范圍<25%為1分,25%≤病變范圍<50%為2分,50%≤病變范圍<75%為3分,病變范圍≥75%至滿視野為4分,總肺損傷評(píng)分為上述各項(xiàng)之和,每只動(dòng)物觀察10個(gè)高倍鏡視野,取其平均值。

1.3.4 肺濕/干質(zhì)量比值(wet/dry mass ratio,W/D)計(jì)算 大鼠過(guò)量麻醉處死,開胸取右下肺進(jìn)行稱量,此時(shí)右下肺重量記為濕重。將各組右下肺放入95 ℃烤箱連續(xù)烘干48 h,然后取出稱量,該重量為肺干重。

1.3.5 肺水清除率(alveolar fluid clearance,AFC)測(cè)定 大鼠過(guò)量麻醉處死,氣管切開進(jìn)行氣管插管,結(jié)扎右主支氣管,將氣管、肺和心臟整體取出,左肺用于測(cè)定AFC。將含有5%白蛋白和0.15 mg/mL Evans Blue 37 ℃提前預(yù)熱的1.5 mL生理鹽水通過(guò)氣管插管注入左肺,并給予1 mL氧氣以保證灌注液到達(dá)肺臟,將左肺用保鮮膜包裹后置于37 ℃水浴環(huán)境,并維持氣道壓在8 cmH2O,持續(xù)給予100%氧氣,1 h后吸取左肺肺泡內(nèi)液體,并于分光光度計(jì)波長(zhǎng)620 nm處測(cè)定Evans Blue標(biāo)記的白蛋白濃度并計(jì)算AFC。

1.3.6 肺組織炎癥因子測(cè)定 取肺組織勻漿上清液,按照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟測(cè)定TNF-α、IL-6和IL-1β含量。

1.3.7 異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-白蛋白(albumin)法檢測(cè)HPMECs單層通透性

HPMECs以2×105cells/mL密度接種于Transwell(孔徑3.0 μm,直徑24 mm)上室,相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及融合程度。待細(xì)胞完全融合48 h后進(jìn)行同步化,各組在上室加入相應(yīng)藥物,在上室加入FITC-albumin,下室加入等摩爾、無(wú)FITC標(biāo)記的albumin。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱避光孵育1 h后,分別從上室、下室提取0.3 mL和1.2 mL樣品。熒光分光光度計(jì)檢測(cè)樣品熒光能量值(吸收波長(zhǎng)493 nm,發(fā)射波長(zhǎng)528 nm)。制作FITC-albumin標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到上室、下室FITC-albumin濃度,并計(jì)算HPMECs通透系數(shù)。

1.3.8 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集處理后的HPMECs,分別加入預(yù)冷RIPA裂解液,冰上孵育15 min后收集裂解組織或細(xì)胞液體,4 ℃、12 000 r/min離心20 min,取上清液即為總蛋白裂解液。按照BCA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè),經(jīng)加溫處理后將蛋白樣本與蛋白上樣緩沖液進(jìn)行混合,使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn),通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上,用含5%脫脂奶粉的TBST溶液在室溫下封閉2 h后切膜,分別加入IL-1β、ICAM-1、ANGPT、VE-cadherin和GAPDH一抗,4 ℃孵育過(guò)夜。次日以TBST溶液洗膜3次,10 min/次,二抗使用HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG溶液,室溫孵育2 h,TBST再次洗膜3次,10 min/次,加入化學(xué)發(fā)光顯色。掃描并通過(guò)Image J軟件分析其灰度值,以目標(biāo)條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度比值作為目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1四組大鼠肺組織病理學(xué)改變及Smith評(píng)分比較

光鏡下,sham組肺組織未見明顯充血及出血,ALI組肺泡結(jié)構(gòu)塌陷破壞,可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和不同程度的肺間質(zhì)、肺泡水腫、出血,見圖1。ALI組Smith評(píng)分顯著高于sham組(P<0.05)。ALI+BAY組Smith評(píng)分顯著低于ALI組(P<0.05)。ALI+PSB組Smith評(píng)分顯著高于ALI組(P<0.05)。見表1。

