核桃谷蛋白抗菌肽的分離純化及抑菌穩(wěn)定性分析

馬 慧，顧雪敏，梅 潔，李 芳，王佳利，王梓棚，孔令明,*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)分院，新疆 烏魯木齊 830021）

抗菌肽又稱抗生素肽、肽類抗生素，是來源于動物、植物和微生物等生物體的一類疏水性陽離子多肽[1-2]。由于抗菌肽具有抗菌活性高、抗菌譜廣、分子質(zhì)量低等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)[3-5]，被廣泛應(yīng)用于食品防腐、動物飼料和生物醫(yī)藥領(lǐng)域[6-8]。近年來，國內(nèi)外有大量學(xué)者研究了從鯽魚鱗[9]、辣椒籽蛋白[10]及牛乳酪蛋白[11]等動植物體中分離出的具有抑菌活性的多肽類物質(zhì)。研究表明，核桃粕經(jīng)過酶解后具有抗氧化[12]、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制[13]等活性，但對于其抑菌特性，以及核桃粕谷蛋白經(jīng)過菌酶協(xié)同處理后制備抗菌肽的報道較少。

核桃粕是核桃榨油后的副產(chǎn)物，蛋白含量可達(dá)43.8%[14]，且氨基酸種類豐富，是一種可為人體提供豐富氨基酸的植物源蛋白原料[15]。但目前核桃粕整體利用率較低，常被用于動物飼料或直接丟棄，導(dǎo)致蛋白資源的浪費(fèi)[16]。核桃粕蛋白主要由谷蛋白、球蛋白、清蛋白和醇溶谷蛋白構(gòu)成[17-18]。其中，清蛋白和球蛋白的溶解性最佳，目前相關(guān)研究較多[19-20]；而含量最多的谷蛋白（70%以上）的溶解性最差，針對谷蛋白的功能性質(zhì)與生理活性的研究也相對較少[21]。菌酶協(xié)同發(fā)酵技術(shù)綜合了微生物發(fā)酵和酶解技術(shù)兩大優(yōu)勢，通過酶解可以為微生物的發(fā)酵過程供給氮源和碳源等基本營養(yǎng)素，同時發(fā)酵技術(shù)還能夠克服單純酶解所帶來的功能元素缺失等問題。將二者有機(jī)融合不僅可以降低活性肽的生產(chǎn)成本，也可在生產(chǎn)中起到原料解毒和脫苦的作用[22]。

因此，為充分利用核桃粕，提高其資源利用率，以核桃粕谷蛋白為原料，采用菌酶協(xié)同固態(tài)發(fā)酵的方式制備抗菌肽。在前期實(shí)驗(yàn)中，已明確核桃谷蛋白抗菌肽菌酶協(xié)同最佳制備工藝。在此基礎(chǔ)上，為獲得具有更高活性的核桃粕谷蛋白抗菌肽段，以大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌圈直徑為指標(biāo)，采用超濾、凝膠過濾層析分離、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）進(jìn)一步分離純化谷蛋白抗菌肽，篩選出具有較強(qiáng)活性的多肽。并通過分子對接技術(shù)對谷蛋白抗菌肽與大腸桿菌進(jìn)行對接模擬，對其生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行評價并確定其分子機(jī)制。后通過研究谷蛋白抗菌肽在高溫?zé)崽幚?、紫外線、不同pH值和不同蛋白酶處理后的抑菌性保持率表征其穩(wěn)定性，這一研究不但能夠提高核桃粕的綜合利用價值，而且對核桃谷蛋白抗菌肽的開發(fā)利用具有意義，同時為研發(fā)一種新型抗生素的替代品及食品級抗菌劑提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃谷蛋白 實(shí)驗(yàn)室自制；枯草芽孢桿菌CICC 10732、金黃色葡萄球菌CICC 10384、大腸桿菌CICC 10899 廣東微生物研究所；麥?zhǔn)媳葷峁?溫州康泰生物有限公司；LB肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；堿性蛋白酶（200 U/mg）、酸性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）、復(fù)合蛋白酶（120 U/mg）、胰蛋白酶、胃蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、三氯乙酸、氫氧化鈉、鹽酸 天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Zorbax 300SB-C18多肽捕捉器 美國Agilent Technologie公司；CHRIST真空冷凍干燥機(jī) 北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；xMark-10593酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；AL204電子天平（精度千分之一）瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；LHS-100CH恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司；5817R低溫離心機(jī) 德國艾本德公司；ALPCL-40L高溫高壓滅菌鍋上海思默生物科技有限公司；V D-8 5 0 超凈工作臺蘇州凈化設(shè)備有限公司；凝膠層析系統(tǒng) 上海滬西分析儀器有限公司；GS-NF500實(shí)驗(yàn)室微型納濾系統(tǒng) 上海顧信生物科技有限公司；Q Exactive HF-X質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher公司；WD-9403B紫外儀 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 核桃粕谷蛋白的提取

