9種狼尾草屬植物葉綠體基因組特征分析*

胥富強,王海洋,師春娟,辛培堯,段利武,王齊

(1.甘肅省小隴山林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院,甘肅 天水 741020;2.云南林業(yè)職業(yè)技術(shù)學院,云南 昆明 650000;3.西南林業(yè)大學 林學院,云南 昆明 650224)

狼尾草屬(Pennisetum)為禾本科(Poaceae)1 a生或多年生的草本植物,約有140個種,是熱帶地區(qū)的飼料作物和主要糧食作物[1-2]。該屬植物的中心分布區(qū)域為非洲,在熱帶和亞熱帶地區(qū)居多,少數(shù)種可達溫寒地帶。我國境內(nèi)被記載的狼尾草屬植物主要分布在河北、江西、海南、重慶、四川、云南、甘肅、青海等地[1]。1991年,同文軒[3]發(fā)現(xiàn)了寶雞狼尾草(P.baojienseTong,sp.nov.),為狼尾草的新種;2004年,吳玉虎[4]發(fā)現(xiàn)了青海白草(P.centrasiaticumTzve1.var.Qinghaiensis Wu.),為青海狼尾草的一個新變種。至今我國有狼尾草屬植物共計12個種,3個變種,其中包括引進的4個種[5]。

狼尾草作為我國的重要牧草資源,狼尾草屬植物在分子生物學方面的研究較多[6-7]。葉健軍等[8]用引物組合法對133份狼尾草屬植物樣本進行基因分型,將所得條帶的聚類分析結(jié)果分為五大、五小規(guī)模集群,研究發(fā)現(xiàn)就算排除了不良種質(zhì)管理做法、高層次的遺傳一致性、非最佳引物等因素,DNA擴增片段長度多態(tài)性技術(shù)的數(shù)據(jù)也不能清晰劃分狼尾草屬植物樣本的界限。劉偉民等[9]和姚運法等[10]通過基于RAPD及SRAP標記的UPGMA聚類分析可以把彼此間親緣關(guān)系較近的‘矮象草’‘桂牧1號’‘象草’‘王草’‘N51’等區(qū)分開來,證明了在種間鑒別及遺傳關(guān)系分析方面RAPD及SRAP分子標記具有很好的應(yīng)用價值。目前對狼尾草屬植物分類,基因組研究方面非常有限,國內(nèi)狼尾草屬植物的種質(zhì)資源多而雜,其中含有各個地域野生種、引種栽培的變種以及培育的新種,再加上各地的互相引種,導致了名稱和分類歸屬的混亂,而且有多種狼尾草屬植物都有相同或相近的別稱,如中型狼尾草(P.longissimusS.L.Chen et Y.X.Jin var.intermediumS.L.Chen et Y.X.Jin)與長序狼尾草(P.longissimusS.L.Chen et Y.X.Jin)均有別稱“白草”。還有拉丁名為“P.alopecuroides(L.)Spreng.”,有與該屬名相同的中文命名“狼尾草”[11]。雖然現(xiàn)今已有分子標記技術(shù)、形態(tài)學、細胞學等方面的研究,但是在分類歸屬上問題仍然比較多。

葉綠體是植物光合作用和固碳的主要場所。高等植物葉綠體基因組是一個雙鏈環(huán)狀DNA分子,大小在72～217 kb之間,包含約130個基因。葉綠體基因組具有典型的四分體結(jié)構(gòu),在大多數(shù)植物中包括一個大的單拷貝區(qū)(LSC)、一個小的單拷貝區(qū)(SSC)和一對反向重復(fù)序列(IR)[12-14]。與核基因組相比,葉綠體基因組的獨特之處在于其母系遺傳、體積小、結(jié)構(gòu)簡單和序列保守[15-16]。因此,葉綠體基因組序列被廣泛用于系統(tǒng)發(fā)育和適應(yīng)性進化研究。