表1 四組大鼠Smith評(píng)分、肺W/D、AFC比較

?sham組肺泡結(jié)構(gòu)完整且間隔正常,肺泡腔及間質(zhì)未見明顯炎癥細(xì)胞滲出及水腫;?ALI組肺泡壁明顯增厚伴大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),組織間隙可見出血,肺泡結(jié)構(gòu)塌陷破壞,肺泡腔內(nèi)可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和液體潴留;?ALI+BAY組肺泡壁厚度明顯減少,且中性粒細(xì)胞也隨之減少,組織間隙可見少量出血,肺泡及肺間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);?ALI+PSB組肺泡壁明顯增厚伴大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡腔嚴(yán)重縮窄,組織間隙可見明顯出血,一些肺泡內(nèi)可見疑似透明膜形成

2.2四組大鼠肺W/D、AFC比較 與sham組比較,ALI組肺W/D顯著升高,AFC顯著降低(P<0.05)。與ALI組比較,ALI+BAY組肺W/D顯著降低,AFC顯著升高(P<0.05);ALI+PSB組肺W/D顯著升高,AFC顯著降低(P<0.05),見表1。

2.3四組大鼠肺組織炎癥因子水平比較 與sham組比較,ALI組肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著升高(P<0.05)。與ALI組比較,ALI+BAY組肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著降低(P<0.05),而ALI+PSB組肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著升高(P<0.05),見圖2。

與sham組比較,*P<0.05;與ALI組比較,#P<0.05

2.4各組HPMECs單層通透性比較 與對(duì)照組比較,TNF-α組HPMECs單層通透性顯著增加(P<0.05)。與TNF-α組比較,BAY+TNF-α單層通透性顯著降低,PSB+TNF-α組單層通透性顯著增加(P<0.05)。BAY60-6583和PSB1115本身對(duì)HPMECs通透性無(wú)顯著影響。見圖3。

與對(duì)照組比較,*P<0.05;與TNF-α組比較,#P<0.05

2.5各組HPMECs的IL-1β、ICAM-1、ANGPT以及VE-cadherin表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較,TNF-α組IL-1β、ICAM-1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與TNF-α組比較,BAY+TNF-α組IL-1β、ICAM-1表達(dá)水平顯著降低,而PSB+TNF-α組IL-1β、ICAM-1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。BAY60-6583和PSB1115本身對(duì)IL-1β、ICAM-1表達(dá)無(wú)顯著影響。與對(duì)照組比較,TNF-α組ANGPT、VE-cadherin表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),與TNF-α組比較,BAY+TNF-α組ANGPT、VE-cadherin表達(dá)水平顯著升高,而PSB+TNF-α組ANGPT、VE-cadherin表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。BAY60-6583和PSB1115本身對(duì)ANGPT、VE-cadherin表達(dá)水平無(wú)顯著影響,見圖4。

與對(duì)照組比較,*P<0.05;與TNF-α組比較,#P<0.05

3 討論

3.1ARDS是危重癥患者常見疾病及死亡的主要原因之一,研究其發(fā)病機(jī)制及治療措施的迫切性高。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子(如TNF-α)刺激肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞A2BR表達(dá)升高,且在一定的時(shí)間濃度范圍內(nèi)具有時(shí)程及劑量依賴性[9],但A2BR對(duì)ARDS病理生理過(guò)程的影響仍有待進(jìn)一步探索。本研究探討了A2BR活化對(duì)CLP膿毒癥大鼠ALI的影響,并在體外細(xì)胞水平進(jìn)一步證實(shí)A2BR活化減輕TNF-α誘導(dǎo)的HPMECs炎癥損傷,保護(hù)肺血管屏障作用:(1)A2BR活化可改善膿毒癥ALI動(dòng)物模型肺組織損傷情況,減輕肺水腫,提高AFC,減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放。(2)A2BR活化減少TNF-α刺激的原代培養(yǎng)HPMECs模型IL-1β分泌及ICAM-1表達(dá),減輕肺血管內(nèi)皮炎癥損傷。(3)A2BR活化增加細(xì)胞間VE-cadherin表達(dá),降低HPMECs的單層通透性;增加ANGPT表達(dá),促進(jìn)血管生成及受損內(nèi)皮修復(fù),從而對(duì)肺血管屏障起保護(hù)作用。

