青香蕉果肉多酚成分鑒定及其對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用

王 倩，王 娟，傅金鳳，盛 鷗

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；3.廣東省香蕉精深加工與綜合利用工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510641）

香蕉（Musaspp.）為芭蕉科芭蕉屬植物，栽培區(qū)域廣泛[1]，因其果肉香甜、細(xì)膩可口，深受消費(fèi)者青睞。香蕉中含有多種生物活性物質(zhì)，如多酚、低聚糖、抗性淀粉等[2-4]。多酚種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物[5]，多酚成分鑒定對(duì)明晰其生物活性具有重要意義。多酚是香蕉的重要活性成分，Pongsagon等[6]通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從香蕉多酚提取物中鑒定出柚皮苷、楊梅素糖苷和蘆丁等多酚類化合物。Jimenez等[7]從Plantain香蕉（Musaparadisiaca）果肉中提取得到槲皮素、兒茶素和沒食子酸。研究表明，多酚能夠預(yù)防和治療代謝相關(guān)疾病，如改善糖脂代謝紊亂、降血糖等[8-11]，這可能與多酚對(duì)淀粉消化酶的抑制有關(guān)（如改變酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)、疏水相互作用等）[12-13]，通過(guò)抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性、減少葡萄糖的產(chǎn)生和吸收等方式控制餐后血糖水平。Bhinge等[14]研究發(fā)現(xiàn)，香蕉果肉的乙醇提取物可抑制α-淀粉酶活性及葡萄糖擴(kuò)散，從而實(shí)現(xiàn)降血糖效果。Plantain香蕉的甲醇提取物可降低糖尿病小鼠血糖濃度，且喂食劑量與降血糖效果顯著相關(guān)，其作用機(jī)制可能與機(jī)體內(nèi)的葡萄糖利用有關(guān)[15]。同時(shí)，傅金鳳[16]前期研究發(fā)現(xiàn)，青香蕉粉干預(yù)能有效降低糖尿病大鼠初期空腹血糖，改善糖尿病癥狀，而多酚對(duì)淀粉消化酶的抑制作用可能是青香蕉降血糖的作用途徑之一。

為了解香蕉多酚的組成，初步探究其在青香蕉降血糖功能方面的作用，本研究采用大孔吸附樹脂純化香蕉果肉多酚，再通過(guò)超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-Exactive Orbitrap-mass spectrometry，UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS）技術(shù)鑒定其多酚組成，然后以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照，分析香蕉果肉多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用和抑制類型。旨在提供香蕉果肉多酚組成的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，了解其對(duì)淀粉消化酶的影響，為香蕉資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青香蕉（Musaspp.Dajiao ABB group）購(gòu)于廣東省廣州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。青香蕉用乙烯利催熟，在黑暗密封環(huán)境中放置，按催熟時(shí)間取樣，以催熟當(dāng)天為第0天，連續(xù)取樣7 d。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)第3天的果肉多酚含量最高，因此取催熟后第3天的香蕉果肉為實(shí)驗(yàn)材料，取果肉，液氮冷凍打粉，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

H-60大孔吸附樹脂 江蘇和成新材料科技有限公司；福林-酚試劑、α-淀粉酶（3 700 U/g）、3,5-二硝基水楊酸顯色劑 北京索萊寶科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（50 U/mg）、對(duì)硝基苯-α-D-葡萄糖苷（純度≥98%）、對(duì)硝基苯酚 上海麥克林生物試劑有限公司；D(+)-無(wú)水葡萄糖（純度≥98%）上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-300DE超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；721可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；Citation 5酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；LGJ冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技有限公司；UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS儀美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 香蕉果肉多酚提取

香蕉果肉多酚提取及分離純化：超聲輔助乙醇法提取→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→粗提物→大孔吸附樹脂純化→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→冷凍干燥→純化樣品

超聲輔助乙醇提取香蕉多酚，提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比（g/mL）1∶30、提取溫度20 ℃、提取時(shí)間10 min，提取液真空抽濾，濾液經(jīng)減壓濃縮除去乙醇，收集得到多酚粗提液。采用大孔吸附樹脂對(duì)多酚粗提液進(jìn)行純化，收集得到多酚純化液，經(jīng)減壓濃縮后冷凍干燥，得到香蕉果肉多酚純化樣品。

1.3.2 香蕉果肉多酚成分鑒定

參照Li Wenfeng等[17]的方法，取10 mg香蕉果肉多酚純化樣品凍干粉末，制得1 mg/mL樣品液于4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜。UPLC條件：Agilent PoroShell HPH-C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，4 μm），流動(dòng)相A為超純水（含1‰甲酸），流動(dòng)相B為乙腈（含1‰甲酸），流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積5 μL；梯度洗脫，程序如表1所示。