本研究以9種狼尾草屬植物共10個樣本為研究對象,利用淺層測序技術(shù)獲得葉綠體全基因組序列,對其進行組裝和注釋,通過比較基因組學進行研究分析,闡明狼尾草屬植物葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)和組成特點,豐富狼尾草屬葉綠體基因組數(shù)據(jù)庫,為后續(xù)研究該屬物種提供更多序列信息,同時也為狼尾草屬植物種質(zhì)資源的評價、開發(fā)、利用以及重要經(jīng)濟性狀的遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

分析材料來自云南林業(yè)職業(yè)技術(shù)學院引種栽培的9種狼尾草屬植物共10個樣本(表1),所有樣本皆經(jīng)云南林業(yè)職業(yè)技術(shù)學院組織的專家鑒定。

表1 實驗材料信息及標本號

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取與測序

將狼尾草屬植物10個樣本新鮮葉片送至中國科學院昆明植物研究所進行DNA提取及測序。新鮮植物葉片采用改良的CTAB法[17]提取總DNA,在Ilumina二代基因組分析平臺上對總DNA進行雙向末端測序,每個樣品添加標簽混合建庫,文段的片段大小為500 bp,雙向150 bp或250 bp測序,每個樣本確保獲取不低于5G的測序數(shù)據(jù)。

1.2.2 葉綠體基因組的組裝和注釋

使用GetOrganelle軟件[18]組裝葉綠體基因組,對于很難用軟件組裝的有雜質(zhì)或者低質(zhì)量的序列,采用人工組裝。具體方法為:以狼尾草屬中的象草(P.purpureus,GenBank:MF594682)基因組序列為參考序列,結(jié)合使用BioEdit v7.2.5和Geneious R8.1.3軟件,把Contig組裝成完整的葉綠體基因組。獲取Contig有兩種方式:(1)通過GetOrganelle程序運行后輸出的“scaffolds.fasta”文件中即含Contig;(2)運行NGSQC Tool kit v.2.3.3程序,過濾測序獲取到的DNA序列,即得到高質(zhì)量的片段(read),用CLCGenomics Workbench v6.5軟件來組裝read得到長度更長的片段(contig)[19]。最后對狼尾草屬葉綠體基因組進行注釋,注釋程序選擇在線程序GeSeq(https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html)[20],繪制狼尾草屬葉綠體基因組物理圖選擇在線程序OGDRAW (https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)。

1.2.3 狼尾草屬植物葉綠體基因組特征分析及突變檢測

對狼尾草屬10個葉綠體基因組、大單拷貝區(qū)(LSC區(qū))、小單拷貝區(qū)(SSC區(qū))和反向重復(fù)去(IR區(qū))的大小及GC含量進行統(tǒng)計,然后對10個狼尾草屬植物的葉綠體基因組的基因數(shù)量和種類進行統(tǒng)計,其中包括編碼蛋白質(zhì)、tRNA和rRNA。

MISA是一個用perl語言寫的從fasta序列中鑒定簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeats,SSRs)的程序[21],利用MISA軟件檢測10個狼尾草屬植物葉綠體基因組簡單序列重復(fù)數(shù)量。搜索的標準是:重復(fù)單元1～5 bp,單核苷酸重復(fù)序列最小重復(fù)數(shù)為10,二核苷酸重復(fù)序列的最小重復(fù)數(shù)為5,三、四、五核苷酸重復(fù)序列的最小重復(fù)數(shù)均為4,六核苷酸重復(fù)序列的最小重復(fù)數(shù)均為3,兩個重復(fù)序列間隔最小值為100 bp。然后用REPuter在線程序(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer)檢測葉綠體基因組非簡單序列重復(fù)中的reverse repeats(反向重復(fù))、forward repeats(正向重復(fù))、complement repeats(互補重復(fù))和palindromic repeats(回文重復(fù)),按照如下參數(shù)設(shè)置:(1)sequence identity:90%;(2)minimum repeat size:30 bp;(3)Hamming distance:3。然后用DNAMAN在線程序(https://tandem.bu.edu/trf/home)檢測串聯(lián)重復(fù)(tandem repeats),按照如下參數(shù)設(shè)置:Mismatch:7;Indel:7;maximum period size:500;Match:2;minimum alignment score:80。

