發(fā)酵食品中具有潛在降尿酸功能乳酸菌的篩選及特性分析

李杰，李霜，張鵬霞，祝麗玲，周健，孫雪微，宋麗新

（1.佳木斯大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院黑龍江省痛風(fēng)研究重點實驗室，黑龍江 佳木斯 154000；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 急診科，黑龍江 佳木斯 154000；3.佳木斯大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 黑龍江省微生態(tài)-免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點實驗室，黑龍江 佳木斯 154000；4.包頭市疾病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 包頭 014030）

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人們生活方式的改變，高蛋白和高嘌呤食物的攝入量不斷增加，致使世界范圍內(nèi)高尿酸血癥的人群患病率逐年攀升[1]。高尿酸血癥是一種因嘌呤代謝紊亂和尿酸形成與分泌失衡引發(fā)的代謝性疾病，也是導(dǎo)致痛風(fēng)、動脈硬化和心血管等疾病發(fā)生的重要危險因素之一[2-3]。目前，針對該病的治療方法主要包括飲食干預(yù)和藥物治療，但由于人群飲食控制難度較大，且藥物所產(chǎn)生的副作用偏多[4-5]，因此，尋找溫和、無毒副作用的方式有效降低高尿酸血癥患者的血清尿酸水平已成為目前該領(lǐng)域研究的熱點問題。

近幾年相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)益生菌對高尿酸血癥和痛風(fēng)具有積極的調(diào)控作用[6]，乳酸菌作為一類重要的益生菌其對高尿酸血癥的作用功效及途徑被陸續(xù)報道。麻菊美等[7]從泡菜中分離篩選出一株能夠高效降解嘌呤核苷的彎曲乳桿菌，該菌株對肌苷和鳥苷的降解率均在89% 以上，且在人工胃腸液中表現(xiàn)出一定的耐受性，具有良好的益生特性。Wu 等[8]從漿水中分離了一株發(fā)酵乳桿菌JL-3，發(fā)現(xiàn)該菌株可以有效降低小鼠血清中尿酸水平，并且對小鼠體內(nèi)因高尿酸血癥誘導(dǎo)所引發(fā)的氧化脅迫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)以及腸道菌群失衡現(xiàn)象等進(jìn)行調(diào)節(jié)。除此之外，García-Arroyo 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌KB27 和KB79 可以降低高尿酸血癥大鼠血清中尿酸水平，有效改善其腎部損傷以及產(chǎn)生的高血壓癥狀，對高尿酸血癥起到一定預(yù)防作用。目前，有關(guān)乳酸菌在高尿酸血癥中的應(yīng)用研究尚不全面，且迄今所報道的對高尿酸血癥有益生作用的乳酸菌種仍相對較少，更多研究亟待深入。

本研究利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[10-11]測定乳酸菌核苷降解能力，通過分析菌株對黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）的抑制作用、在胃腸道中的轉(zhuǎn)運能力、耐酸和耐膽鹽能力以及對抗生素的敏感性等，初步判斷菌株益生特性，選擇出對高尿酸血癥具有潛在預(yù)防和輔助治療作用的乳酸菌，以期為今后利用益生菌對高尿酸血癥進(jìn)行靶向治療提供理論基礎(chǔ)和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來源

本試驗所用的30 株菌株分離自東北傳統(tǒng)發(fā)酵大醬以及朝鮮族農(nóng)家自制泡菜中。

1.1.2 藥品及試劑

MRS 培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；肌苷標(biāo)準(zhǔn)品、鳥苷標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）、黃嘌呤氧化酶活性檢測試劑盒、黃嘌呤氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）、胃蛋白酶（≥250 U/mg）、胰蛋白酶（250 N.FU/mg）、膽鹽：北京索萊寶科技有限公司；藥敏紙片：常德比克曼生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（LC-20A）：日本島津公司；高速冷凍低溫離心機(jī)（multifuge X1R）、恒溫振蕩培養(yǎng)箱（BPH-9272）：美國Thermo Fisher 公司；恒溫振蕩水浴裝置（Julabo SW22）：優(yōu)萊博技術(shù)（北京）有限公司；可見分光光度計（VIS-7220N）：北京瑞利分析儀器公司；基質(zhì)輔助電離解析飛行時間質(zhì)譜儀（MBT smart）：布魯克（北京）科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的分離與純化

