榛蘑多糖對(duì)乙醇所致大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

張俊慧，陳然然，叢 賀，沈明花

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

長(zhǎng)期大量飲酒是造成心血管疾病的主要原因之一[1-2]。長(zhǎng)期大量飲酒可引起脂類(lèi)代謝紊亂，從而增加心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[3]。內(nèi)皮細(xì)胞是血管內(nèi)膜的主要成分，是一種天然屏障，在調(diào)節(jié)血管張力以及白細(xì)胞黏附和血小板聚集過(guò)程中起重要作用，且在心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。因此，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能的損傷與眾多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。乙醇所致的脂類(lèi)代謝紊亂或其代謝過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，影響其結(jié)構(gòu)或功能。已有研究表明，大鼠慢性乙醇中毒會(huì)引起其腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變[6]。乙醇代謝過(guò)程中產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）[7]，后者引發(fā)氧化應(yīng)激，最終會(huì)引起細(xì)胞凋亡[8]。因此，調(diào)節(jié)乙醇所致的脂類(lèi)代謝紊亂或降低細(xì)胞ROS水平對(duì)保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及心血管疾病的防治具有重要意義。

榛蘑（Armillaria mellea）是一種藥食用菌，主要分布于我國(guó)內(nèi)蒙古、黑龍江和吉林等地區(qū)，具有抗氧化、降脂等功效[9-10]。前期研究表明，榛蘑多糖具有保護(hù)血管內(nèi)皮的作用[11-12]。乙醇對(duì)血管內(nèi)膜的損傷與氧化應(yīng)激和高血脂有關(guān)，而榛蘑多糖具有抗氧化及降脂作用。為探究榛蘑多糖是否對(duì)乙醇誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜損傷有保護(hù)作用，本研究以乙醇誘導(dǎo)血管內(nèi)膜損傷SD大鼠為模型，分析榛蘑多糖對(duì)血管內(nèi)膜的影響。旨在為榛蘑多糖對(duì)乙醇所致大鼠血管內(nèi)膜損傷的保護(hù)作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與試劑

清潔級(jí)SD大鼠40 只，體質(zhì)量為180～200 g，雌雄各半，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（吉）2017-0003，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照GB/T 35892—2018《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 福利倫理審查指南》執(zhí)行。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）購(gòu)于上海佛雷堡生物科技發(fā)展有限公司。

榛蘑多糖由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室提供；總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）、血清甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、內(nèi)皮素1（endothelin 1，ET-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；NO、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）檢測(cè)試劑盒 上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司；CCK8試劑盒 美國(guó)APExBio公司；ROS檢測(cè)試劑盒上海碧云天生物技術(shù)有限公司；AO/EB雙染色試劑盒、JC-1試劑盒 北京索萊寶生物科技有限公司；藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）偶聯(lián)Annexin-V凋亡檢測(cè)試劑盒 美國(guó)BD公司；B淋巴細(xì)胞瘤2蛋白（B cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、Caspase-3、β-actin一抗、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G（immunglobulin G，IgG）、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG美國(guó)Cell Signaling公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BX53F熒光倒置顯微鏡 日本Olympus株式會(huì)社；RT-2100酶標(biāo)儀 深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；c280化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) 美國(guó)Azure Biosystems公司；A00-1-1102流式細(xì)胞儀 美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及處理

將SD大鼠隨機(jī)平分為4 組，即正常對(duì)照組、損傷組、榛蘑多糖低劑量組和榛蘑多糖高劑量組。每日8:00，除正常對(duì)照組外其余各組大鼠按10 mL/kgmb以體積分?jǐn)?shù)40%乙醇灌胃，正常對(duì)照組使用生理鹽水代替。每日16:00，榛蘑多糖低、高劑量組分別按100、400 mg/kgmb灌胃榛蘑多糖溶液，正常對(duì)照組和損傷組均以等體積生理鹽水代替。連續(xù)灌胃4 周后大鼠禁食、禁水24 h。24 h后以烏拉坦麻醉大鼠，取頸動(dòng)脈，用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，并心臟采血用于血清學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3.2 頸動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀(guān)察

將大鼠頸動(dòng)脈用4%多聚甲醛溶液固定24 h，自來(lái)水沖洗，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片后進(jìn)行HE染色，在400 倍光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察血管組織的病理變化。

1.3.3 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

常規(guī)方法分離血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行T-CHO、TG、LDL-C、HDL-C、SOD、MDA、NO、eNOS、iNOS和ET-1水平的檢測(cè)。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)及存活率測(cè)定