1.2.4 序列差異分析

對狼尾草屬10個葉綠體基區(qū)組的4個區(qū)段進行比較,通過對比IR區(qū)邊界區(qū)域的基因分布分析不同狼尾草屬葉綠體基因組結(jié)構(gòu)差異。采用DnaSP v6軟件對狼尾草屬10個葉綠體基因組進行滑動窗口分析,評估葉綠體基因組之間的核苷酸變異性(Pi)[22],步長設(shè)置為200 bp,窗口長度設(shè)置為600 bp。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系重建

利用本研究10條狼尾草屬植物葉綠體基因組序列,加上從NCBI數(shù)據(jù)庫下載獲得的21條狼尾草屬植物完整葉綠體基因組序列,將狗尾草屬的2個物種和鈍葉草屬(StenotaphrumTrin.)的1個物種做為外類群,共計34條葉綠體基因組序列進行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系重建。首先將葉綠體基因組序列用在線MAFFT Version 7 軟件[23]進行比對,然后進行手工調(diào)整和矯正,得到可靠的矩陣用于系統(tǒng)發(fā)育分析。分別使用最大似然法(Maximum likelihood,ML)和貝葉斯推理法(Bayesian inference,BI)來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。構(gòu)建BI樹先使用jModeTest2.1.10選擇的最合適的DNA替換模型進行系統(tǒng)發(fā)育重建[24]。采用MrBayes 3.1.2軟件構(gòu)建BI樹[25]。馬爾科夫鏈蒙特卡洛迭代運算1×108代,每1 000代抽樣一次,當Average sandard deviation of split frequencies (P)小于0.01時,用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用IQ-TREE 1.6.7進行ML分析[26],使用UFBoot2[27]和Colla-psing近零分支選項進行1 000個引導重復(fù),ML支持率(bootstrap support values)大于70%時認為支持率較好。用Figtree v1 1.4.3軟件進行結(jié)果對比,查看和美化。

2 結(jié)果與分析

2.1 狼尾草屬植物葉綠體基因組基本信息

10個狼尾草屬植物葉綠體基因組均為典型的四分體結(jié)構(gòu)(圖1),其大小在137 929～138 554 bp之間,最大差距為625 bp。葉綠體基因組最小的是非洲狼尾草,大小為137 929 bp,最大的是羽絨狼尾草,大小為138 554 bp。LSC區(qū)的大小為80 850～81 421 bp,最大差距為571 bp,最小的是東非狼尾草,長度為80 850 bp,最大的是羽絨狼尾草,長度為81 421 bp;IR區(qū)的大小為22 288～22 382 bp,最大差距為94 bp,最小的是長序狼尾草,長度為22 288 bp,最大的是羽絨狼尾草,長度為22 382 bp;SSC區(qū)的大小為12 189～12 437 bp,最大差距為248 bp,最小的是非洲狼尾草,長度為12 189 bp,最大的是絨毛狼尾草,長度為12 437 bp。GC含量范圍為38.6%～38.7%,其中LSC區(qū)GC含量范圍為36.4%～36.6%,IR區(qū)GC含量范圍為44%～44.1%,SSC區(qū)GC含量范圍為33%～33.2%(表2)。

圖1 狼尾草屬植物葉綠體基因組物理圖譜

共注釋了113個基因,包括31個tRNA 基因,78個編碼蛋白基因和4個rRNA 基因。17個基因在IR區(qū)重復(fù),為互相拷貝,包括6個蛋白編碼基因、4個rRNA 基因和7個tRNA基因。根據(jù)功能對基因進行分類,和光合作用有關(guān)的基因有43個(photosystemI、photosystemI、cytochrome b/f complex、ATP synthase、NADH dehydrogenase、Rubis CO large subunit),和轉(zhuǎn)錄、翻譯相關(guān)的基因有25個(Ribosomal proteins、DNA dependent RNA polymerase),RNA基因35個(Ribosomal RNA genes、Transfer RNA genes),其他的一些基因和未知功能的基因(Conserved reading frames)一共10個(Maturase、Envelop membrane protein、ATP dependent protease)(表3)。