參考Sze-Tao[23]、毛曉英[24]等關(guān)于核桃蛋白組分分離提取谷蛋白的方法，并稍作修改。以脫脂核桃粕為原料，依次使用去離子水、1 mol/L NaCl、體積分?jǐn)?shù)70%乙醇、0.1 mol/L NaOH溶液提取清蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白和谷蛋白。為確保每種蛋白組分充分提取，每項(xiàng)步驟重復(fù)3 次，將制備的谷蛋白真空冷凍干燥后于-20 ℃冰箱冷凍保存。

1.3.2 菌種活化及種子液制備

枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵菌種，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為抑菌性實(shí)驗(yàn)指示菌。將這3 種菌分別劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中活化24 h，用接種環(huán)挑取2 環(huán)菌體接入100 mL已滅菌的液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、培養(yǎng)12 h。之后取活化完成的液體培養(yǎng)基1 mL接入100 mL LB液體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到發(fā)酵種子液，使用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)節(jié)菌液濃度至107CFU/mL[25]。

1.3.3 菌酶協(xié)同固態(tài)發(fā)酵谷蛋白及樣品處理

核桃谷蛋白經(jīng)粉碎后過40 目篩，在若干50 mL燒杯中準(zhǔn)確稱取5 g（精確至0.01 g）于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)所得菌酶協(xié)同最佳制備條件，以接種量5%（V/V）、料液比1∶1.5（g/mL）、發(fā)酵溫度42 ℃、發(fā)酵時間3 d、堿性蛋白酶加酶量400 U/g進(jìn)行菌酶協(xié)同發(fā)酵。發(fā)酵完畢后95 ℃條件下滅酶15 min，于55 ℃烘箱干燥48 h，粉碎過篩備用。

按照武萬興[26]的方法，略微修改。取2 g發(fā)酵樣品（精確至0.000 1 g），加入40 mL蒸餾水，磁力攪拌30 min，取一定體積上清液，加入等體積10 g/100 mL三氯乙酸溶液，4 000 r/min離心15 min得上清液，過0.45 μm微孔濾膜除去大分子蛋白和細(xì)菌后真空冷凍干燥，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 抑菌活性測定

發(fā)酵樣品加入2.5 倍體積無菌水稀釋，4 000 r/min下離心15 min。向培養(yǎng)皿中倒入LB固體培養(yǎng)基15 mL，等培養(yǎng)基凝固后分別取150 μL不同菌液用涂布器在LB固體培養(yǎng)基表面均勻涂布，放置3 個牛津杯（內(nèi)徑6 mm）在每個培養(yǎng)皿上，分別向其中加入發(fā)酵樣液100 μL，同時加入等體積無菌生理鹽水作空白對照，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～18 h，培養(yǎng)結(jié)束后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，取平均值。

1.3.5 超濾分離

將核桃抗菌肽配制成10 mg/mL的多肽溶液，過0.45 μm微孔濾膜后依次通過截留分子質(zhì)量為30、10、3 kDa的超濾膜進(jìn)行分級超濾，蠕動泵轉(zhuǎn)速60 r/min，超濾膜出口壓力2～5 bar，收集超濾后的各組分溶液，將其冷凍干燥后，以其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為指標(biāo)篩選抑菌能力最強(qiáng)的超濾組分[27]，選擇抑菌活性最好的組分進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 葡聚糖凝膠G-25層析分離純化