表1 洗脫程序Table 1 Elution program

MS條件：負(fù)離子模式下運(yùn)行的電噴霧電離源，保護(hù)氣（N2）壓力30 arb，輔助氣（N2）壓力10 arb，毛細(xì)管電壓3 200 V，毛細(xì)管溫度320 ℃，掃描范圍100～1 500m/z。

1.3.3 香蕉果肉多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制作用分析

1.3.3.1 對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用

按照潘玥等[18]方法稍作修改，依次移取50 μL不同質(zhì)量濃度（0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg/mL）香蕉果肉多酚樣品溶液、50 μg/mLα-淀粉酶溶液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）共100 μL于10 mL試管中，混勻后在37 ℃水浴鍋中水浴10 min，加入100 μL 10 mg/mL可溶性淀粉溶液，再次水浴10 min后加入150 μL 3,5-二硝基水楊酸顯色劑，沸水浴10 min后加入5 mL蒸餾水稀釋，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以阿卡波糖（與香蕉果肉多酚樣品液質(zhì)量濃度一致）為陽(yáng)性對(duì)照，以不加PBS的反應(yīng)體系為實(shí)驗(yàn)組（α-淀粉酶溶液50 μL+香蕉多酚樣品溶液50 μL+PBS 0 μL，反應(yīng)體系共100 μL，其他組以此類推），不加酶的反應(yīng)體系為背景組，不加抑制劑的反應(yīng)體系為陰性對(duì)照組，不加酶和抑制劑的反應(yīng)體系為空白組，按式（1）[19]計(jì)算抑制率，根據(jù)抑制曲線計(jì)算得到半抑制質(zhì)量濃度（half inhibitory concentration，IC50）。

式中：A1為實(shí)驗(yàn)組吸光度；A2為背景組吸光度；A3為陰性對(duì)照組吸光度；A4為空白組吸光度。

1.3.3.2 對(duì)α-淀粉酶的抑制類型及抑制常數(shù)測(cè)定

參考趙一靈[20]的方法并作適當(dāng)修改，以確定香蕉果肉多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制類型和抑制常數(shù)。設(shè)置香蕉果肉多酚溶液質(zhì)量濃度為0.0～2.0 mg/mL，可溶性淀粉溶液質(zhì)量濃度為1.25～15.00 mg/mL，以1.3.3.1節(jié)中實(shí)驗(yàn)組為反應(yīng)體系測(cè)定吸光度。配制0.125～8.000 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝0.183 5x+0.014 6（R2＝0.999 1）。將反應(yīng)體系吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葡萄糖產(chǎn)生量，按式（2）[21]計(jì)算酶促反應(yīng)初速率。

式中：v0為酶促反應(yīng)初速率/（mg/（mL·min））；t為反應(yīng)時(shí)間/min；c為反應(yīng)體系中反應(yīng)產(chǎn)物質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

以1/v0為縱坐標(biāo)，底物濃度的倒數(shù)1/[S]為橫坐標(biāo)，繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線，確定α-淀粉酶抑制反應(yīng)類型，通過(guò)米氏方程（3）和雙倒數(shù)方程（4）分別計(jì)算α-淀粉酶的米氏常數(shù)（Km）及最大反應(yīng)速率（vm）[22]。

式中：vm為最大反應(yīng)速率/（mg/（mL·min））；[S]為底物質(zhì)量濃度/（mg/mL）；Km為米氏常數(shù)/（mg/mL）。

根據(jù)中間復(fù)合物假說(shuō)，利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，將米氏方程兩邊取倒數(shù)，可以得到方程式（4）。

采用混合型抑制Dixon方程（5）[23]進(jìn)一步驗(yàn)證抑制類型并確定抑制劑對(duì)酶的解離常數(shù)（KI）與抑制劑對(duì)酶-底物復(fù)合物的解離常數(shù)（KIS）。

式中：I為抑制劑濃度/（mg/mL）。

1.3.4 香蕉果肉多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用分析

1.3.4.1 對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

參考辛相余[24]的方法并稍作更改。移取40 μL不同質(zhì)量濃度（5、10、20、40、80、160、320 μg/mL）香蕉多酚樣品溶液、0.4 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液、PBS共80 μL于96 孔板中，混勻后在37 ℃水浴鍋中水浴10 min，加入80 μL 6 mmol/L對(duì)硝基苯-α-D-葡萄糖苷溶液，5 min后于酶標(biāo)儀中測(cè)定405 nm波長(zhǎng)處吸光度，實(shí)驗(yàn)分組及抑制率計(jì)算公式與1.3.3.1節(jié)一致，并繪制抑制率折線圖。