表3 10個狼尾草屬植物樣本葉綠體基因組基因分布

2.2 10個狼尾草屬植物樣本葉綠體基因組的突變類型

2.2.1 葉綠體基因組的IR區(qū)可視化

分析發(fā)現(xiàn),10個狼尾草屬植物葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)、基因順序無明顯差異,在IR/SC交界區(qū)表現(xiàn)出微小差異。葉綠體基因組IR 區(qū)大小為22 288 bp～22 382 bp,IRb與LSC區(qū)邊界基因為rps19,與SSC區(qū)邊界基因為ndhF;IRa與LSC區(qū)邊界基因為rps19,與SSC區(qū)邊界基因為ndhH。東非狼尾草 的rps19基因距IRb/LSC邊界42 bp,其余物種的rps19基因距離IRb/LSC邊界41 bp。所有物種的ndhF基因跨越IRb區(qū)的長度為29 bp,長序狼尾草 的ndhF基因跨越SSC區(qū)的長度為2 194 bp,其余物種的ndhF基因跨越SSC區(qū)的長度為2 188 bp。10個樣本IRa與SSC區(qū)邊界的ndhH基因長度都為1 181 bp。東非狼尾草的rps19基因距IRa與LSC區(qū)邊界43 bp,其余樣本的rps19基因距IRa與LSC區(qū)邊界42 bp(圖2)。

圖2 10個狼尾草屬植物葉綠體基因組LSC,SSC及IR邊界比較

2.2.2 葉綠體基因組的重復(fù)序列檢測

檢測了10個狼尾草屬植物葉綠體基因組的簡單重復(fù)序列數(shù)量。共檢測到389個SSRs位點。檢測到的位點包括單核苷酸重復(fù),雙核苷酸重復(fù)及復(fù)合型核苷酸重復(fù)共5種,其中單核苷酸重復(fù)數(shù)量最多,為314個,其次是雙核苷酸重復(fù)50個,三核苷酸重復(fù)11個,四、六核苷酸重復(fù)均為7個,未檢測出五核苷酸重復(fù)(圖3)。

圖3 10個狼尾草屬植物葉綠體基因組中檢測到的SSR數(shù)量及類型

分別檢測10個狼尾草屬植物葉綠體基因組的forward repeats(正向重復(fù))、reverse repeats(反向重復(fù))、palindromic repeats(回文重復(fù))、complement repeats(互補重復(fù))和tandem repeats(串聯(lián)重復(fù))的數(shù)量(圖4)。結(jié)果顯示正向重復(fù)的數(shù)量為268個,反向重復(fù)的數(shù)量為15個,回文重復(fù)的數(shù)量為182個,串聯(lián)重復(fù)的數(shù)量為328個,未檢測到互補重復(fù)。

圖4 10個狼尾草屬植物葉綠體基因組非簡單序列重復(fù)類型和數(shù)量

2.2.3 mVISTA序列差異分析

以長序狼尾草葉綠體基因組序列作為參考的序列同源性比較表明,供試的狼尾草屬植物葉綠體基因組結(jié)構(gòu)基本一致,種間序列整體較為保守,尤其是CDS基因區(qū)。在整體變異上,基因非編碼的基因間區(qū)和部分內(nèi)含子區(qū)變異率要高于CDS基因區(qū),LSC區(qū)和SSC區(qū)的變異率高于rRNA基因所在的IR區(qū)(圖5)。

圖5 10個狼尾草屬植物葉綠體基因組序列對比圖

2.2.4 突變熱點篩選

利用DnaSP軟件計算10個狼尾草屬植物葉綠體基因組在600 bp范圍內(nèi)的核苷酸變異度 (Pi)。結(jié)果表明10個葉綠體基因組核苷酸變異度為0～0.022 07,平均值為0.005 27。有10個存在明顯序列變異的高變區(qū)域(Pi>0.015),分別為trnK(UUU)-rps16,psbZ-trnM-CAU,trnS-CGA-trnT-GGU,rpl2-trnE-UUC,trnD-GUC-psbN,petN-rpoB,trnL-UAA-ndhJ,petA-psbJ,psbE-petL,ndhF-ccsA,其中9個位于LSC區(qū),1個位于SSC區(qū),IR區(qū)未發(fā)現(xiàn)變異較高的序列片段(圖6A)。核苷酸變異度為0～0.021 87,平均值為0.005 19。有9個存在明顯序列變異的高變區(qū)域(Pi>0.015),分別為rps16,rps16-psbK,trnS-CGA-trnT-GGU,petN-rpoB,rps4-trnL-UAA,trnL-UAA-ndhJ,petA-psbJ,psbE-petL,ndhF-ccsA。

