釀酒酵母對(duì)濃香型白酒發(fā)酵過程中微生物群落演替的影響機(jī)制

王雙慧，馬世源，李子健,2，宋 川，代漢聰，邵 燕，黃 丹,2，羅惠波,2,*

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000；3.四川省瀘州市瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646699）

濃香型白酒是傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵蒸餾酒，在其獨(dú)特的釀造系統(tǒng)中，非生物變化結(jié)合生物因素驅(qū)動(dòng)微生物組裝、演替和自我馴化，最終形成穩(wěn)定的、具有釀造功能的特殊微生物群落[1]。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是白酒釀造重要的功能菌，具有產(chǎn)醇、產(chǎn)酯等多種功能[2]，缺乏釀酒酵母會(huì)導(dǎo)致微生物群落的紊亂，擾動(dòng)生態(tài)系統(tǒng)[3]，最終影響微生物的自然演替。

在長(zhǎng)期的白酒釀造過程中，酒醅微生物經(jīng)歷了高度動(dòng)態(tài)的演替變化，包括物種擴(kuò)散、物種相互作用、物種相對(duì)豐度變化和新物種的進(jìn)化等[4]，形成內(nèi)外部的動(dòng)態(tài)平衡。然而，環(huán)境條件發(fā)生變化會(huì)破壞原有的微生態(tài)平衡，導(dǎo)致微生物群落生態(tài)位結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[5]。通過生物擾動(dòng)實(shí)現(xiàn)環(huán)境條件的改變是目前常用的方法，并在描述微生物群落演替及其相互作用方面取得了顯著進(jìn)展[6]。例如，He Guiqiang等[7]發(fā)現(xiàn)，添加芽孢桿菌能夠提高濃香型白酒微生物系統(tǒng)種間相互作用的多樣性和復(fù)雜性，Mu Yu等[8]發(fā)現(xiàn)微生物的聚集格局和生態(tài)位寬度密切相關(guān)。然而，微生物群落演替發(fā)生變化的機(jī)制尚不清楚。研究表明，確定性過程（如生物選擇和非生物選擇）以及隨機(jī)性過程（如擴(kuò)散和漂變）都決定著微生物群落的聚集[9]，對(duì)微生物組裝過程的分析將有助于對(duì)微生物群落演替變化的認(rèn)識(shí)。例如，馬靜等[10]發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落組裝以確定性過程為主導(dǎo)，同質(zhì)性選擇貢獻(xiàn)最大。而決定微生物群落組裝的主要驅(qū)動(dòng)力為生態(tài)位寬度[11]，生態(tài)位寬度是指一個(gè)種群（或其他生物單位）在一個(gè)群落中所利用的各種不同資源的總和，是影響群落中物種分類相對(duì)重要性的關(guān)鍵特征[12]。因此，對(duì)于微生物生態(tài)位寬度的研究將有助于理解群落演替規(guī)律。以往的研究多是關(guān)于濃香型白酒中不同的功能微生物對(duì)白酒風(fēng)味等的影響，然而關(guān)于釀酒酵母如何影響微生物群落生態(tài)位結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致群落演替發(fā)生變化的研究較少。

本研究以酒醅微生物群落為研究對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建添加釀酒酵母濃香型白酒釀造的多菌共酵體系，采用擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)探究對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的微生物群落結(jié)構(gòu)變化，利用生物信息統(tǒng)計(jì)學(xué)分析探究釀酒酵母對(duì)微生物群落生態(tài)位的影響，從而了解釀酒酵母如何影響微生物群落演替，以期提高對(duì)濃香型白酒釀造微生物群落生態(tài)系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母從濃香型白酒酒醅中篩選得到。入窖酒醅、黃水 四川省某酒廠。

磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀 成都市科隆化學(xué)品有限公司；異丙醇 北京索萊寶科技有限公司；所用試劑均為分析純；E.Z.N.A.Soil DNA Kit 美國(guó)Omega BioTek公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LYNX 6000高速冷凍離心機(jī)、UV-1200紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；PR224ZH電子天平上海奧豪斯儀器有限公司；DZKW-4恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