將HUVEC培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。將HUVEC接種于96 孔板，分為對(duì)照組、乙醇組、榛蘑多糖低、高劑量組，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，每孔接種密度為1×105cells/mL。除對(duì)照組外，其余各組分別與終濃度600 μmol/mL乙醇作用12 h，對(duì)照組以RPMI-1640培養(yǎng)基代替。12 h后榛蘑多糖低、高劑量組分別與終質(zhì)量濃度100、400 μg/mL的榛蘑多糖作用24 h，對(duì)照組和乙醇組以RPMI-1640培養(yǎng)基代替。24 h后每孔加入10 μL CCK8溶液（試劑盒自帶）孵育1 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD450nm），細(xì)胞存活率按下式計(jì)算：

1.3.5 細(xì)胞ROS水平測(cè)定

將HUVEC以3×105cells/孔的密度接種于6 孔板，實(shí)驗(yàn)分組及處理同1.3.4節(jié)。將4 組細(xì)胞以不同方式處理后，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2 次。加入1 mL按照1 000∶1用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2′,7′-dichlorodih ydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）熒光探針，其終濃度為10 μmol/L，在37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。后棄上清液，使用PBS洗滌。每孔加入1 mL RPMI-1640，在480 nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀(guān)察并拍照，分析細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，該值代表細(xì)胞ROS水平。

1.3.6 JC-1染色法觀(guān)察線(xiàn)粒體跨膜電位水平

將HUVEC以3×105cells/孔的密度接種于24 孔板，實(shí)驗(yàn)分組及處理同1.3.4節(jié)。將4 組細(xì)胞以不同方式處理后，棄上清液，用PBS洗滌后分別加入250 μL無(wú)血清培養(yǎng)基和JC-1染色工作液，37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。30 min后棄上清液，用JC-1染色緩沖液洗滌。加無(wú)血清培養(yǎng)液500 μL，在515、585 nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀(guān)察并拍照，計(jì)算585、515 nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度比值，該值代表線(xiàn)粒體跨膜電位水平。

1.3.7 AO/EB染色法觀(guān)察細(xì)胞凋亡

將HUVEC接種于6 孔板爬片，細(xì)胞分組及處理同1.3.4節(jié)。按說(shuō)明書(shū)加入AO/EB工作液，在室溫放置5 min。封片后在熒光顯微鏡下觀(guān)察拍照。

1.3.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將HUVEC接種于6 孔板，細(xì)胞分組及處理同1.3.4節(jié)。小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到離心管中備用，每孔加入0.5 mL胰酶置于培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞，至細(xì)胞可以被輕輕吹打下來(lái)時(shí)，加入收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有貼壁細(xì)胞，再次收集到離心管內(nèi)，1 000×g離心3 min，沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2 次，然后以1×106cells/mL將細(xì)胞重懸于Annexin V結(jié)合緩沖液中。取100 μL細(xì)胞懸液，加入PE標(biāo)記的Annexin V和7-氨基放線(xiàn)菌素D（7-aminoactinomycin D，7-AAD）各5 μL，室溫下避光孵育15 min。加入400 μL Annexin V結(jié)合緩沖液，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.3.9 蛋白免疫印跡法檢測(cè)Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3的表達(dá)水平

將HUVEC接種于培養(yǎng)皿，實(shí)驗(yàn)分組及處理方法同1.3.4節(jié)。收集各組細(xì)胞后用PBS洗滌并用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)。用BCA法進(jìn)行蛋白定量后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用5 g/100 mL脫脂乳粉將聚偏氟乙烯膜室溫封閉2 h，加入相應(yīng)的一抗，于4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST緩沖液洗滌后加入二抗，室溫孵育1 h。最后進(jìn)行沖洗、顯影。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表示差異具有顯著意義。使用ImageJ軟件進(jìn)行細(xì)胞熒光強(qiáng)度分析，使用Graphpad Prism 9.5.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 頸動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀(guān)察結(jié)果

由圖1可知，正常對(duì)照組大鼠頸動(dòng)脈結(jié)構(gòu)正常，血管內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整并且內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性良好。經(jīng)乙醇誘導(dǎo)后損傷組血管明顯收縮，管腔變窄，內(nèi)皮細(xì)胞脫落明顯。表明所用的乙醇劑量可引起血管內(nèi)皮的損傷。與損傷組相比，經(jīng)榛蘑多糖處理后內(nèi)膜較完整，內(nèi)皮細(xì)胞脫落現(xiàn)象得到明顯改善，表明榛蘑多糖有一定的血管內(nèi)膜保護(hù)作用。