圖6 狼尾草屬植物10個葉綠體基因組核苷酸變異度(Pi)的比較(A),狼尾草屬植物27個葉綠體基因組核苷酸變異度(Pi)的比較(B)

2.3 基于葉綠體基因組的狼尾草屬植物系統(tǒng)發(fā)育分析

基于葉綠體基因組序列構(gòu)建的狼尾草屬植物BI和ML發(fā)育樹具有較好的支持率,發(fā)育樹結(jié)果一致(圖7)。兩個發(fā)育樹均形成Clade Ⅰ和Clade Ⅱ兩個大的分支,其中Clade Ⅰ分支(BS=100%,PP=1)包括5個物種:羽絨狼尾草(P.setaceus)、非洲狼尾草(P.massaicus)、白穗狼尾草(P.alopecuroides)、P.compressus、東非狼尾草(P.clandestinus),其中東非狼尾草的4個樣本聚在一個亞分支(BS=100%,PP=1),與非洲狼尾草、P.alopecuroides、P.compressus形成姐妹關(guān)系(BS=100%,PP = 0.99)。

圖7 基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建狼尾草屬植物ML和BI系統(tǒng)發(fā)育樹

CladeⅡ分支(BS=100%,PP=1)又可分為三個亞支,第一個亞支(BS=100%,PP=1),包括長序狼尾草(P.longissimus)、P.flaccidus、P.centrasiaticus,其中,P.centrasiaticus的3個樣本聚在一起,P.flaccidus和長序狼尾草與P.centrasiaticus形成姐妹關(guān)系(BS=100%,PP=1);第二個亞分支(BS=100%,PP=1),包括東方狼尾草、P.polystachios、P.ciliaris、P.longispinus、P.echinatus,且與第一個亞支形成姐妹關(guān)系(BS=55%,PP=1);第三個亞支(BS=100%,PP=1)包括絨毛狼尾草、象草(P.purpureus)、P.giganteum、紫御谷(P.glaucum‘Purple Majesty’)、牧地狼尾草(P.setosus)、P.americanus,其中象草的4個樣本并未聚在一起,象草(MH488956)這個樣本嵌套在另一小支中。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

高等植物的葉綠體基因組的序列長度一般在120～160 kb之間,如冉然[28]對5種蒿屬(ArtemisiaLinn.)植物研究發(fā)現(xiàn)其葉綠體基因組序列長度在151 076～151 318 bp之間;岳杰[29]對4種人參屬(PanaxLinn.)植物研究發(fā)現(xiàn)其葉綠體基因組序列長度在155 993～156 359 bp之間;顧麗[30]對13種天胡荽屬(HydrocotyleL.)植物研究發(fā)現(xiàn)其葉綠體基因組大小在152 659～153 669 bp之間。本研究新測序的10個狼尾草屬植物葉綠體基因組大小在137 929～138 554 bp之間,最大差距為625 bp,最小的是非洲狼尾草,為137 929 bp,最大的是羽絨狼尾草,為138 554 bp。狼尾草屬植物葉綠體基因組均為典型四分體結(jié)構(gòu),完全符合高等植物葉綠體基因組特征。一般來說每個物種都有一個相對獨立且固定的GC含量,如石蒜科(Amaryllidaceae)[31]、薔薇科(Rosaceae)[32]等部分植物均存在此特征,本研究中10個狼尾草屬植物的葉綠體基因組GC含量范圍為38.6%～38.7%,且IR區(qū)GC含量(44%～44.1%)高于LSC區(qū)(36.4%～36.6%)和SSC區(qū)(33%～33.2%),推測IR區(qū)rRNA基因的存在可能是導致IR區(qū)GC含量較高的主要原因[33]。