將溶脹好的葡聚糖凝膠G-25裝載到1.6 cm×60 cm的玻璃層析柱，用超純水平衡凝膠層析柱。參考趙俠等[28]的方法略作修改，將超濾所得的抑菌效果好的組分溶于超純水（20 mg/mL）中，經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾后，加載到層析柱中。每次上樣量為1 mL，使用超純水洗脫樣品，恒流泵轉(zhuǎn)速15 r/min。用核酸蛋白檢測儀在280 nm波長處測定吸光度，每2 min收集一次洗脫峰組分。將不同組分冷凍干燥后以其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為指標(biāo)篩選抑菌能力最強(qiáng)的洗脫組分[29]，選擇抑菌活性最好的組分進(jìn)行LC-MS/MS分析。

1.3.7 核桃谷蛋白抗菌肽的質(zhì)譜鑒定

使用LC-MS/MS測定核桃谷蛋白抗菌肽的氨基酸序列。色譜條件：流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為體積分?jǐn)?shù)84%乙腈溶液（含0.1%甲酸）；RP-C18液相色譜柱（0.15 mm×150 mm，5 μm）以95%的流動相A進(jìn)行平衡，樣品由自動進(jìn)樣器上樣到Zorbax 300SB-C18多肽捕捉器，再經(jīng)過液相色譜柱分離。質(zhì)譜鑒定：產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用Q Exactive HF-X質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，分析時長60 min，檢測方式：正離子，每次全掃描后采集10 個碎片圖譜（MS2scan）。

1.3.8 核桃谷蛋白抗菌肽的虛擬篩選

在抗菌肽數(shù)據(jù)庫（antimicrobial peptide database，APD）中輸入鑒定得到的多肽序列，篩選有機(jī)會成為抗菌肽的肽段[30]。將有潛在抗菌活性的肽段通過NovoPro在線工具預(yù)測疏水性和凈電荷數(shù)。由于抗菌肽中高比例的疏水性和帶正電荷的氨基酸殘基對其抗菌活性至關(guān)重要[31-32]，因此選擇疏水性和凈電荷數(shù)均較高的肽段進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.9 分子對接

從PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/pdb）中篩選大腸桿菌原始株來源且分辨率較高的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：6SPP）作為分子對接受體，6SPP的分辨率為1.49 ?。使用Pymol軟件去除受體蛋白結(jié)晶水、原始配體等；使用Discovery Studio 2019軟件預(yù)測6SPP結(jié)合位點(diǎn)。多肽的3D結(jié)構(gòu)采用ChemDraw 21.0和Chem3D構(gòu)建。采用AutoDock Tools1.5.6軟件模擬谷蛋白抗菌肽與6SPP結(jié)構(gòu)相互作用的氨基酸及作用力模式。靶點(diǎn)相關(guān)參數(shù)設(shè)置為：center_x＝8.824，center_y＝0.886，center_z＝37.808；格點(diǎn)盒子設(shè)置為：size_x＝80，size_y＝60，size_z＝100（每個格點(diǎn)的間距為0.375 ?）。其余參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。將對接結(jié)果導(dǎo)入Pymol和Discovery Studio 2019軟件進(jìn)行可視化分析。

1.3.10 抗菌肽的穩(wěn)定性分析

1.3.10.1 熱穩(wěn)定性

參考肖建輝[33]的方法作一定修改。將1.3.5節(jié)超濾得到的抑菌活性最好的組分冷凍干燥后配制成終質(zhì)量濃度為10 mg/mL的抗菌肽溶液。取6 份抗菌肽溶液分別于-20、4、30、60、90、121 ℃處理30 min，分別取50 μL抗菌肽溶液、190 μL LB肉湯培養(yǎng)基和10 μL稀釋好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌測試液加入96 孔板中，37 ℃培養(yǎng)12 h，用酶標(biāo)儀測定OD600nm。以無菌水作為空白組，未處理抗菌肽溶液作為對照組，測定加熱溫度對抗菌肽活性的影響[34]。按照上述步驟，將抗菌肽于90 ℃沸水浴中分別加熱5、10、15、20、25 min，測定加熱時間對抗菌肽活性的影響。按下式計算谷蛋白抗菌肽抑菌性保持率。