3.2作為異質(zhì)性很強(qiáng)的臨床綜合征,基于患者臨床和生物學(xué)特征進(jìn)行ARDS亞型分類有助于開展個(gè)體化治療。在基礎(chǔ)研究中模擬ARDS/ALI的動(dòng)物模型建立方法多樣,膿毒癥相關(guān)ALI是膿毒癥并發(fā)器官損傷的常見并發(fā)癥,因此本研究動(dòng)物模型采用膿毒癥制模的“金標(biāo)準(zhǔn)”——CLP法建立膿毒癥大鼠致ALI模型,模擬了人體膿毒癥合并ARDS的病理生理機(jī)制,大量炎癥介質(zhì)作用于基底膜血管內(nèi)皮及肺上皮細(xì)胞,使其肺基底膜屏障損害,大量的高蛋白液體滲出至肺泡,出現(xiàn)不同程度的肺水腫,后期甚至出現(xiàn)肺纖維化,使肺順應(yīng)性下降,肺的氣體交換功能下降,最終導(dǎo)致急性呼吸衰竭[10]。本研究ALI組大鼠肺組織切片可見肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡間及肺泡內(nèi)可見液體滲出,同時(shí)肺W/D明顯增加,AFC下降,同時(shí)肺組織內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子水平升高,證明膿毒癥致ALI動(dòng)物模型建立成功。

3.3腺苷A2BR是一種G蛋白偶聯(lián)受體,因其對(duì)內(nèi)源性配體的親和力較低,在組織損傷(例如缺血和炎癥)時(shí)產(chǎn)生更高濃度的腺苷從而被激活[11-12]。A2BR在炎癥反應(yīng)中的功能尚存在爭(zhēng)議,如在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的慢性肺損傷中肺部炎癥和纖維化增加,而A2BR拮抗劑可減弱上述現(xiàn)象[13]。另有研究發(fā)現(xiàn)A2BR可以通過(guò)抑制急性炎癥反應(yīng)減少膿毒癥死亡[14]?？赡艿慕忉屖?A2BR對(duì)慢性疾病中腺苷水平的緩慢升高、急性炎癥中腺苷水平的快速升高的反應(yīng)不同[15]。有研究報(bào)道外源性netrin-1可通過(guò)A2BR調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),從而對(duì)ALI產(chǎn)生強(qiáng)大的保護(hù)作用[16]。因此,腺苷A2BR是ALI治療的重要靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)A2BR活化可改善膿毒癥所致ALI大鼠肺組織病理?yè)p傷,減輕肺水腫,提高AFC,降低TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子水平,而A2BR抑制劑可逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng),從動(dòng)物層面明確在體內(nèi)A2BR激活對(duì)膿毒癥ALI起保護(hù)作用。

3.4肺內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷引起的內(nèi)皮通透性增加是ALI的主要病理特征之一[17]。急性感染過(guò)程中,TNF-α與內(nèi)皮細(xì)胞表面的TNF-α受體結(jié)合,激活內(nèi)皮信號(hào)通路并分泌炎癥介質(zhì)[18],這些介質(zhì)誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生、趨化因子和黏附分子分泌、抗炎介質(zhì)減少以及白細(xì)胞遷移。IL-6可以將白細(xì)胞募集到肺組織中,而IL-1β可以通過(guò)誘導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞加速肺損傷的過(guò)程[19-20]。除了炎癥細(xì)胞因子水平升高外,在TNF-α刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中還觀察到ICAM-1、血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)呈高表達(dá)[21]。本研究在體外實(shí)驗(yàn)中采用TNF-α刺激原代HPMECs建立細(xì)胞損傷模型,為人源細(xì)胞,與動(dòng)物細(xì)胞模型相比,更能模擬人體病理生理過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)A2BR活化可減少炎癥因子IL-1β分泌,下調(diào)ICAM-1表達(dá)水平,從而減輕肺血管內(nèi)皮炎癥損傷。