完整的葉綠體基因組是用于系統(tǒng)發(fā)育分析的有價值的遺傳標記來源,因為其基因組結(jié)構(gòu)相對保守[34-35]。而IR區(qū)是植物葉綠體基因組中最保守的區(qū)域,IR區(qū)的長度、結(jié)構(gòu)及與SC區(qū)的邊界都表現(xiàn)出較高的保守性[36-37],IR區(qū)的擴張和收縮作為引起植物葉綠體基因組長短變化的重要因素,大多數(shù)物種的IR區(qū)的擴張與收縮體現(xiàn)在IR/SC邊界在幾個固定基因內(nèi)的少量偏移[38],這種偏移可能導致部分基因成為假基因。本研究中10個狼尾草屬植物基因組的IR邊界區(qū)域比較保守,幾乎沒有差異。葉綠體基因組均有113個基因,包括78個編碼蛋白基因,31個tRNA基因和4個rRNA基因,葉綠體基因組的大小、基因順序和組成與已報道的狼尾草屬植物基因組高度相似[2]。

在基因組中,并不是所有的基因突變事件都是隨機的,而是聚集性的[39-40],并且這些突變位點在基因組中創(chuàng)造了高度可變的區(qū)域[41]。在已完成測序的狼尾草屬植物中,廣泛用作植物DNA條形碼的matK、rbcL和psbA-trnH基因在葉綠體基因組中的遺傳變異低于預(yù)期,但卻發(fā)現(xiàn)9個其他高變區(qū),并且有兩個高變區(qū)(psbE-petL與petA-psbJ),這與Xu等[2]研究結(jié)果一致?；蚪M中存在的高變區(qū)可用做DNA條形碼鑒別物種[42-43],也可作為重建狼尾草屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的潛在標記,因此,這些高度分化的區(qū)域能為狼尾草屬植物鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、分子標記開發(fā)提供豐富的信息。

本研究基于葉綠體全基因組構(gòu)建的貝葉斯樹和最大似然樹,具有較高的支持率,ML樹和BI樹均支持分成2個大的分支,其中1個分支分為3個亞枝,在基于葉綠體全基因組構(gòu)建的發(fā)育樹中,東非狼尾草與P.alopecuroides(NC—064146)和P.alopecuroides(ON 206984)聚在一起,其親緣關(guān)系較近,這與Xu等[2]的研究結(jié)果相同,另外Liu等[44]研究中發(fā)現(xiàn),P.americanus(KX756179)、P.americanus(MN180104)、象草、絨毛狼尾草在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚在一起,這也與本研究中系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果相吻合,值得一提的是,所有發(fā)育樹中象草 的4個樣本并未聚在一起,象草(MH488956)樣本嵌套在其他亞支中,推測該種可能為雜交種或地域原因?qū)е碌倪z傳差異。

3.2 結(jié)論

本研究測序的10個狼尾草屬植物葉綠體基因組均為典型的四分體結(jié)構(gòu),序列長度在137 929～138 554 bp之間,其結(jié)構(gòu)無明顯差異,GC含量在38.6%～38.7%之間,編碼113個基因。重復(fù)序列檢測分析表明:在簡單序列重復(fù)檢測中單核苷酸重復(fù)數(shù)量最多,而在非簡單序列重復(fù)檢測中串聯(lián)重復(fù)所占比例最高。結(jié)構(gòu)突變以及序列差異的分析顯示:IR區(qū)邊界無明顯伸縮或擴張現(xiàn)象,LSC區(qū)和SSC區(qū)的變異率較高。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析顯示:10 份狼尾草屬植物樣本間界限清晰,發(fā)育樹形成兩個大的分支,其中第一個分支又可分為3個亞支,且第一亞枝與第二亞枝為姐妹群。對目前已發(fā)表葉綠體基因組的狼尾草屬植物的系統(tǒng)發(fā)育分析揭示了物種之間的親緣關(guān)系,為狼尾草屬植物開發(fā)利用以及遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。