1.3.4.2 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型及抑制常數(shù)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)方法與1.3.4.1節(jié)一致，以實(shí)驗(yàn)組為反應(yīng)體系測(cè)定吸光度，設(shè)置香蕉果肉多酚質(zhì)量濃度為20～80 μg/mL，對(duì)硝基苯-α-D-葡萄糖苷質(zhì)量濃度為0.5～8.0 mmol/L。以50～400 μmol/L對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝0.009 4x+0.068 6（R2＝0.999 3）。通過(guò)繪制反應(yīng)體系的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線確定對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制反應(yīng)類型，各抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)按式（2）～（5）計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0軟件中的LSD檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，采用Xcalibur 4.2軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，采用ChemDraw軟件繪制化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉果肉多酚組成

香蕉多酚提取物在負(fù)離子模式下的色譜峰分布如圖1所示，按出峰前后標(biāo)注出28 個(gè)色譜峰，根據(jù)保留時(shí)間、一級(jí)碎片和二級(jí)碎片離子信息對(duì)化合物進(jìn)行定性分析，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品庫(kù)、文獻(xiàn)和人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，碎片信息和初步鑒定的單體組成見表2。

圖1 香蕉多酚提取物總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of polyphenols extracted from banana pulp

表2 香蕉多酚提取物成分分析Table 2 Compositional analysis of polyphenols extracted from banana pulp

通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)保留時(shí)間、母離子和二級(jí)碎片離子m/z鑒定出16 種化合物，包括苯甲酸、檸檬酸、香蘭素和13 種多酚類化合物。以化合物16為例，該化合物在圖1中的保留時(shí)間為9.26 min，有母離子m/z463[M-H]-，丟失糖基碎片m/z162，產(chǎn)生苷元碎片m/z301 [A-H]-和m/z301 [A-2H]-，與金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)據(jù)[25-26]相符，因此確定化合物16為金絲桃苷。以同樣方式鑒定出13 種多酚，包括酚酸類化合物（沒食子酸、原兒茶酸、丁香酸、對(duì)羥基肉桂酸和異阿魏酸）和黃酮類化合物（秦皮乙素、蘆丁、丁香醛、金絲桃苷、紫云英苷、柚皮苷、橙皮苷和沒食子兒茶素）。此外，鑒定出的苯甲酸是酚酸化合物（苯甲酸衍生物）的母體結(jié)構(gòu)。

通過(guò)與文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，鑒定出其他12 種化合物?；衔?在m/z145處有[M-H]-母離子峰、碎片離子m/z101，二者與郝元元[27]對(duì)香豆素的鑒定結(jié)果一致，因此推測(cè)化合物3為香豆素?；衔?有母離子m/z137[M-H]-，產(chǎn)生碎片離子m/z93 [M-H-CO2]-，與楊婉等[28]鑒定出的對(duì)羥基苯甲酸碎片一致，因此推測(cè)化合物5為對(duì)羥基苯甲酸。化合物7在負(fù)離子模式下產(chǎn)生母離子m/z289，碎片離子m/z245 [M-H-CO2]-，與白芍藥[29]中兒茶素的質(zhì)譜信息相符，因此推測(cè)化合物7為兒茶素?；衔?3母離子[M-H]-m/z為385，失去1 個(gè)己糖苷（m/z162）得到碎片離子m/z223，是芥子酸苷元碎片，與Xavier等[30]鑒定的芥子酸-己糖苷結(jié)果一致，因此推測(cè)化合物13為芥子酸-己糖苷?；衔?4在m/z639處有[M-H]-母離子，產(chǎn)生碎片離子m/z331、m/z315，與文獻(xiàn)[31]中3′-甲基-楊梅素-3-O-蕓香糖苷的碎片相符，其中m/z331是甲基楊梅素特征母離子，m/z316[A-CH3]-為楊梅素特征母離子，因此推測(cè)化合物14為3′-甲基-楊梅素-3-O-蕓香糖苷。化合物17（m/z259 [M-H]-）、24（m/z243 [M-H]-）、28（m/z277 [M-H]-）的相關(guān)碎片離子信息與金丹等[32]對(duì)安石榴苷代謝產(chǎn)物的研究結(jié)果一致，因此分別被鑒定為尿石素D、尿石素C和尿石素A?；衔?8母離子為m/z593，失去1 個(gè)m/z309的中性片段，產(chǎn)生m/z285的二級(jí)碎片離子[M-H-308]-，為山柰酚苷元離子[33]，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量初步判斷m/z308中性片段為蕓香糖苷[34]，再結(jié)合文獻(xiàn)[35]對(duì)高羊茅中山柰酚-3-O蕓香苷的質(zhì)譜分析結(jié)果，推測(cè)化合物18為山柰酚-3-O-蕓香苷?；衔?9在m/z623處有[M-H]-母離子，產(chǎn)生碎片離子m/z477、m/z315，與文獻(xiàn)[36]報(bào)道的荷花花瓣中的異鼠李素-3-O-蕓香苷碎片信息相符，其中m/z315為異鼠李素苷元碎片，m/z477 [M-H-146]-為母離子丟失鼠李糖基中性片段產(chǎn)生的碎片離子，因此推測(cè)化合物19為異鼠李素-3-O-蕓香糖苷化合物。化合物26 [M-H]-的m/z為301，碎片離子m/z為227，通過(guò)與文獻(xiàn)[32]中鞣花酸的質(zhì)譜結(jié)果比對(duì)，被鑒定為鞣花酸?；衔?7在圖1中峰面積最大，二級(jí)質(zhì)譜圖（圖2A）及可能的裂解途徑如圖2B所示，母離子m/z329[M-H]-，碎片離子m/z311由母離子脫去1 個(gè)水分子得到，繼續(xù)脫去1 個(gè)水分子得到m/z293碎片離子，進(jìn)而失去1 個(gè)酯基和2 個(gè)甲基產(chǎn)生碎片離子m/z229，與文獻(xiàn)[32,37]報(bào)道的二甲基鞣花酸質(zhì)譜結(jié)果相符，因此推測(cè)化合物27為二甲基鞣花酸。