圖1 大鼠頸動(dòng)脈HE染色結(jié)果（×400）Fig.1 Morphological observation of carotid artery in rats (× 400)

2.2 榛蘑多糖對(duì)乙醇誘導(dǎo)大鼠血脂水平的影響

血清T-CHO、TG、LDL-C和HDL-C水平可以反映機(jī)體脂類(lèi)代謝水平[13]。大量飲酒可引起脂類(lèi)代謝紊亂[14]，而血脂異常是內(nèi)皮受損的誘因[15]。由表1可知，與正常對(duì)照組相比，經(jīng)乙醇處理后大鼠血清T-CHO、TG、LDL-C水平極顯著升高（P＜0.01），HDL-C水平極顯著降低（P＜0.01），表明乙醇引起脂類(lèi)代謝的紊亂并進(jìn)一步影響血管內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)及功能。用不同劑量的榛蘑多糖干預(yù)后可逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo)的變化，說(shuō)明榛蘑多糖具有一定的降脂作用。研究表明，榛蘑多糖通過(guò)降低血脂改善糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生[16]，與本研究中榛蘑多糖的降脂作用相符。

表1 榛蘑多糖對(duì)乙醇誘導(dǎo)大鼠血清T-CHO、TG、LDL-C和HDL-C濃度的影響Table 1 Effects of Armillaria mellea polysaccharides on T-CHO,TG,LDL-C and HDL-C concentrations in serum of ethanol-induced rats mmol/L

2.3 榛蘑多糖對(duì)乙醇誘導(dǎo)大鼠血清e(cuò)NOS、iNOS及NO水平的影響

研究表明，乙醇及其代謝過(guò)程中產(chǎn)生的ROS可以激活NOS。此外，乙醇對(duì)精氨酸酶的抑制作用促進(jìn)L-精氨酸轉(zhuǎn)變成NO[17]。由表2可知，損傷組大鼠iNOS和NO水平極顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01），這可能與乙醇所致的氧化應(yīng)激有關(guān)。有研究表明，乙醇上調(diào)iNOS，促進(jìn)主動(dòng)脈環(huán)收縮[18]，這與本研究結(jié)果相符。經(jīng)榛蘑多糖干預(yù)后，與損傷組相比，高劑量組iNOS和NO水平極顯著降低（P＜0.01），而各組之間eNOS水平無(wú)顯著差異。在生理?xiàng)l件下，eNOS催化NO生成，調(diào)節(jié)血管舒張及血小板聚集[19]。在氧化應(yīng)激、炎癥等刺激下iNOS被激活，產(chǎn)生大量NO，繼發(fā)產(chǎn)生過(guò)氧亞硝基陰離子（ONOO-），引起細(xì)胞損傷[20-21]。因此，降低iNOS活性對(duì)氧化應(yīng)激所致細(xì)胞損傷具有一定積極意義。本研究結(jié)果表明，乙醇誘導(dǎo)后iNOS水平顯著增高，產(chǎn)生過(guò)量NO，后者氧化產(chǎn)生的產(chǎn)物直接損傷血管內(nèi)膜。而經(jīng)榛蘑多糖干預(yù)后，抑制乙醇所致的iNOS活性升高，以及NO過(guò)度生成，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，這與本研究的HE染色結(jié)果相符。

表2 榛蘑多糖對(duì)乙醇誘導(dǎo)大鼠血清e(cuò)NOS、iNOS及NO水平的影響Table 2 Effects of Armillaria mellea polysaccharides on the levels of eNOS,iNOS and NO in serum of ethanol-induced rats

