鰱魚糜漂洗液中不同回收方式肌漿蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性

任中陽，龍斯宇，康寧哲，石林凡，翁武銀，黃琪琳,,*

（1.集美大學(xué)海洋與食品生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；3.國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（武漢），湖北 武漢 430070）

《中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒2023》中顯示，2022年我國鰱魚淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量為387.9萬 t，僅次于草魚，位居第2，是淡水魚糜制品的主要原料魚。通常工業(yè)化生產(chǎn)1 t魚糜會產(chǎn)生25～40 t含蛋白質(zhì)的廢水，如直接排放不僅會造成蛋白質(zhì)資源的浪費，而且對環(huán)境產(chǎn)生碳排和污染[1]。因此，魚糜漂洗廢水中蛋白資源的回收再利用對促進(jìn)魚糜綠色低碳加工和節(jié)能減排，實現(xiàn)碳中和的遠(yuǎn)景目標(biāo)具有深遠(yuǎn)的意義。鰱魚的肌漿蛋白約占其肌肉蛋白的29.5%[2]，氨基酸組成豐富，不僅有極高的營養(yǎng)價值[3]，還具有多種加工特性，如膠凝性、持水性、乳化性、起泡性等，在食品領(lǐng)域的應(yīng)用范圍廣闊。肌漿蛋白在肉制品加工pH值和鹽條件下有助于油-水乳液的形成[4]。肌漿蛋白可以通過琥珀?；鸵鹊鞍酌杆夥謩e提高乳化和發(fā)泡能力[5]。Ding Jiaojiao等[6]發(fā)現(xiàn)，適量肌漿蛋白的添加有助于提高魚糜凝膠強(qiáng)度和白度?；厥睁T魚肌漿蛋白可以明顯增加鯰魚火腿的凝膠強(qiáng)度、硬度和咀嚼度[7]。宣恩火腿中肌漿蛋白的水解對火腿風(fēng)味的形成具有重要作用[8]。除此之外，肌漿蛋白在飼料[9]、材料[10]、肥料[11]等領(lǐng)域都有一定的應(yīng)用前景。因此，在碳中和愿景下，對鰱魚糜漂洗廢水中肌漿蛋白進(jìn)行回收利用有助于實現(xiàn)魚糜生物質(zhì)廢料的高值化利用和廢水減排的雙贏局面，將產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)價值和環(huán)境效益。

蛋白質(zhì)的回收大多受pH值變化、溫度變化和絮凝劑等外在因素影響，而這些因素通常會引起蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性變化[12]。近年來，國內(nèi)外關(guān)于肌漿蛋白的回收已有較多研究。采用酸偏移偶聯(lián)殼聚糖對魚類漂洗水中的蛋白質(zhì)進(jìn)行絮凝沉淀，可使肌漿蛋白的回收率從35.52%提高到81.54%[13]。殼聚糖-海藻酸鈉混合絮凝法和等電點-絮凝劑復(fù)合法用于絮凝魚糜漂洗液蛋白，回收率有所提高，但過程相對復(fù)雜，工業(yè)化難度較高[14]。多種回收方式（熱處理法、酸偏移法、絮凝劑法）對魚糜漂洗液中的肌漿蛋白回收率已經(jīng)能夠超過80%[15]。然而，關(guān)于不同回收方式下肌漿蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性的報道較少。因此，本研究通過冷凍干燥法、熱處理法、等電點沉淀法、酸偏移法、殼聚糖絮凝法和酸偏移耦合殼聚糖絮凝法回收得到鰱魚肌漿蛋白，對6 種回收肌漿蛋白的結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量、構(gòu)象和功能特性進(jìn)行表征并比較分析，以進(jìn)一步了解肌漿蛋白在不同回收方式下的結(jié)構(gòu)和功能特性變化規(guī)律，為更好地開發(fā)利用鰱魚肌漿蛋白提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚購于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場。