式中：OD空白、OD實(shí)驗(yàn)、OD對照分別表示空白組、實(shí)驗(yàn)組和對照組的OD600nm。

1.3.10.2 酸堿穩(wěn)定性

參考徐曉裕等[35]的方法，用無菌水配制終質(zhì)量濃度為10 mg/mL的抗菌肽溶液，使用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH配制pH值分別為2、4、6、8、10的溶液，將抗菌肽溶液與不同pH值的溶液等體積混合，取50 μL抗菌肽溶液、190 μL LB肉湯培養(yǎng)基和10 μL稀釋好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌測試液加入96 孔板中，37 ℃培養(yǎng)12 h后測定OD600nm。以無菌水作為空白組，抗菌肽在正常生理環(huán)境下（pH 7.4）的OD600nm作為對照組。按照1.3.10.1節(jié)公式計算抑菌性保持率。

1.3.10.3 紫外輻射穩(wěn)定性

參考柳梅[36]的方法作一定修改，將質(zhì)量濃度為10 mg/mL的抗菌肽在紫外儀下分別照射10、20、30、40、50 min，測定紫外輻射時間對抗菌肽活性的影響。分別取50 μL抗菌肽溶液、190 μL LB肉湯培養(yǎng)基和10 μL稀釋好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌測試液加入96 孔板中，37 ℃培養(yǎng)12 h后測定OD600nm。以無菌水作空白組，未處理抗菌肽溶液作為對照組。按1.3.10.1節(jié)公式計算抑菌性保持率。

1.3.10.4 不同蛋白酶水解能力穩(wěn)定性

參考趙萍[37]、李心丹[38]等的方法并作一定修改，用無菌水溶解肽樣品，配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的抗菌肽溶液。等體積的抗菌肽溶液與1 mg/mL的胃蛋白酶、胰蛋白酶于37 ℃水浴處理1 h，與酸性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶于45 ℃水浴處理1 h后，沸水浴滅酶。取50 μL抗菌肽溶液、190 μL LB肉湯培養(yǎng)基和10 μL稀釋好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌測試液加入96 孔板中測定OD600nm。無菌水作空白組，未經(jīng)過蛋白酶處理的抗菌肽溶液作為對照組，按1.3.10.1節(jié)公式計算抑菌性保持率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2021軟件進(jìn)行制圖，利用SPSS Statistics 20軟件采用方差分析進(jìn)行差異顯著性分析。每個樣品均作3 個平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾各組分抑菌活性

如圖1所示，核桃谷蛋白抗菌肽超濾后分離出4 種不同分子質(zhì)量的多肽組分：WGP-I（Mw＜3 kDa）、WGP-II（3 kDa＜Mw＜10 kDa）、WGP-III（10 kDa＜Mw＜30 kDa）、WGP-IV（Mw＞30 kDa）。這4 種組分對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用。WGP-III組分的抑菌圈直徑顯著大于其他3 種組分（P＜0.05），對大腸桿菌的抑菌圈直徑為19.53 mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為18.51 mm，抑菌活性最強(qiáng)；WGP-II有較強(qiáng)的抑菌活性；WGP-I和WGP-IV抑菌活性相對較弱，但抑菌圈平均直徑也大于13 mm。

圖1 各超濾組分抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of ultrafiltration fractions

2.2 Sephadex G-25層析分離純化

進(jìn)一步對WGP-III組分進(jìn)行凝膠過濾層析分離。由圖2可知，共得到3 個組分。經(jīng)過抑菌性測定，組分A和C對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果較優(yōu)（表1），對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均達(dá)到15 mm以上，且與B組分對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑有顯著差異（P＜0.05）。因此，本研究選擇WGP-IIIA、WGP-IIIC組分做進(jìn)一步抗菌肽鑒定。

表1 WGP-III組分經(jīng)Sephadex G-25層析組分抑菌圈直徑Table 1 Diameters of inhibition zones of WGP-III fractions separated by Sephadex G-25 chromatography

圖2 WGP-III組分經(jīng)Sephadex G-25層析分離純化色譜圖Fig.2 Sephadex G-25 chromatogram of WGP-III

2.3 核桃谷蛋白抗菌肽的質(zhì)譜鑒定

用LC-MS/MS對WGP-IIIA和WGP-IIIC組分中抗菌肽進(jìn)行鑒定，得到的肽段通過APD篩選有可能成為抗菌肽的肽序列，將篩選得到的序列通過NovoPro在線工具預(yù)測，選擇疏水性和凈電荷數(shù)均較高的肽段。