2.4 榛蘑多糖對(duì)乙醇誘導(dǎo)大鼠血清ET-1、SOD和MDA水平的影響

ET-1是一種血管收縮物質(zhì)，主要由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和釋放，可作為檢測(cè)內(nèi)皮功能障礙的指標(biāo)[22]。SOD作為重要的抗氧化酶，可以清除體內(nèi)的超氧陰離子[23]。MDA是一種脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，可以間接反映細(xì)胞受自由基攻擊的程度。乙醇的代謝過(guò)程中產(chǎn)生ROS[7]，而過(guò)量ROS可引起細(xì)胞氧化損傷。因此，提高機(jī)體的抗氧化水平對(duì)乙醇所致的細(xì)胞氧化損傷有保護(hù)作用。由表3可知，與正常對(duì)照組相比，乙醇處理后ET-1和MDA水平極顯著升高，而SOD活性極顯著下降（P＜0.01）。然而，與損傷組相比，經(jīng)榛蘑多糖干預(yù)后，高劑量組大鼠血清ET-1和MDA水平顯著降低，SOD活性顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，榛蘑多糖通過(guò)提高抗氧化酶活性抑制氧化損傷，從而保護(hù)血管內(nèi)膜，與本研究中血管內(nèi)膜病理改變結(jié)果相符。

表3 榛蘑多糖對(duì)乙醇誘導(dǎo)大鼠血清ET-1、SOD和MDA水平的影響Table 3 Effects of Armillaria mellea polysaccharides on the levels of ET-1,SOD and MDA in serum of ethanol-induced rats

2.5 榛蘑多糖對(duì)乙醇誘導(dǎo)HUVEC存活率的影響

由圖2可知，在體外實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)乙醇處理后細(xì)胞存活率顯著下降，說(shuō)明600 μmol/mL乙醇有一定的內(nèi)皮毒性。榛蘑多糖干預(yù)后細(xì)胞存活率逐漸提高，高劑量組平均存活率極顯著高于乙醇組（P＜0.01），提示榛蘑多糖可以保護(hù)乙醇所致的細(xì)胞損傷。

圖2 榛蘑多糖對(duì)HUVEC存活率的影響Fig.2 Effect of Armillaria mellea polysaccharides on HUVEC viability

2.6 榛蘑多糖對(duì)乙醇誘導(dǎo)HUVEC ROS水平的影響

DCFH-DA常用于細(xì)胞ROS水平的檢測(cè)[24]。DCFH-DA在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)酯酶水解生成DCFH，后者被ROS氧化生成具有綠色熒光的2′,7′-二氯熒光素，其熒光強(qiáng)度可以反映細(xì)胞ROS水平。由圖3可知，乙醇作用后細(xì)胞ROS水平極顯著升高（P＜0.01），而榛蘑多糖干預(yù)后高劑量組ROS水平較乙醇組極顯著降低（P＜0.01）。過(guò)量ROS可促進(jìn)不飽和脂肪酸的氧化，導(dǎo)致MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物增多。榛蘑多糖可能通過(guò)提高SOD等抗氧化酶活性，清除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，從而保護(hù)細(xì)胞，這與2.4、2.5節(jié)得到的結(jié)果相符。

圖3 榛蘑多糖對(duì)HUVEC ROS水平的影響Fig.3 Effect of Armillaria mellea polysaccharides on ROS levels in HUVEC

2.7 榛蘑多糖對(duì)乙醇誘導(dǎo)HUVEC線(xiàn)粒體跨膜電位的影響

線(xiàn)粒體是細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)代謝和能量代謝的主要細(xì)胞器。線(xiàn)粒體跨膜電位可以反映線(xiàn)粒體功能，其水平的降低是線(xiàn)粒體功能障礙的標(biāo)志之一[25]。本研究用JC-1熒光探針檢測(cè)線(xiàn)粒體跨膜電位水平。當(dāng)線(xiàn)粒體跨膜電位高時(shí)JC-1以聚合體的形式存在，發(fā)出紅色熒光；而其水平降低時(shí)JC-1則以單體形式存在，產(chǎn)生綠色熒光。JC-1紅/綠熒光比值可以反映線(xiàn)粒體跨膜電位相對(duì)水平。由圖4可知，與對(duì)照組相比，乙醇組綠色熒光顯著增強(qiáng)，JC-1紅/綠熒光比值極顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明乙醇引起ROS水平的升高并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，引起線(xiàn)粒體跨膜電位降低；而與乙醇組相比，榛蘑多糖高劑量組綠色熒光強(qiáng)度減弱，JC-1紅/綠熒光比值極顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明榛蘑多糖可以抑制乙醇所致的線(xiàn)粒體跨膜電位降低，這可能與其清除ROS作用有關(guān)。

圖4 榛蘑多糖對(duì)HUVEC線(xiàn)粒體跨膜電位的影響Fig.4 Effects of Armillaria mellea polysaccharides on mitochondrial membrane potential in HUVEC