3.5VE-cadherin是黏附連接的主要成員[22]。黏附連接存在于內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜之間,作為細(xì)胞通透性的重要調(diào)節(jié)因子,調(diào)節(jié)白細(xì)胞跨膜遷移和肺水腫[23]。既往有研究發(fā)現(xiàn)在ALI動(dòng)物模型中,組織VE-cadherin表達(dá)下調(diào)[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)損傷HPMECs單層通透性增加,VE-cadherin表達(dá)水平下降,而A2BR活化可逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)。但A2BR活化是否通過(guò)增加VE-cadherin表達(dá)來(lái)降低細(xì)胞通透性尚不清楚。有研究表明環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的下調(diào)可降低細(xì)胞間連接蛋白的表達(dá),從而增加血管內(nèi)皮通透性[26]。據(jù)此猜測(cè),A2BR可能通過(guò)PKA-cAMP途徑增加內(nèi)皮及內(nèi)皮與基底膜黏附,從而降低HPMECs通透性,對(duì)肺內(nèi)膜屏障起保護(hù)作用,此猜測(cè)有待進(jìn)一步探索研究。

3.6本研究發(fā)現(xiàn),HPMECs受損傷刺激下ANGPT表達(dá)水平下降,但A2BR活化可上調(diào)ANGPT表達(dá)水平。ANGPT是內(nèi)皮細(xì)胞特異性酪氨酸激酶(endothelial-specific receptor tyrosine kinase,Tie-2)的配體,與血管內(nèi)皮細(xì)胞的受體結(jié)合,誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)受體結(jié)構(gòu)域的酪氨酸磷酸化,可促進(jìn)血管成熟及穩(wěn)定。有研究發(fā)現(xiàn)ANGPT不直接促進(jìn)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng),而是對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有趨化作用,并參與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附。同時(shí),ANGPT可充當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡存活因子,抑制培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[27]。在TNF-α誘導(dǎo)的HPMECs損傷中,A2BR活化上調(diào)ANGPT表達(dá),可能通過(guò)多種途徑起到促血管生成作用,有助于內(nèi)皮屏障的修復(fù)。有研究發(fā)現(xiàn)A2BR活化可經(jīng)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)依賴和非HIF-1α依賴途徑誘導(dǎo)促血管生成因子的生成[28],但內(nèi)皮A2BR所介導(dǎo)的促血管生成效應(yīng)的機(jī)制仍有待組織研究和動(dòng)物研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述,本研究采用經(jīng)CLP誘導(dǎo)大鼠膿毒癥致ALI動(dòng)物模型,從肺組織病理評(píng)分下降、肺水腫減輕、炎癥因子釋放減少等方面明確A2BR激活在體內(nèi)可減弱膿毒癥誘導(dǎo)的ALI。同時(shí),在體外采用TNF-α刺激原代培養(yǎng)的HPMECs構(gòu)建細(xì)胞損傷模型,結(jié)果顯示A2BR活化可下調(diào)IL-1β、ICAM-1表達(dá),減輕肺血管內(nèi)皮炎癥損傷,并通過(guò)增加細(xì)胞間黏附連接降低HPMECs的單層通透性及促進(jìn)血管生成等方式促進(jìn)受損內(nèi)皮修復(fù),從而對(duì)肺血管屏障起保護(hù)作用。盡管仍需要更多實(shí)驗(yàn)去探索A2BR對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)ALI保護(hù)作用的具體機(jī)制,但其對(duì)肺微血管內(nèi)皮炎癥損傷的抑制作用及肺血管屏障的保護(hù)作用提供了ALl潛在治療的新靶點(diǎn)。