鹽酸、氫氧化鈉、殼聚糖（脫乙酰度95%）、福林酚、8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3205食品調(diào)理機(jī) 德國博朗公司；PB-10 pH計德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Avanti J-26XP高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司；UV-1750紫外-可見分光光度計、RF-5301熒光光譜儀 日本島津公司；iS50傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 美國Nicolet公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇國華電器有限公司；FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；1600/1600R凝膠成像儀上海天能公司。

1.3 方法

1.3.1 鰱魚肌漿蛋白的回收方式

將新鮮鰱魚宰殺后采肉、攪碎，與3 倍質(zhì)量的4 ℃預(yù)冷蒸餾水混合，用高速分散均質(zhì)機(jī)在6 000 r/min下勻漿3 min，然后于4 ℃、6 000 r/min條件下離心10 min，取上清液即為魚糜漂洗液。

1）冷凍干燥法：將魚糜漂洗液直接進(jìn)行冷凍干燥，得到的產(chǎn)物即為冷凍干燥法回收肌漿蛋白（freeze-dried sarcoplasmic proteins，F(xiàn)P）。

2）熱處理法：將魚糜漂洗液在70 ℃下水浴加熱1 h，然后在8 000 r/min離心10 min，下層沉淀即為熱處理法回收肌漿蛋白（heating sarcoplasmic proteins，HP）。

3）等電點沉淀法：使用3 mol/L HCl溶液將一定體積的魚糜漂洗液pH值調(diào)節(jié)至5.5，于室溫下靜置60 min，然后在8 000 r/min下離心10 min，下層沉淀即為等電點沉淀法回收肌漿蛋白（isoelectric point sarcoplasmic proteins，IPP）。

4）酸偏移法：將魚糜漂洗液用3 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0，再使用3 mol/L NaOH溶液依次調(diào)節(jié)pH值至7.0；于20 ℃水浴鍋中靜置90 min后，8 000 r/min離心10 min，下層沉淀即為酸偏移法回收肌漿蛋白（pHshifting sarcoplasmic proteins，PP）。

5）殼聚糖絮凝法：將一定體積的魚糜漂洗液與1 g/100 mL殼聚糖溶液（使用1%醋酸溶液配制）混合，按照1 L模擬魚糜漂洗液添加殼聚糖溶液40 mL（即魚糜漂洗液的殼聚糖添加量為400 mg/L），然后將漂洗液于室溫下靜置90 min，最后在8 000 r/min離心10 min，下層沉淀即為殼聚糖絮凝法回收肌漿蛋白（chitosanflocculation sarcoplasmic proteins，CP）。

6）酸偏移耦合殼聚糖絮凝法：每1 L魚糜漂洗液中添加25 mL 1 g/100 mL殼聚糖溶液，使用3 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0，隨后用3 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0；放入20 ℃水浴鍋中靜置90 min后，8 000 r/min離心10 min，下層沉淀即為酸偏移耦合殼聚糖絮凝法回收肌漿蛋白（pH-shifting and chitosan-flocculation sarcoplasmic proteins，PCP）[16]。

1.3.2 肌漿蛋白基本營養(yǎng)成分測定

蛋白質(zhì)含量的測定：參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法；脂肪含量的測定：參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》中的索氏抽提法；灰分含量的測定：參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》中的灼燒稱重法；總糖含量的測定：參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總糖的測定》中的苯酚-硫酸法[17]。

1.3.3 肌漿蛋白氨基酸種類及含量測定

參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》進(jìn)行測定。

1.3.4 肌漿蛋白總巰基含量測定

參考丁嬌嬌等[18]的方法，將肌漿蛋白溶液稀釋至4 mg/mL，取0.8 mL肌漿蛋白樣品加入3.6 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（含8 mol/L尿素、2 g/100 mL SDS和10 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 6.8），混勻后加入0.4 mL Ellman試劑（含0.1 g/100 mL 5,5′-二硫雙(2-硝基苯甲酸)、0.02 mol/L Tris-HCl，pH 6.8），40 ℃反應(yīng)25 min后，流水冷卻至室溫，用分光光度計于412 nm波長處測定吸光度，以Tris-HCl緩沖溶液作為空白對照?？値€基含量按式（1）計算。