取酒廠的入窖糟醅，分裝至滅菌后的磨口瓶中，裝瓶量為0.5 kg，加入3%的黃水。將實(shí)驗(yàn)組（experiment group，EG）加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%糟醅、濃度107CFU/mL的釀酒酵母菌液，空白組（control group，CG）用水補(bǔ)足，分別混合均勻。CG組15 瓶，EG組15 瓶，密封后放入培養(yǎng)箱中發(fā)酵。參考生產(chǎn)中酒醅溫度變化進(jìn)行培養(yǎng)，30～33 ℃發(fā)酵3 d，33～35 ℃發(fā)酵5 d，35～38 ℃發(fā)酵15 d，38 ℃發(fā)酵至第40天。取發(fā)酵0、8、16、23、40 d的樣品進(jìn)行檢測(cè)和后續(xù)分析，樣品保存于-80 ℃。

1.3.2 酒醅DNA的提取和測(cè)序

稱取7 g樣品于50 mL離心管中（每個(gè)樣品稱取3 份），加入28 mL磷酸鹽緩沖液洗滌后渦旋振蕩5 min，室溫下100 r/min離心3 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的50 mL離心管中，重復(fù)洗滌1 次。將轉(zhuǎn)移的上清液于室溫下10 000 r/min離心5 min，棄上清液保留沉淀。將沉淀根據(jù)E.Z.N.A.Soil DNA Kit的操作說明提取各樣品中的DNA。以酒醅總基因組DNA為模板，分別以引物對(duì)338F（5′-ACTCCTACGGGA GGCAGCA-3′）、806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因序列中的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增[13]，引物對(duì)ITS5F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）、ITS1R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對(duì)真菌ITS1區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。由上海美吉生物科技有限公司在Illumina MiSeq 2500平臺(tái)上進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，Wilcoxon test對(duì)微生物進(jìn)行顯著性分析，零模型分析群落組裝機(jī)制，使用Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖繪制，其他數(shù)據(jù)可視化均使用R語言（V4.2.2）軟件和Origin 2021軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母對(duì)酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 釀酒酵母對(duì)酒醅微生物多樣性的影響

通過多樣性指數(shù)和主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）了解釀酒酵母對(duì)微生物群落α多樣性和β多樣性的影響。由圖1A、B可知，在發(fā)酵過程中，真菌多樣性指數(shù)變化較小，總體呈逐漸增加后平穩(wěn)趨勢(shì)，細(xì)菌多樣性變化較大，在發(fā)酵第8天顯著降低，后期逐漸升高趨于平穩(wěn)。EG的細(xì)菌和真菌多樣性均低于CG，釀酒酵母降低微生物群落的多樣性。由圖1C、D可知，PCoA顯示EG和CG發(fā)酵醅的真菌和細(xì)菌群落均有明顯分離，差異顯著（P＜0.05），其中真菌的差異極顯著（P＜0.01），說明釀酒酵母對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)組成造成差異，特別是對(duì)真菌群落多樣性的影響大于細(xì)菌群落。微生物多樣性和組成在發(fā)酵過程中發(fā)生很大變化，表明在濃香型白酒發(fā)酵過程中釀酒酵母的相對(duì)含量會(huì)對(duì)群落多樣性造成影響。

圖1 酒醅發(fā)酵過程中CG和EG的微生物群落多樣性Fig.1 Microbial community diversity in CG and EG during the fermentation of fermented grains

2.1.2 釀酒酵母對(duì)酒醅微生物群落相對(duì)組成的影響

由圖2A可知，從微生物群落組成來看，占比最高的優(yōu)勢(shì)真菌物種為子囊菌門（Ascomycota），其次為擔(dān)子菌門（Basidiomycota），CG和EG的Ascomycota相對(duì)豐度無明顯差異，但Basidiomycota在EG中的相對(duì)豐度較CG稍低。由圖2B可知，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌物種為乳酸桿菌（Lactobacillus）、類芽孢桿菌（Paenibacillus）和醋酸桿菌（Acetobacter）。其中，EGLactobacillus相對(duì)豐度大于CG，在發(fā)酵第8天時(shí)相對(duì)豐度超過99%，但Paenibacillus在CG中的相對(duì)豐度大于EG。由圖2C、D可知，發(fā)酵過程中，EG和CG共有真菌197 種、細(xì)菌243 種，CG的細(xì)菌和真菌物種數(shù)量均高于EG，表明釀酒酵母降低濃香型白酒發(fā)酵過程物種多樣性。