如表2 所示，從WGP-IIIA 組分中得到1 條疏水性和凈電荷均較高的肽段，為Leu-Ala-Glu-Ala-Tyr-Asn-Ile-Pro-Asp-Thr-Ile-Ala-Arg-Arg-Leu（LAEAYNIPDTIARRL）；從WGP-IIIC組分中得到5 條疏水性和凈電荷數(shù)均較高的抗菌肽，分別為Ala-Pro-Gln-Leu-Val-Tyr-Ile-Ala-Arg（APQLVYIAR）、Ser-His-Ser-Val-Ile-Tyr-Val-Ile-Arg（SHSVIYVIR）、Ala-Pro-Gln-Leu-Leu-Tyr-Ile-Val-Lys（APQLLYIVK）、Asp-Val-Leu-Ile-Asn-Ala-Tyr-Arg（DVLINAYR）、Ser-Val-Ile-Tyr-Val-Ile-Arg-Gly-Asn（SVIYVIRGN），這5 條肽段肽鏈長度均為8～9 個氨基酸，且以九肽為主，分子質(zhì)量為962.518 5～1 072.602 9 Da，肽段鑒定得分都在100 分以上。6 條多肽質(zhì)譜圖如圖3所示。

表2 谷蛋白抗菌肽虛擬篩選Table 2 Virtual screening of antimicrobial peptides from walnut glutenin

圖3 6 條多肽質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of six peptides

抗菌肽抑菌活性強(qiáng)弱與多肽序列中某些特殊氨基酸殘基密切相關(guān)，如富含Arg和Val的抗菌肽由于和細(xì)胞膜脂質(zhì)層有較強(qiáng)的靜電吸附力而發(fā)揮良好抗菌活性[39]；富含Pro和Gly對穩(wěn)定結(jié)構(gòu)與抗菌活性發(fā)揮有重要作用[40]。而鑒定得到的6 條抗菌肽中WGP-IIIC組分中的APQLVYIAR含有Val和Arg；SHSVIYVIR富含Val和Arg；APQLLYIVK中含有Pro和Val；DVLINAYR中含有Val和Arg；SVIYVIRGN中含有Val、Arg、Gly。WGPIIIA組分中的LAEAYNIPDTIARRL含有Ala、Pro和Arg。說明鑒定得到的6 條多肽序列具有較強(qiáng)的抑菌活性。

2.4 分子對接模擬

分子對接是預(yù)測配體結(jié)合模式及其與靶蛋白受體結(jié)合能的首選方法[41]。對接分子間能是配體與受體結(jié)合時活性口袋復(fù)合物分子本身所具有的內(nèi)張力，它決定著分子結(jié)合的穩(wěn)定程度，內(nèi)能越小，結(jié)合越穩(wěn)定[42]。而分子對接中結(jié)合能越低，多肽與配體的結(jié)合作用力越強(qiáng)[43]。因此，以結(jié)合能和分子間能為指標(biāo)，將6 條抗菌肽與大腸桿菌來源結(jié)晶體6SPP進(jìn)行分子對接模擬。

分子對接結(jié)果表明，多肽與6SPP之間至少有1 種相互作用，這些相互作用（氫鍵作用、疏水相互作用、范德華力）可以穩(wěn)定多肽-受體結(jié)構(gòu)。如表3所示，在篩選得出的6 條多肽中，WGP-IIIC組分的SHSVIYVIR和APQLLYIVK結(jié)合能和分子間能都較低，結(jié)合能分別為0.78、1.64 kcal/mol，分子間能分別為-9.07、-9.10 kcal/mol。WGP-IIIA組分的LAEAYNIPDTIARRL結(jié)合能為9.20 kcal/mol，分子間能為-4.52 kcal/mol。即WGP-IIIC組分的SHSVIYVIR和APQLLYIVK與大腸桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合能力。而WGP-IIIA組分的LAEAYNIPDTIARRL與大腸桿菌分子間結(jié)合能力較差。

表3 多肽與6SPP的結(jié)合能及分子間能Table 3 Binding energy and intermolecular energy between polypeptides and 6SPP