式中：A為吸光度；n為稀釋倍數(shù)；13 600為摩爾消光系數(shù)/（L/（mol·cm））；ρ為肌漿蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.5 肌漿蛋白FTIR測定

參考王海蜂[19]的方法并適當(dāng)修改，在干燥條件下，取凍干的肌漿蛋白樣品1 mg，經(jīng)KBr壓片，使用FTIR儀對樣品進(jìn)行紅外掃描。掃描范圍為4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)為32。通過Peakfit 4.12軟件進(jìn)行積分，獲得二階導(dǎo)數(shù)峰的面積。通過酰胺I帶吸收峰的傅里葉自去卷積和高斯分布-多峰擬合獲得每個二級結(jié)構(gòu)的相對含量。

1.3.6 肌漿蛋白色氨酸熒光光譜測定

參照Zhao Liyuan等[20]的方法并略作修改。使用預(yù)先冷卻至4 ℃的磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0）將肌漿蛋白樣品配制成0.2 mg/mL的蛋白溶液。為了減少二聚酪氨酸的干擾，采用熒光分光光度計在激發(fā)波長290 nm下以5 nm/s掃描得到300～400 nm的發(fā)射光譜，以pH 7.0、0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液為空白。

1.3.7 肌漿蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSpolyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）測定

參考張敏[21]的方法并略作修改。使用50 mmol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液將肌漿蛋白樣品配制成1 mg/mL的溶液，將蛋白溶液與上樣緩沖液按照體積比4∶1混合，90 ℃金屬浴5 min，使用8%分離膠和5%濃縮膠，電泳采用1 mm凝膠板，上樣量為20 μL。開始電泳時電壓為80 V，待樣品進(jìn)入分離膠后改為120 V。待膠片最下端條帶移動至膠片下端0.5 cm時結(jié)束電泳，取出膠片，用考馬斯亮藍(lán)染色3 h，用甲醇-冰醋酸脫色液脫色至透明。電泳膠片置于凝膠成像儀拍照。

1.3.8 肌漿蛋白表面疏水性測定

參考Lu Han等[22]的方法并適當(dāng)修改，使用ANS作為熒光探針，將肌漿蛋白溶液稀釋至0.125、0.250、0.500、0.750、1.000 mg/mL。將20 μL含有10 mmol/L ANS的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）添加到4 mL肌漿蛋白樣品中，并在黑暗中于室溫（（25±1）℃）放置10 min。使用熒光光度計在374 nm激發(fā)波長和485 nm發(fā)射波長下測定ANS-蛋白綴合物的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度作圖，所得直線斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性?？瞻捉M為4 mL添加20 μL ANS試劑的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）。

1.3.9 肌漿蛋白溶解性測定

參照Hemung等[23]的方法并適當(dāng)修改，將0.5 g回收肌漿蛋白與10 mL磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0）混合，于室溫下振蕩20 min。然后將所有樣品在8 000 r/min下離心15 min，收集上清液，用Lowry法測定蛋白質(zhì)量濃度。回收肌漿蛋白的溶解性按式（2）計算。

式中：m1為上清液中蛋白質(zhì)量/g；m0為溶液中總蛋白質(zhì)量/g。

1.3.10 肌漿蛋白起泡性測定

采用機(jī)械攪打法，參照李弓中等[24]的方法并適當(dāng)修改。取一定量的肌漿蛋白，加入一定體積預(yù)先冷卻至4 ℃的磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0）。通過超聲處理將蛋白分散1 min，然后在常溫下靜置20 min后，配制成蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液。將30 mL蛋白溶液加入到同樣大小的圓筒中，用高速分散均質(zhì)機(jī)在室溫下以10 000 r/min攪拌1 min，攪拌結(jié)束后小心取出攪拌頭，避免泡沫破裂，并立即測定泡沫的體積。肌漿蛋白起泡性按式（3）計算。