圖2 酒醅發(fā)酵過程中CG和EG的微生物群落組成Fig.2 Microbial community composition in CG and EG during the fermentation of fermented grains

釀酒酵母對(duì)微生物群落物種組成造成影響，基于組間差異檢驗(yàn)方法（Wilcoxon秩和檢驗(yàn)）獲得組間具有顯著差異的物種信息。CG和EG的差異真菌共15 種，極顯著差異真菌有10 種，包括伊薩酵母屬（Issatchenkia）、曲霉屬（Aspergillus）、酵母屬（Saccharomyces）和孢圓酵母屬（Torulaspora）等，其中除釀酒酵母外其他極顯著差異真菌的相對(duì)豐度均為CG高于EG（圖3A）。由圖3B可知，CG和EG中極顯著差異細(xì)菌共5 種，包括Acetobacter、湖沉積桿菌屬（Limnobacter）、嗜氨菌（Ammoniphilus）、短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）和unclassified_f__Micrococcaceae，差異細(xì)菌的相對(duì)豐度均為EG高于CG。結(jié)果表明，釀酒酵母會(huì)降低濃香型白酒發(fā)酵過程中一些物種的相對(duì)豐度，使其成為CG和EG的顯著差異微生物。釀酒酵母添加后產(chǎn)乙醇和產(chǎn)酸菌等發(fā)生顯著差異，這可能會(huì)導(dǎo)致酒醅群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，對(duì)發(fā)酵過程中群落生態(tài)結(jié)構(gòu)造成影響。

圖3 酒醅發(fā)酵過程中CG和EG的微生物群落物種差異分析Fig.3 Analysis of differential microbial community species between CG and EG during the fermentation of fermented grains

2.2 釀酒酵母對(duì)酒醅微生物生態(tài)位的影響

2.2.1 釀酒酵母對(duì)酒醅微生物群落生態(tài)位寬度的影響

生態(tài)位寬度是細(xì)菌和真菌群落聚集的主要驅(qū)動(dòng)力[11]，釀酒酵母對(duì)濃香型白酒發(fā)酵過程中的微生物群落生態(tài)位寬度具有影響。由圖4可知，CG的真菌和細(xì)菌生態(tài)位寬度均高于EG，說明釀酒酵母會(huì)降低微生物群落的生態(tài)位寬度，釀酒酵母對(duì)發(fā)酵過程中真菌和細(xì)菌生態(tài)位寬度具有不同程度的影響。其中真菌的生態(tài)位寬度高于細(xì)菌，并且釀酒酵母明顯降低了真菌的生態(tài)位寬度。真菌生態(tài)位寬度的變化大于細(xì)菌，說明釀酒酵母對(duì)真菌群落的影響大于細(xì)菌。生態(tài)位寬度具有顯著差異表明其對(duì)環(huán)境變化具有更高的適應(yīng)性和抵抗力[8]，并且細(xì)菌生態(tài)位寬度比真菌窄，說明真菌可以更廣泛地利用有效資源[14]。

圖4 釀酒酵母對(duì)微生物群落生態(tài)位寬度變化的影響Fig.4 Effect of Saccharomyces cerevisiae on the change in niche breadth of microbial community

造成生態(tài)位寬度降低的原因可能為環(huán)境中的可利用資源變豐富，微生物有選擇性地利用資源[15]。EG和CG的群落生態(tài)位發(fā)生變化，EG微生物生態(tài)位寬度降低，說明釀酒酵母對(duì)群落構(gòu)建的影響表現(xiàn)在使群落物種間的物種分布相對(duì)集中且數(shù)量減少，競(jìng)爭(zhēng)能力變?nèi)?，物種對(duì)環(huán)境變化的敏感度降低[16]，環(huán)境耐受性的變化使物種生態(tài)位發(fā)生變化[17]。這些結(jié)果表明，濃香型白酒發(fā)酵過程中，微生物受釀酒酵母的影響，生態(tài)位寬度發(fā)生變化，對(duì)環(huán)境的敏感程度也發(fā)生變化，釀酒酵母的添加擾動(dòng)微生物的群落構(gòu)建。