將25 mL 4 ℃保存的泡菜湯汁加入225 mL 無菌生理鹽水中，并將其進(jìn)行10 倍濃度梯度稀釋（10-1～10-7），吸取100 μL 的樣品稀釋液涂布于MRS 瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃靜置培養(yǎng)48 h 后，根據(jù)乳酸菌菌落顏色及形態(tài)學(xué)特征挑取單菌落，利用平板劃線法進(jìn)行分離和純化。

1.3.2 肌苷和鳥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將16.90 mg 肌苷和22.88 mg 鳥苷標(biāo)準(zhǔn)品溶于1 mol/L K3PO4溶液中，配制成濃度為1.26 mmol/L 的肌苷-鳥苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0.25、0.5、1.0、2.5 mL和5 mL 肌苷-鳥苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1 mol/L K3PO4溶液定容至5 mL，混勻。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)制備肌苷-鳥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 降解肌苷和鳥苷乳酸菌的篩選

參照Tsuboi 等[12]的方法篩選能夠降解核苷的乳酸菌：將經(jīng)充分活化的菌液以體積分?jǐn)?shù)為1% 的接種量接種到新鮮的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h后，取2 mL 培養(yǎng)液，于4 ℃、4 000 r/min 條件下離心10 min，收集菌體，并用無菌的0.9% NaCl 溶液清洗2 次后，重懸于750 μL 肌苷和鳥苷磷酸鹽反應(yīng)液中，重懸菌體后置于37 ℃、120 r/min 孵育1 h，于4 ℃、4 000 r/min 條件下離心10 min 后取上清液，按體積比9∶1 加入0.1 mol/L HClO4終止反應(yīng)。用微孔濾膜過濾上清液，用HPLC 法測定其中肌苷和鳥苷的含量。色譜條件為柱溫30 ℃、流速1 mL/min、測定波長260 nm。流動相組成為水∶色譜甲醇=95∶5（體積比）。

按公式（1）計算菌株對肌苷和鳥苷的降解率（J，%）。

式中：C0為母液質(zhì)量濃度，g/L；C1為殘留液質(zhì)量濃度，g/L。

1.3.4 乳酸菌對XOD 的抑制作用

將菌體培養(yǎng)液以5%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種于MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h 后，于4 ℃、10 000 r/min 離心10 min 收集菌體沉淀。用pH6.8 無菌磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗2～3 次并重懸沉淀，將菌濃度調(diào)整至1×109CFU/mL，在超聲條件（200 W、工作5 s 停5 s）下進(jìn)行10 min 的脈沖破碎，所得液體于10 000 r/min 離心10 min，取離心后的上清液得到細(xì)胞內(nèi)容物。利用XOD 活性檢測試劑盒對XOD 活性進(jìn)行測定。XOD 催化次黃嘌呤產(chǎn)生黃嘌呤和超氧陰離子，超氧陰離子與鹽酸羥胺反應(yīng)生成NO2-，NO2-在氨基苯磺酰胺和萘乙二胺鹽酸鹽的作用下，生成紫紅色的偶氮化合物，在530 nm 有特征吸收峰[13]，其生成量可反映XOD 活性大小。首先對XOD氧化酶活性（A，U/mg）進(jìn)行測定，之后將菌的細(xì)胞內(nèi)容物與酶液進(jìn)行孵育后測定XOD 氧化酶液的活性（B，U/mg）。各菌株對XOD 抑制率（X，%）按公式（2）進(jìn)行計算。

1.3.5 乳酸菌的鑒定

將篩選得到的菌體接種于MRS 液體培養(yǎng)基中活化24 h 后，提取菌體總基因組DNA，并利用通用引物對菌株16S rDNA 序列進(jìn)行擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因股份有限公司（北京）測序，將測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）進(jìn)行BLAST 比對分析，從而對菌株類別進(jìn)行鑒定。

1.3.6 乳酸菌對酸耐受性測定

將所篩選的菌株培養(yǎng)液以體積分?jǐn)?shù)為5%的接種量接種于pH 值為2.0、3.0 和4.0 的MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)4 h 后取樣進(jìn)行平板活菌計數(shù)和存活率計算。各菌株存活率（C，%）按公式（3）進(jìn)行計算。

式中：x為處理后活菌數(shù)，CFU/mL；y為對照組活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.7 乳酸菌對膽鹽耐受性測定

將所篩選的菌株培養(yǎng)液以體積分?jǐn)?shù)為5%的接種量接種于無膽鹽和含0.3% 膽鹽的MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)5 h，并分別于0、1、3、5 h 取樣進(jìn)行平板活菌計數(shù)和通過公式（3）計算存活率。