式中：V表示溶液的初始體積（30 mL）；V0表示勻漿后取出探頭立刻測得的泡沫體積/mL。

1.3.11 肌漿蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性測定

采用濁度法測定乳化活性指數(shù)（emulsifying active index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI），使用預(yù)先冷卻至4 ℃的磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0）配制1 mg/mL蛋白溶液，2 mL玉米油與8 mL蛋白質(zhì)溶液于高速剪切分散乳化機(jī)下10 000 r/min均質(zhì)1 min。分別于0 min和10 min從底部迅速取出50 μL乳液，加入到5 mL 0.1 g/100 mL SDS溶液中，使用渦旋振蕩儀混勻5 s，于500 nm波長處測定吸光度。EAI及ESI分別按式（4）、（5）計算。

式中：A0為0 min時樣品的吸光度；A10為10 min時樣品的吸光度；F為樣品稀釋倍數(shù)（100）；ρ為蛋白質(zhì)量濃度（0.005 g/mL）；φ為乳液中油相體積分?jǐn)?shù)（0.2）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用Origin 2018、SPSS 22.0、PeakFit V4.12等軟件處理和分析實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析，顯著性分析采用Duncan’s檢驗（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 回收方式對鰱魚肌漿蛋白基本營養(yǎng)成分的影響

由表1可知，與CP、PP、IPP、FP相比，PCP所含蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為78.01%，低于HP（83.33%）。而CP總糖含量明顯高于其他5 種方式回收的肌漿蛋白，這可能是由于提取過程中使用殼聚糖，蛋白質(zhì)與殼聚糖進(jìn)行電荷中和、橋連作用和靜電相互作用而聚集沉降[25]，增加了總糖含量；PCP中總糖含量低于CP，主要歸因于酸偏移耦合殼聚糖回收方式中的殼聚糖添加量小于單一殼聚糖絮凝中殼聚糖的添加量。HP的脂肪含量最低，更利于貯藏；與HP相比，IPP、PP、PCP中灰分含量較高，說明提取過程中pH值調(diào)節(jié)導(dǎo)致鹽離子增多，進(jìn)而使灰分含量部分增加。

表1 不同回收方式鰱魚肌漿蛋白的基本營養(yǎng)成分Table 1 Basic nutrient composition of sarcoplasmic proteins recovered from silver carp by different methods %

2.2 回收方式對鰱魚肌漿蛋白氨基酸含量的影響

由表2可知，6 種提取方式的肌漿蛋白均含有所測得的16 種氨基酸，除CP之外，其余5 種提取方式回收的肌漿蛋白所含必需氨基酸含量豐富，在總氨基酸中的占比為41.25%～42.69%，均符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織的理想模式推薦的比例（必需氨基酸/總氨基酸比值為40%），是理想的優(yōu)質(zhì)蛋白。CP的總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為51.52%，這可能是因為當(dāng)溶液pH值較低時，蛋白帶正電，而殼聚糖的氨基在酸性溶液中質(zhì)子化使殼聚糖帶正電，二者的靜電排斥效應(yīng)賦予系統(tǒng)相對動態(tài)穩(wěn)定性[26]，從而導(dǎo)致回收率較低。

表2 不同回收方式鰱魚肌漿蛋白的氨基酸組成及含量Table 2 Amino acid composition of sarcoplasmic proteins from silver carp recovered by different methods %