2.2.2 釀酒酵母對(duì)酒醅微生物不同生態(tài)位寬度類群的影響

微生物物種可根據(jù)其適應(yīng)不同生態(tài)位的能力劃分為不同的生態(tài)類群[18]。為進(jìn)一步研究生態(tài)位寬度的變化，分別研究釀酒酵母對(duì)不同生態(tài)位寬度類群微生物的影響。將生態(tài)位寬度大于3的物種劃分為泛化種，生態(tài)位寬度小于1.5的物種劃分為特化種，其他劃分為普通種[19]。

由圖5A可知，釀酒酵母影響不同生態(tài)位寬度的微生物相對(duì)豐度，真菌的泛化種相對(duì)豐度由94.4%降低至84.1%，而特化種相對(duì)豐度由0.8%增加至3.1%。由圖5B可知，細(xì)菌的泛化種相對(duì)豐度由95.6%降低至82.7%，而特化種相對(duì)豐度由1.4%增加至2.7%。由圖5C可知，不同類別物種的相對(duì)豐度變化也直觀地表明EG的普通種含量增加，泛化種的含量減少。群落生態(tài)位寬度會(huì)直接影響物種豐富度[20]，微生物多樣性的變化可能與生態(tài)位的變化有關(guān)[21]。

圖5 釀酒酵母對(duì)微生物群落生態(tài)位的影響Fig.5 Effect of Saccharomyces cerevisiae on the niche of microbial community

2.2.3 釀酒酵母對(duì)酒醅不同生態(tài)位寬度類群微生物群落網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響

特定生態(tài)位內(nèi)微生物會(huì)形成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)[22]，為多方面研究釀酒酵母與群落中的泛化種、普通種和特化種之間的關(guān)系，構(gòu)建微生物網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)分析是量化微生物相互作用的穩(wěn)健、有效方法[23]，基于Spearman相關(guān)性系數(shù)的網(wǎng)絡(luò)包括泛化種、普通種和特化種（P＜0.05，|r|＞0.6）。

由圖6A可知，CG的生態(tài)位寬度網(wǎng)絡(luò)共分為4 個(gè)模塊、52 個(gè)節(jié)點(diǎn)、106 條邊，模塊化系數(shù)為0.566。由圖6B可知，不同生態(tài)位寬度的物種分布在各模塊，其中模塊2和模塊4中全是泛化種，特化種僅在模塊1中出現(xiàn)，普通種在模塊1和模塊3中出現(xiàn)。由圖6C可知，EG網(wǎng)絡(luò)中的主要模塊數(shù)量增加，共分為6 個(gè)主要模塊、56 個(gè)節(jié)點(diǎn)、167 條邊，模塊化系數(shù)為0.497。由圖6D可知，泛化種除在模塊6中不存在外，在其他模塊中均存在，且相對(duì)豐度最高，特化種在模塊1、模塊3和模塊6中出現(xiàn)且在模塊6中的相對(duì)豐度最高，普通種在6 個(gè)模塊中均存在且在模塊3中的相對(duì)豐度最高。

圖6 不同生態(tài)位寬度微生物網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Microbial community networks with different niche widths

CG網(wǎng)絡(luò)主要模塊中以泛化種為主，而EG網(wǎng)絡(luò)主要模塊中特化種的相對(duì)豐度明顯增加。表明在EG網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，特化種可能在維持生態(tài)群落的結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮作用[24]。這些結(jié)果說明，釀酒酵母增強(qiáng)了特化種在微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的功能，降低了網(wǎng)絡(luò)的模塊化程度，使得內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)降低，加劇了網(wǎng)絡(luò)的不穩(wěn)定性[25]，但網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性增強(qiáng)。不同生態(tài)位寬度的物種在不同模塊中的分布具有差異，這種差異主要由發(fā)酵醅中釀酒酵母的變化解釋。