圖4所示為6SPP活性結(jié)合區(qū)域，結(jié)合圖5～7可知，SHSVIYVIR與Asn507（2.42 ?）和Asn525（2.37 ?）形成了2 個常規(guī)氫鍵，與Glu509、Glu500、Glu503、Thr508、Ala504形成了范德華力。APQLLYIVK與Asp156（2.31 ?）、Asp138（2.21 ?）、Gln227（2.10 ?）、Thr168（3.00 ?）、Ser125（2.98 ?）形成了5 個常規(guī)氫鍵，與Phe191（4.98 ?）和Ile124（5.08 ?）形成疏水相互作用，與Trp229、Pro167、Gln228、Gln126、Ser166、Met184和Glu169形成了范德華力。LAEAYNIPDTIARRL與Gly398（2.37?）和Ser394（2.22 ?）形成2 個氫鍵，與Lys465、Pro460、Arg395、Phe399形成范德華力[44]。綜合分析，LAEAYNIPDTIARRL與大腸桿菌分子間的作用力較SHSVIYVIR和APQLLYIVK少，所形成的多肽-受體結(jié)構(gòu)相對不穩(wěn)定。結(jié)合抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，WGP-IIIC組分的抑菌活性比WGP-IIIA組分強(qiáng)。

圖4 6SPP結(jié)合位點(diǎn)Fig.4 6SPP binding site

圖5 SHSVIYVIR分子對接Fig.5 Molecular docking of SHSVIYVIR

圖6 APQLLYIVK分子對接Fig.6 Molecular docking of APQLLYIVK

圖7 LAEAYNIPDTIARRL分子對接Fig.7 Molecular docking of LAEAYNIPDTIARRL

2.5 谷蛋白抗菌肽抑菌穩(wěn)定性分析

2.5.1 熱穩(wěn)定性分析

由圖8A可知，谷蛋白抗菌肽在-20 ℃條件下對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性保持率分別為85.16%和87.45%，隨溫度升高，抑菌活性也相對下降。當(dāng)溫度到達(dá)90 ℃時，抗菌肽對大腸桿菌的抑菌性保持率下降至56.8%，對金黃色葡萄球菌抑菌性保持率下降至33.98%。當(dāng)抗菌肽在121 ℃下處理30 min后，對大腸桿菌的抑菌性保持率為31.62%，對金黃色葡萄球菌抑菌性保持率為16.11%，表明在高溫處理下，核桃谷蛋白抗菌肽對大腸桿菌仍具有一定的抑菌效果，對金黃色葡萄球菌抑菌性保持率較差。

圖8 谷蛋白抗菌肽熱穩(wěn)定性Fig.8 Thermal stability of antimicrobial peptides

由圖8B可知，在90 ℃沸水中，隨加熱時間延長，抗菌肽對2 種菌的抑菌活性呈現(xiàn)下降趨勢，加熱到25 min時，谷蛋白抗菌肽對大腸桿菌的抑菌性保持率為47.49%，對金黃色葡萄球菌抑菌性保持率僅為24.79%。結(jié)合加熱溫度的影響結(jié)果，核桃谷蛋白抗菌肽具有一定的耐熱性，這與張琦等[45]研究結(jié)果一致。但過度的高溫也會造成抗菌肽抑菌活性下降，原因可能是高溫破壞了抗菌肽的結(jié)構(gòu)，使其活力消失[46]。因此，為消除因受熱導(dǎo)致的抗菌活性降低問題，抗菌肽應(yīng)注意低溫保存。

2.5.2 紫外照射時間對谷蛋白抗菌肽抑菌效果的影響

如圖9所示，紫外照射時間對谷蛋白抗菌肽的抑菌活性影響較小。在10～50 min，抑菌性保持率緩慢下降直至趨于平緩。對大腸桿菌平均抑菌性保持率為88.9%，對金黃色葡萄球菌平均抑菌性保持率為84.78%，說明谷蛋白抗菌肽在50 min內(nèi)對紫外線具有較高的穩(wěn)定性，這可能是由于抗菌肽經(jīng)紫外線照射后結(jié)構(gòu)與性質(zhì)并未發(fā)生改變，因此對抑菌活性的影響也較小[47]。