2.3 回收方式對鰱魚肌漿蛋白總巰基含量的影響

巰基是蛋白質(zhì)中大量活性功能基團(tuán)的重要組成部分，它具有較強(qiáng)的反應(yīng)活性，對于蛋白質(zhì)的功能特性發(fā)揮著重要作用。溫度、pH值和溶劑類型的變化都會導(dǎo)致巰基氧化生成二硫鍵，因此巰基含量低說明形成的二硫鍵多，即蛋白質(zhì)之間形成了交聯(lián)。由圖1可知，F(xiàn)P的總巰基含量最高（32.43 mol/105g），IPP的總巰基含量（8.87 mol/105g）次之，HP的總巰基含量（3.13 mol/105g）最低，表明pH值變化、熱處理、殼聚糖絮凝均會導(dǎo)致肌漿蛋白的巰基向二硫鍵發(fā)生不同程度的轉(zhuǎn)化。冷凍干燥法有利于肌漿蛋白中巰基的保留，而酸和熱處理有利于二硫鍵的生成。有研究表明，在酸性和堿性條件下，巰基易被氧化成二硫鍵，并且隨著pH值逐漸降低或升高，巰基更易被氧化，即使pH值調(diào)回中性后，巰基含量仍會顯著下降[27-28]。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過熱處理后鯽魚水溶性蛋白中的肌酸激酶和3-甘油醛-3磷酸脫氫酶之間形成二硫鍵[29]。

圖1 不同回收方式鰱魚肌漿蛋白的總巰基含量Fig.1 Total sulfhydryl contents of sarcoplasmic proteins from silver carp recovered by different methods

2.4 不同回收方式鰱魚肌漿蛋白的FTIR圖譜

由圖2可知，對于肌漿蛋白樣品3 200～3 600 cm-1范圍內(nèi)強(qiáng)而寬的吸收峰歸屬于分子間氫鍵伸縮振動；2 925 cm-1處的弱吸收峰歸屬于C—H伸縮振動；1 650、1 536、1 395、1 230 cm-1處吸收峰分別歸屬于蛋白酰胺I帶（80% C＝O伸展和10% C—N伸展，接近1 650 cm-1）[30]、酰胺II帶（60% N—H彎曲、30% C—N伸展和10% C—C伸展，接近1 551 cm-1）和酰胺III帶（40% C—N拉伸、30% N—H彎曲，接近1 300 cm-1）。肌漿蛋白樣品的3 413、3 283 cm-1和2 925、2 855 cm-1處吸收峰分別歸屬于O—H和C—H的拉伸。

圖2 不同回收方式鰱魚肌漿蛋白的FTIR圖譜Fig.2 FTIR spectra of sarcoplasmic proteins from silver carp recovered by different methods

酰胺I帶吸收峰所在的位置及其強(qiáng)度可以提供蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的信息：1 600～1 640、1 640～1 650、1 650～1 660、1 660～1 700 cm-1的條帶分別存在β-折疊、無規(guī)卷曲、α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角[31]。由圖3可知：不同回收方式肌漿蛋白具有不同二級結(jié)構(gòu)相對含量，PP的α-螺旋相對含量最少，體系pH值的變化會改變蛋白質(zhì)表面帶電氨基酸、α-羰基和α-氨基末端質(zhì)子化狀態(tài)，促使蛋白質(zhì)分子展開，這可能是導(dǎo)致肌漿蛋白二級結(jié)構(gòu)由有序向無序轉(zhuǎn)化的主要原因[32]；HP的β-折疊相對含量最高，加熱促使蛋白變性，破壞了氫鍵和靜電相互作用這些非共價鍵相互作用，導(dǎo)致β-折疊的相對含量降低，并同時使β-轉(zhuǎn)角的相對含量升高；IPP的無規(guī)卷曲相對含量最高，表明pH值變化有助于無規(guī)卷曲形成；FP的β-轉(zhuǎn)角和β-折疊相對含量相當(dāng)，CP的α-螺旋和無規(guī)卷曲相對含量相當(dāng)，PCP的β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲和β-折疊相對含量相當(dāng)，這些不同的現(xiàn)象可能是由于二級結(jié)構(gòu)取決于許多因素，包括主要二級結(jié)構(gòu)類型、蛋白質(zhì)性質(zhì)、變性程度、聚集狀態(tài)和回收條件等[33]。