1.3.8 乳酸菌對人工模擬胃腸液耐受性測定

將3 mL 活化后的菌液于4 ℃、4 000 r/min 離心10 min，用0.85% 生理鹽水洗滌3 次后，重懸于3 mL人工胃液（pH3.0，3g/L 胃蛋白酶）中，37 ℃培養(yǎng)3 h。取處理3 h 后的菌液1 mL 轉(zhuǎn)移至9 mL 人工模擬腸液（pH6.8，1 g/L 胃蛋白酶、0.3%膽鹽）中，37 ℃培養(yǎng)4 h。依據(jù)GB 4789.2—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》計算菌株在胃腸液環(huán)境中的活菌數(shù)，通過公式（3）計算存活率。

1.3.9 乳酸菌耐藥性測定

將200 μL 的菌液涂布于MRS 培養(yǎng)基上，在每個培養(yǎng)基中放置一種抗生素藥敏紙片，置于37 ℃培養(yǎng)24 h 后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，并根據(jù)李艷莉[14]的方法對乳酸菌的耐藥性進(jìn)行判定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 29.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析和Duncan多重比較組間差異顯著性（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳥苷和肌苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

鳥苷和肌苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖1 所示。

圖1 鳥苷和肌苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of guanosine and inosine standards

由圖1 可知，肌苷在本色譜條件下的保留時間為12.255 min，鳥苷的保留時間為13.894 min。以溶液濃度（mmol/L）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，肌苷和鳥苷的方程分別為y1=6.541 86×106x，R2=0.999 4；y2=9.212 67×106x，R2=0.999 4，該色譜條件可以用于肌苷和鳥苷的測定。

2.2 高效降解核苷乳酸菌的篩選

本研究從發(fā)酵大醬以及泡菜中分離到乳酸菌共計30 株，其中有18 株對核苷的降解率可達(dá)50% 以上。菌株對肌苷和鳥苷的降解能力如表1 所示。

表1 菌株對肌苷和鳥苷的降解能力Table 1 Degradation of inosine and guanosine by strains

由表1 可知，泡菜中共有5 株乳酸菌株對肌苷和鳥苷的降解率達(dá)到75% 以上，而大醬中較少，僅有2 株菌株對核苷具有較高降解能力。其中XH-15、XH-16、XH-21、XH-23、TY-S8 和TY-J1 對兩種核苷的降解率均能達(dá)85%以上，而菌株XH-15 和TY-S8 對核苷降解率均可高至99%。此外，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對肌苷具有強(qiáng)降解能力的菌株同樣可以高效降解鳥苷。通過比較不同菌株降解核苷的效果，選擇XH-15、XH-16、XH-21、XH-23、TY-S8 和TY-J1 6 株菌株進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.3 乳酸菌株的鑒定

不同乳酸菌鑒定結(jié)果如表2 所示。

表2 不同乳酸菌鑒定結(jié)果Table 2 Identification of selected lactic acid bacteria

由表2 可知，泡菜中所分離得到的XH-15、XH-16和XH-21 菌株均為短乳桿菌（Levilactobacillusbrevis），僅有菌株XH-23 為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum），而大醬中所分離得到的TY-S8 和TY-J1 菌株均為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）。

2.4 乳酸菌對XOD 的抑制活性

不同乳酸菌株對XOD 的抑制能力如圖2 所示。

圖2 不同乳酸菌株對XOD 的抑制能力Fig.2 Inhibitory capacity of different lactic acid bacteria strains on xanthine oxidase

由圖2 可知，所篩選得到的6 株菌株除對核苷具有較好的降解能力，對XOD 同樣具有一定的抑制作用。其中泡菜中短乳桿菌XH-21 和植物乳桿菌XH-23 兩個菌株對XOD 抑制率分別高達(dá)21.35% 和15.66%；大醬中植物乳桿菌TY-S8 和TY-J1 對XOD 的抑制率高達(dá)16.73% 和11.05%，而短乳桿菌XH-15 和XH-16 的XOD 抑制率相對較低，分別為4.63% 和8.54%?？梢?，雖然不同菌株內(nèi)容物對XOD 的抑制活性存在差異，但均具有一定的抑制能力。根據(jù)菌株對XOD 抑制活性，最終選擇抑制率高于10% 的菌株即XH-21、XH-23、TY-S8 和TY-J1 進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.5 乳酸菌的耐酸能力