2.3 釀酒酵母對(duì)酒醅微生物群落組裝的影響

微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)變化受組裝機(jī)制的影響，因此利用組裝機(jī)制探究釀酒酵母如何影響微生物群落變化。并且微生物的空間周轉(zhuǎn)和群落聚集受不同生態(tài)機(jī)制調(diào)控，因此有必要分析隨機(jī)過程和確定性過程對(duì)微生物群落組裝機(jī)制的相對(duì)貢獻(xiàn)[26]。通過零模型分析，綜合評(píng)價(jià)釀酒酵母對(duì)發(fā)酵過程中微生物群落組裝的影響，利用平均最近分類單元指數(shù)（β-nearest taxon index，βNTI）量化釀酒酵母對(duì)酒醅群落聚集格局的影響[27]。如圖7A所示，隨機(jī)過程（|βNTI|＜2）和確定性過程（|βNTI|＞2）共同決定了微生物群落的聚集，但主要是隨機(jī)過程主導(dǎo)。

圖7 酒醅發(fā)酵過程中CG和EG的微生物群落組裝Fig.7 Microbial community assembly in CG and EG during the fermentation of fermented grains

為進(jìn)一步確定不同生態(tài)過程對(duì)群落組裝的貢獻(xiàn)，利用Raup-Crick指數(shù)（RCbary值）確定不同生態(tài)過程的相對(duì)重要性[28]。由圖7B、C可知，釀酒酵母對(duì)群落生態(tài)過程具有影響，生態(tài)漂移對(duì)群落演替的貢獻(xiàn)從58.83%降低為46.15%，均勻質(zhì)擴(kuò)散從20.59%降低至10.26%，擴(kuò)散限制從8.82%增加到20.51%，同質(zhì)選擇從0.00%增加至5.13%，異質(zhì)選擇從11.76%增加至17.95%。釀酒酵母提升了擴(kuò)散限制、同質(zhì)選擇、異質(zhì)選擇3 種生態(tài)過程對(duì)群落構(gòu)建的貢獻(xiàn)，但降低了生態(tài)漂移和均勻質(zhì)擴(kuò)散對(duì)群落構(gòu)建的重要性，表明釀酒酵母促使微生物的群落演替更具確定性[29]。

確定性過程和隨機(jī)過程可以共同調(diào)節(jié)微生物群落的聚集，對(duì)群落組裝的相對(duì)貢獻(xiàn)隨環(huán)境條件的變化而變化[30]。而釀酒酵母相對(duì)含量的變化使得異質(zhì)選擇從無到有，這可能導(dǎo)致群落之間的結(jié)構(gòu)更加相似[31]。結(jié)果表明，釀酒酵母能夠改變?nèi)郝涞纳姝h(huán)境，從而造成群落組裝機(jī)制的差異。同時(shí)，這種生態(tài)位變化、異質(zhì)性選擇等可能會(huì)影響微生物之間的相互作用，造成網(wǎng)絡(luò)模塊的差異[32]。由此可知，釀酒酵母對(duì)微生物群落多樣性、物種組成等的影響可能是由于群落組裝機(jī)制的變化。

3 結(jié)論

釀酒酵母顯著改變濃香型白酒發(fā)酵過程中酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)，擾動(dòng)濃香型白酒發(fā)酵過程中的群落演替。釀酒酵母相對(duì)豐度的變化使微生物群落組成發(fā)生變化，不但降低微生物群落的多樣性，而且降低微生物生態(tài)位寬度。但在微生物網(wǎng)絡(luò)中，釀酒酵母能夠增加特化種在主要模塊中的相對(duì)豐度，增強(qiáng)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。造成微生物群落演替發(fā)生上述變化歸因于群落組裝的變化。微生物組裝主要由隨機(jī)過程主導(dǎo)，但釀酒酵母通過改變漂移和擴(kuò)散的重要性使組裝過程更具確定性。本研究結(jié)果揭示了釀酒酵母對(duì)濃香型白酒發(fā)酵過程中微生物群落演替的影響，但具體的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。