圖3 不同回收方式鰱魚肌漿蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量Fig.3 Relative contents of secondary structures in sarcoplasmic proteins from silver carp recovered by different methods

2.5 不同回收方式鰱魚肌漿蛋白的色氨酸熒光光譜

色氨酸熒光發(fā)射光譜能夠靈敏反映蛋白質(zhì)的構(gòu)象和微環(huán)境的極性是否發(fā)生改變[34]。由圖4可知，不同回收方式肌漿蛋白的熒光強(qiáng)度從大到小依次為FP、IPP、PP、CP、PCP、HP。不同回收方式肌漿蛋白的最大吸收波長（λmax）從大到小依次為HP、IPP、CP、PP、FP、PCP。酸偏移耦合殼聚糖絮凝法和熱處理對肌漿蛋白的色氨酸內(nèi)源熒光光譜強(qiáng)度影響較其他回收方式較大。

圖4 不同回收方式鰱魚肌漿蛋白的色氨酸熒光光譜Fig.4 Tryptophan fluorescence spectra of sarcoplasmic proteins from silver carp recovered by different methods

色氨酸內(nèi)源熒光光譜中λmax紅移代表蛋白質(zhì)中色氨酸殘基微環(huán)境極性增強(qiáng)[35]。熱處理會導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的劇烈變化，在加熱過程中，肽鏈逐漸伸展，色氨酸殘基逐漸暴露在分子外部的極性環(huán)境內(nèi)[36]，蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光強(qiáng)度逐漸降低，產(chǎn)生熒光猝滅現(xiàn)象，λmax紅移[37]，這可能是HPλmax較大和熒光強(qiáng)度較小的原因。吳曉娟等[32]推斷，米糠蛋白的λmax隨酸偏移處理時間的延長而出現(xiàn)先紅移再藍(lán)移的原因為疏水相互作用使已暴露的疏水基團(tuán)重新聚集，從而使色氨酸殘基體系的非極性增強(qiáng)，這可能也是PCPλmax較小的原因。PCP的λmax和熒光強(qiáng)度明顯小于CP和PP，因此酸偏移和殼聚糖復(fù)合處理對肌漿蛋白熒光光譜的影響比酸偏移、殼聚糖絮凝單獨作用時的影響更大。

2.6 回收方式對鰱魚肌漿蛋白分子質(zhì)量分布的影響

SDS-PAGE是反映蛋白質(zhì)分子質(zhì)量變化的最直觀且便捷的方法之一，用于蛋白質(zhì)的亞基分子質(zhì)量分析[38]。有研究表明，冷凍干燥會降低羅非魚肌漿蛋白的總?cè)芙舛?，但是不會影響肌漿蛋白包含的所有蛋白質(zhì)分子是否可以溶于水的能力[39]。鰱魚水溶性蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量主要為30～97 kDa[40]，由圖5可知，僅有CP在70 kDa以上仍有多條較明顯的條帶，表明殼聚糖能與肌漿蛋白結(jié)合，絮凝出更大分子質(zhì)量的肌漿蛋白。PP、PCP和HP的35～40 kDa處條帶消失，歸因于肌漿蛋白在酸或熱處理條件下的變性及溶解度的下降。未溶解的蛋白質(zhì)成為電泳樣品離心后剩下的沉淀，不能進(jìn)入電泳條帶，所以一部分電泳條帶的灰度會因為蛋白質(zhì)的變性程度大而較淺，甚至可能不出現(xiàn)[41]。PP和PCP在10～15 kDa處的條帶顏色較深，歸因于部分蛋白解聚產(chǎn)生小分子質(zhì)量肽鏈[42]。PCP的40 kDa處的條帶較PP顏色深，這可能是因為殼聚糖和肌漿蛋白分子結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)亞基分子質(zhì)量增加并上移至40 kDa，也可能是由于PP在40 kDa處的溶解性較低。