乳酸菌要通過胃部至腸道發(fā)揮益生功能，首先要耐受胃部酸性條件。人體胃部pH 值一般在2.0～4.0范圍變化。不同乳酸菌的耐酸能力如表3 所示。

表3 不同乳酸菌的耐酸能力Table 3 Acid tolerance of different lactic acid bacteria

由表3 可知，pH2.0 條件在一定程度上抑制了菌群的生長，但所有菌株的存活率均在90.00%以上，其中大醬中的植物乳桿菌TY-S8 的存活率可達(dá)96.92%，而TY-J1 存活率相對較低，為93.99%。pH 值為2.0～3.0 時，除短乳桿菌XH-21 外，其余3 個菌株活菌數(shù)隨著pH 值的增加，均呈現(xiàn)上升趨勢，且存活率均在95%以上，而菌株XH-21 的存活率降至93.22%。然而，在pH4.0 條件下，4 株菌株活菌數(shù)量均呈現(xiàn)不同程度下降趨勢，菌株XH-21 和XH-23 存活率分別降至92.48%和91.92%，而大醬中的植物乳桿菌TY-S8 和TY-J1 存活率相對較高，分別為98.62% 和97.12%。結(jié)合菌株對核苷的降解率、對XOD 抑制作用以及耐酸能力，將大醬中植物乳桿菌TY-S8 作為優(yōu)選菌株進(jìn)行后續(xù)特性分析。

2.6 植物乳桿菌TY-S8 的耐膽鹽能力

乳酸菌能夠在腸道中發(fā)揮益生功能還依賴于其對膽鹽的耐受性。植物乳桿菌TY-S8 耐膽鹽能力如圖3所示。

圖3 植物乳桿菌TY-S8 耐膽鹽能力Fig.3 Bile salt tolerance of Lactobacillus plantarum TY-S8

由圖3 可知，植物乳桿菌TY-S8 在膽鹽濃度為3.0 g/L 的條件下培養(yǎng)1 h 后，活菌數(shù)由9.21 lg（CFU/mL）下降至8.59 lg（CFU/mL），而處理3 h 后活菌數(shù)增長至9.06 lg（CFU/mL），處理5 h 后活菌數(shù)為8.88 lg（CFU/mL）。因此，膽鹽處理對菌株生長具有一定影響，但菌株TYS8 在不同的處理時間內(nèi)其存活率均高于90%，處理3 h 后菌株存活率可達(dá)98%。綜上，植物乳桿菌TY-S8對膽鹽具有一定耐受性。

2.7 植物乳桿菌TY-S8 胃腸道的耐受能力

為了進(jìn)一步分析乳酸菌在消化道環(huán)境中的耐受力，本研究檢測了菌株在人體胃腸液模擬環(huán)境中的存活情況。植物乳桿菌TY-S8 對胃腸液耐受能力如圖4所示。

圖4 植物乳桿菌TY-S8 對胃腸液耐受能力Fig.4 Tolerance of Lactobacillus plantarum TY-S8 in artificial gastrointestinal fluid

由圖4 可知，植物乳桿菌TY-S8 在人工胃液中處理3 h 后活菌數(shù)可達(dá)到9.74 lg（CFU/mL），且菌株存活率可達(dá)99%；在人工腸液中處理4 h 后活菌數(shù)呈下降趨勢，但仍可達(dá)到8.08 lg（CFU/mL），菌株存活率為82%。綜上，植物乳桿菌TY-S8 對胃腸道環(huán)境具有一定耐受性，菌株存活率較高。

2.8 植物乳桿菌TY-S8 抗生素耐受能力

為保證植物乳桿菌TY-S8 可以在安全范圍內(nèi)使用，本研究對該菌株開展了藥敏性試驗。植物乳桿菌TY-S8 對不同抗生素的敏感性如表4 所示。

表4 植物乳桿菌TY-S8 對不同抗生素的敏感性Table 4 Sensitivity of Lactobacillus plantarum TY-S8 to different antibiotics

由表4 可知，TY-S8 對氨芐西林、紅霉素以及頭孢曲松具有較強(qiáng)敏感性，抑菌圈直徑均在35.00 mm 以上，此外，對利福平、慶大霉素和四環(huán)素也具有一定敏感性。結(jié)果表明菌株對卡那霉素、鏈霉素、青霉素和環(huán)丙沙星不具有敏感性，其中對環(huán)丙沙星具有較強(qiáng)抗性，抑菌圈直徑為0.00 mm。