2.8 榛蘑多糖對(duì)乙醇誘導(dǎo)HUVEC凋亡的影響

研究表明，乙醇所致的氧化損傷會(huì)引起細(xì)胞凋亡[26]。由圖5A可知，正常對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常，呈梭形，細(xì)胞核呈均勻綠色熒光；乙醇組細(xì)胞失去正常結(jié)構(gòu)、明顯變小變圓，細(xì)胞核固縮并呈黃綠色，呈凋亡細(xì)胞形態(tài)，提示乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。與乙醇組相比，經(jīng)榛蘑多糖干預(yù)后可見(jiàn)凋亡細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞形態(tài)趨于正常，說(shuō)明榛蘑多糖可以抑制乙醇所致的細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步觀(guān)察榛蘑多糖對(duì)乙醇所致細(xì)胞凋亡的影響，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。由圖5B～C可知，與對(duì)照組相比，乙醇作用后細(xì)胞凋亡率極顯著增加（P＜0.01），而榛蘑多糖干預(yù)后細(xì)胞凋亡減少，榛蘑多糖高劑量組作用尤為顯著，與圖5A結(jié)果相一致。線(xiàn)粒體跨膜電位是觀(guān)察早期細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)[27]。榛蘑多糖抑制乙醇所致的線(xiàn)粒體跨膜電位降低，從而可以解釋減少細(xì)胞凋亡的結(jié)果。

圖5 榛蘑多糖對(duì)HUVEC凋亡的影響Fig.5 Effect of Armillaria mellea polysaccharides on apoptosis in HUVEC

2.9 榛蘑多糖對(duì)乙醇誘導(dǎo)HUVEC凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3表達(dá)的影響

線(xiàn)粒體凋亡是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一[28]。Bax、Bcl-2和Caspase-3介導(dǎo)線(xiàn)粒體凋亡途徑[29]。Bax和Bcl-2調(diào)控線(xiàn)粒體膜的通透性，調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而影響Caspase-3的活化。由圖6可知，與對(duì)照組相比，乙醇極顯著下調(diào)Bcl-2表達(dá)，極顯著上調(diào)Bax和Cleaved caspase-3水平（P＜0.01）。與乙醇組相比，經(jīng)榛蘑多糖干預(yù)后上調(diào)Bcl-2表達(dá)水平、降低Bax和Cleaved caspase-3表達(dá)并降低Bax/Bcl-2。上述結(jié)果提示，榛蘑多糖通過(guò)調(diào)控線(xiàn)粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。

圖6 榛蘑多糖對(duì)Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3表達(dá)的影響Fig.6 Effects of Armillaria mellea polysaccharides on the expression of Bax,Bcl-2 and cleaved caspase-3

3 結(jié)論

血管內(nèi)膜作為直接與乙醇或其代謝產(chǎn)物接觸的部位，是乙醇毒性作用的靶點(diǎn)。本研究以體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液灌胃4 周的方法建立大鼠血管內(nèi)膜損傷模型，分析榛蘑多糖對(duì)血管內(nèi)膜的保護(hù)作用。結(jié)果表明，乙醇作用后大鼠血管明顯收縮、管腔變窄、可見(jiàn)部分內(nèi)皮細(xì)胞脫落，ET-1水平升高，提示乙醇誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜損傷模型建立成功。同時(shí)，損傷組大鼠的T-CHO、TG、LDL-C、NO、MDA水平顯著升高，表明乙醇引起脂代謝紊亂并引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，600 μmol/mL的乙醇降低細(xì)胞存活率、提高細(xì)胞ROS水平、降低線(xiàn)粒體跨膜電位，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bax、Bcl-2和Caspase-3是介導(dǎo)線(xiàn)粒體凋亡途徑的重要蛋白。Bax/Bcl-2的增加促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放，后者介導(dǎo)凋亡復(fù)合體的形成，進(jìn)而活化Caspase-3，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。線(xiàn)粒體跨膜電位的下降是線(xiàn)粒體凋亡途徑的早期事件。經(jīng)不同劑量榛蘑多糖干預(yù)后減輕了血管內(nèi)膜的氧化損傷，降低細(xì)胞ROS水平、抑制乙醇所致的線(xiàn)粒體跨膜電位下降，從而抑制細(xì)胞凋亡，這可能與其下調(diào)Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3有關(guān)。綜上所述，榛蘑多糖對(duì)乙醇誘導(dǎo)的大鼠血管內(nèi)膜損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其降脂、抗氧化和抗凋亡作用有關(guān)，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。