圖5 不同回收方式鰱魚肌漿蛋白的SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE of sarcoplasmic proteins from silver carp recovered by different methods

2.7 回收方式對鰱魚肌漿蛋白表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)的表面疏水作用與其溶解性、乳化能力及乳化穩(wěn)定性之間具有密切關(guān)系。由圖6可知，不同回收方式肌漿蛋白的表面疏水性從大到小依次為HP、PCP、CP、PP、IPP、FP，分別為1 366.75、1 224.56、1 072.41、831.69、779.16和402.97，酸偏移、熱處理和殼聚糖絮凝對肌漿蛋白表面疏水性的影響較大。

圖6 不同回收方式鰱魚肌漿蛋白的表面疏水性Fig.6 Surface hydrophobicity of sarcoplasmic proteins from silver carp recovered by different methods

pH值變化使鰱魚肌漿蛋白分子伸展，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)變化和疏水基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)的表面疏水性增加，這可能是因為酸處理時使用的鹽酸溶液中陰離子Cl-能使蛋白質(zhì)溶液發(fā)生促溶效應(yīng)，使蛋白質(zhì)在鹽酸溶液的酸性環(huán)境中更易變性[43]。研究發(fā)現(xiàn)，鰱魚肌肉中的水溶性蛋白質(zhì)在加熱到40 ℃時，蛋白質(zhì)基團(tuán)如非極性氨基酸開始暴露，其表面疏水性開始增加，在70 ℃時達(dá)到最大值[44]，與本研究中HP的表面疏水性最大結(jié)果相符。

殼聚糖可以使鰱魚肌漿蛋白結(jié)構(gòu)展開，疏水基團(tuán)暴露，從而與ANS探針結(jié)合，使其表面疏水性增加。殼聚糖的添加可以提高蛋白質(zhì)的疏水相互作用[45]，但是當(dāng)多糖的添加量過大時，蛋白質(zhì)的疏水性反而可能降低。這可能是因為蛋白-多糖體系的黏度隨著多糖含量的增加而增加，導(dǎo)致展開的蛋白結(jié)構(gòu)又被包裹在復(fù)合體系中，從而導(dǎo)致體系的疏水相互作用減弱[46]。

2.8 回收方式對鰱魚肌漿蛋白溶解性的影響

由圖7可知，F(xiàn)P的溶解性最高，為64.66%，IPP和CP溶解性分別為16.91%和15.25%，PP、PCP、HP的溶解性較低，分別為4.64%、3.41%和3.16%，且差異不顯著。冷凍干燥會使肌漿蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使其與水分子的相互作用減少，溶解性降低[39]。Krasaechol等[5]報道金線魚凍干肌漿蛋白的溶解度約為45%，Kim等[47]報道巖魚凍干肌漿蛋白的溶解度約為60%。熱處理、pH值變化及殼聚糖絮凝都會導(dǎo)致肌漿蛋白的結(jié)構(gòu)改變，從而導(dǎo)致其溶解性下降，其中酸偏移和熱處理對肌漿蛋白溶解性的影響相比其他回收方式較大。歸因于PP和PCP都是通過調(diào)節(jié)pH值到3再到7進(jìn)行沉淀，導(dǎo)致PP和PCP在pH 7.0的磷酸鹽溶液中溶解性較低。You Juan等[48]也發(fā)現(xiàn)，加熱的鰱魚肌漿蛋白在pH 4.0～9.0時溶解性顯著低于未加熱組。

圖7 不同回收方式鰱魚肌漿蛋白的溶解性Fig.7 Solubility of sarcoplasmic proteins from silver carp recovered by different methods