3 討論與結(jié)論

目前，多項研究發(fā)現(xiàn)益生菌對高尿酸血癥具有緩解作用[15-17]。本研究以東北傳統(tǒng)發(fā)酵大醬以及朝鮮族農(nóng)家自制泡菜為原材料，對其中能夠高效降解核苷的乳酸菌進(jìn)行篩選和鑒定，并對其益生特性進(jìn)行分析。

利用HPLC 法從兩種發(fā)酵食品中共分離到18 株對核苷的降解率可達(dá)50%以上的乳酸菌，經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)大醬中植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）TY-S8 具有潛在的降尿酸功能及良好的益生特性。核苷是尿酸形成的前體物質(zhì)，而該菌株對兩種核苷即肌苷和鳥苷的降解率均可達(dá)99.33%，降解效果遠(yuǎn)高于Lee 等[18]從發(fā)酵食品中所分離到的植物乳桿菌MJM60389，其對肌苷降解率僅為73%，而對鳥苷的降解率僅為82.1%；此外，Kuo 等[19]對兩株植物乳桿菌即TSP05 和L-29 的核苷降解力分析發(fā)現(xiàn)，菌株TSP05 對肌苷和鳥苷的降解率低于60%，而菌株L-29 的降解率則低于20%。相較Cao 等[20]從發(fā)酵酸奶中分離得到的植物乳桿菌Q7對核苷的降解率雖可高達(dá)99.15%，但仍略低于本研究所分離到的植物乳桿菌TY-S8?？梢?，大醬中的TYS8 菌株具有較好的核苷降解效果。

XOD 是嘌呤核苷代謝途徑的限速酶，也是尿酸產(chǎn)生過程中的關(guān)鍵酶[21]。王家彬等[22]研究發(fā)現(xiàn)，短乳桿菌LB1lac20 的活菌懸液和胞內(nèi)提取物對XOD 具有良好的抑制活性，抑制率分別為21.27%和19.60%；呼靜等[23]從奶豆腐中分離一株羅伊氏乳桿菌NL02，其細(xì)胞內(nèi)容物對XOD 的抑制率在28.18%以上。本課題組前期從朝鮮族農(nóng)家自制泡菜中分離得到一株短乳桿菌SLlac-18，其對核苷降解率雖可達(dá)97%以上，但其細(xì)胞內(nèi)容物對XOD 的抑制率僅為4%[24]，而本試驗從大醬中分離得到的植物乳桿菌TY-S8，其對XOD 的抑制率為16.73%，遠(yuǎn)高于短乳桿菌SLlac-18，進(jìn)一步證實菌株TY-S8 具有一定的降尿酸潛力。

為實現(xiàn)乳酸菌在胃腸道中存活并發(fā)揮益生功能，首先需確保菌株對人體消化道環(huán)境具有一定耐受力。本研究所篩選的植物乳桿菌TY-S8 在經(jīng)pH2.0～4.0 酸性條件、3.0 g/L 膽鹽條件以及人工胃腸液條件處理后，其活菌數(shù)均可高達(dá)6.00 lg（CFU/mL）以上，菌株存活率均在80%以上。任宇杰等[25]篩選出一株發(fā)酵乳桿菌SR2-6，在pH2.0 強(qiáng)酸性環(huán)境下培養(yǎng)4 h，活菌數(shù)降至6.48 lg（CFU/mL），存活率僅為76.51%；此外，在3.0 g/L 膽鹽條件下培養(yǎng)5 h 后，其活菌數(shù)降至4.79 lg（CFU/mL），存活率僅為54.43%，而在飽腹腸道環(huán)境處理4 h 后，活菌數(shù)僅為6.85 lg（CFU/mL）。由此可見，大醬中植物乳桿菌TY-S8 具有較強(qiáng)的消化道環(huán)境耐受力。通過對該菌株進(jìn)行藥敏性試驗發(fā)現(xiàn)，TY-S8 對氨芐西林、紅霉素以及頭孢曲松具有較強(qiáng)敏感性，可作為安全益生菌使用。綜上，大醬中植物乳桿菌TY-S8 具有潛在的降尿酸功能和良好的益生特性，可以應(yīng)用于高尿酸血癥預(yù)防和輔助治療中，具有一定應(yīng)用價值。