圖9 紫外照射時間對谷蛋白抗菌肽抑菌效果的影響Fig.9 Effect of ultraviolet irradiation time on the activity of antibacterial peptides

2.5.3 pH值對谷蛋白抗菌肽抑菌效果的影響

由圖10可知，隨pH值升高，抗菌肽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性保持率呈現(xiàn)先增加再降低的趨勢。pH 2～10平均抑菌性保持率大于30%，其中，pH值為2和10時抑菌活力較低，pH 6～8時抑菌性保持率較高，pH 8時，谷蛋白抗菌肽對大腸桿菌抑菌性保持率達(dá)到87.58%，對金黃色葡萄球菌的抑菌性保持率達(dá)到85.33%。綜上，谷蛋白抗菌肽具有一定的耐酸堿能力。

圖10 pH值對谷蛋白抗菌肽抑菌效果的影響Fig.10 Effect of pH on the activity of antimicrobial peptides

2.5.4 不同種類酶對谷蛋白抗菌肽抑菌效果的影響

由圖11可知，谷蛋白抗菌肽對中性蛋白酶最耐受，受酸性蛋白酶影響最大。在酸性蛋白酶作用下，抗菌肽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌性保持率僅為24.17%和19.01%。除中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胃蛋白酶外，抗菌肽在其他酶作用下對2 種致病菌的抑菌性保持率均在35%以下。表明谷蛋白抗菌肽易受蛋白酶影響，實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)注意酶解對抗菌肽的影響。

圖11 不同種類酶對谷蛋白抗菌肽抑菌效果的影響Fig.11 Effects of different proteases on the activity of antibacterial peptides

3 結(jié)論

通過菌酶協(xié)同固態(tài)發(fā)酵法（枯草芽孢桿菌和堿性蛋白酶協(xié)同）制備核桃粕谷蛋白抗菌肽，經(jīng)超濾、凝膠層析過濾分離、LC-MS/MS鑒定后，篩選高活性肽段，結(jié)合分子對接手段分析高活性肽段對大腸桿菌原始株來源的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：6SPP）相互作用的氨基酸殘基及作用力模式。進(jìn)一步對制備的谷蛋白抗菌肽進(jìn)行熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、紫外照射穩(wěn)定性及不同蛋白酶處理下的穩(wěn)定性分析，為谷蛋白抑菌肽的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

具體結(jié)果如下：WGP超濾分離結(jié)果表明分子質(zhì)量3～10 kDa的組分WGP-III抑菌效果最好；WGP-III組分經(jīng)過SephadexG-25層析純化后，共分離出3 個組分，選擇抑菌效果較好的WGP-IIIA和WGP-IIIC進(jìn)行LC-MS/MS鑒定；LC-MS/MS鑒定結(jié)合分子對接篩選得到3 個多肽序列，包括WGP-IIIA組分的LAEAYNIPDTIARRL和WGPIIIC組分的SHSVIYVIR、APQLLYIVK，以上3 個多肽與6SPP之間至少有1 種相互作用（氫鍵作用、疏水相互作用、范德華力），這些作用力可能是谷蛋白抗菌肽對大腸桿菌具有良好抑制作用的原因，分子對接結(jié)合抑菌結(jié)果顯示，WGP-IIIC組分的抑菌活性比WGP-IIIA組分強(qiáng)；谷蛋白抗菌肽具有良好的穩(wěn)定性，經(jīng)不同加熱時間、不同溫度、紫外線照射和不同蛋白酶處理后依舊具有較好的抑菌性保持率，具有一定的耐高溫、耐低溫能力，-20 ℃貯藏條件下對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌性保持率分別為85.16%和87.45%，90 ℃時，抗菌肽對大腸桿菌的抑菌活性最好，121 ℃下對大腸桿菌的抑菌性保持率為31.62%。這一特性可應(yīng)用于冷熱加工食品的防腐保鮮劑領(lǐng)域。未來的研究方向應(yīng)聚焦于谷蛋白抗菌肽的生物抑菌特性以及在體內(nèi)的安全性機(jī)制分析，為抗菌肽作為新型抗生素的替代品以及在食品級抗菌劑領(lǐng)域的具體應(yīng)用提供新思路。