2.9 回收方式對鰱魚肌漿蛋白起泡性的影響

起泡性可以簡單表征蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征。由圖8可知：FP的起泡性最高，為56.67%；IPP和CP的起泡性次之，分別為30%和28.33%，二者差異不顯著；PP的起泡性為12.22%，PCP和HP的起泡性最低，僅為3.67%和2.56%。蛋白質(zhì)的起泡性與溶解性有直接關(guān)系，溶解性最高的FP起泡性最好，而溶解性最低的PCP和HP起泡性也最差。熱處理、pH值變化和殼聚糖絮凝都可以引起肌漿蛋白的結(jié)構(gòu)改變，從而導(dǎo)致起泡性下降，其中酸偏移和熱處理對肌漿蛋白起泡性的影響比其他回收方式更大，前者歸因于蛋白質(zhì)水解引起的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和溶劑黏度降低[8]；后者歸因于HP的結(jié)構(gòu)變化，特別是表面疏水性增加（圖6）。酸偏移耦合殼聚糖絮凝促使PCP的表面疏水性增加，降低了其起泡性能，明顯低于PP和CP。

圖8 不同回收方式鰱魚肌漿蛋白的起泡性Fig.8 Foaming properties of sarcoplasmic proteins from silver carp recovered by different methods

2.10 回收方式對鰱魚肌漿蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

由圖9可知，經(jīng)殼聚糖絮凝后冷凍干燥得到的CP的EAI大于直接冷凍干燥得到的FP的EAI，表明殼聚糖有利于肌漿蛋白乳化性的改善，歸因于肌漿蛋白與殼聚糖發(fā)生相互作用，二者的復(fù)合物表面電荷增加，導(dǎo)致肌漿蛋白的乳化性增強(qiáng)[49]。IPP和FP的EAI無顯著差異，分別為6.56、6.63 m2/g，表明等電點沉淀法對肌漿蛋白的EAI影響較小，但會不利于肌漿蛋白的乳化穩(wěn)定性，這一結(jié)果與Yongsawatdigul等[39]的研究結(jié)果相近。HP、PP、PCP的EAI較低且無顯著差異。IPP的ESI顯著低于其他組，但由于PCP、PP及HP的EAI均較小，而ESI是由乳液10 min后吸光度和初始吸光度的比值表示，以致其細(xì)微的變化均會導(dǎo)致肌漿蛋白的ESI產(chǎn)生較大的變化。

圖9 不同回收方式鰱魚肌漿蛋白的EAI和ESIFig.9 EAI and ESI of sarcoplasmic proteins from silver carp recovered by different methods

3 結(jié)論

不同回收方式下鰱魚肌漿蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性不同。FP的總巰基含量、色氨酸內(nèi)源熒光強(qiáng)度、溶解性、起泡性較大，而PP和HP的總巰基含量、色氨酸內(nèi)源熒光強(qiáng)度、溶解性、起泡性較小。不同回收方式肌漿蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量不同，HP、FP的β-折疊相對含量較高，IPP、PP的無規(guī)卷曲相對含量較高，CP的β-轉(zhuǎn)角相對含量較高，所有回收肌漿蛋白的α-螺旋相對含量都較小，表明肌漿蛋白二級結(jié)構(gòu)由有序向無序不同程度轉(zhuǎn)化。SDS-PAGE結(jié)果表明，CP含有大分子質(zhì)量復(fù)合物，而PP會使部分蛋白解聚。CP乳化性最好，IPP對肌漿蛋白的EAI影響較小，但對肌漿蛋白的ESI影響較大，PCP的EAI低于CP。本研究揭示了鰱魚肌漿蛋白在不同回收方式下的結(jié)構(gòu)和功能特性變化規(guī)律，對改善肌漿蛋白的功能特性和拓寬其在食品工業(yè)的應(yīng)用范圍具有指導(dǎo)意義。