圖2 二甲基鞣花酸質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of dimethylellagic acid

與文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)鑒定出的12 種化合物包括鞣花酸代謝產(chǎn)物（尿石素D、尿石素C和尿石素A）、香豆素和8 種多酚類化合物。多酚類化合物包括酚酸類化合物（對(duì)羥基苯甲酸、芥子酸-己糖苷）、黃酮類化合物（3′-甲基-楊梅素-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-蕓香苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷），以及單寧類化合物（兒茶素、鞣花酸、二甲基-鞣花酸）。香豆素是多酚類化合物中香豆素衍生物的母體結(jié)構(gòu)。尿石素D、尿石素C和尿石素A屬于鞣花酸的代謝產(chǎn)物。

二甲基鞣花酸屬于單寧，尿石素A是鞣花單寧的代謝產(chǎn)物，二者為香蕉多酚提取物的主要色譜峰，說(shuō)明香蕉多酚中含有豐富的單寧類化合物。單寧類化合物常見于未成熟的柿子、紅葡萄和石榴[38-40]等水果中，具有澀味。本研究中，青蕉果肉中豐富的單寧類化合物可能是令其產(chǎn)生澀味的原因[41]，隨著果實(shí)的成熟，單寧類化合物發(fā)生變化，澀味也逐漸消失。

綜上所述，利用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)在香蕉果肉多酚提取物中共鑒定出28 種化合物。通過(guò)美國(guó)化學(xué)文摘數(shù)據(jù)庫(kù)CA檢索發(fā)現(xiàn)，香蕉果肉中曾鑒定出沒食子酸[42]、橙皮苷[43]、奎寧酸[44]、柚皮苷、蘆丁[6]、對(duì)羥基苯甲酸、異阿魏酸、原兒茶酸、丁香酸[45]、兒茶素、槲皮素[46]等多酚類化合物，而秦皮乙素、金絲桃苷、紫云英苷3 種多酚的報(bào)道較少。

2.2 香蕉果肉多酚對(duì)淀粉消化酶的抑制作用

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是能量吸收的關(guān)鍵酶，作用于淀粉的α-1,4糖苷鍵，前者隨機(jī)水解，后者順序水解，釋放葡萄糖為產(chǎn)物，引起機(jī)體血糖升高[47]。糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，臨床上檢測(cè)藥物對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用是初步判斷藥物是否具有降糖效果的常用方法[48]。

2.2.1 對(duì)α-淀粉酶的抑制作用

香蕉果肉多酚提取物（以下簡(jiǎn)稱香蕉多酚）對(duì)α-淀粉酶的抑制效果如圖3A所示，隨著質(zhì)量濃度的增加，香蕉多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制率呈現(xiàn)先升高后平緩的趨勢(shì)，在質(zhì)量濃度0.125～2.000 mg/mL范圍內(nèi)，阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶的抑制率高于香蕉多酚，IC50分別為0.15、0.53 mg/mL。香蕉多酚對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用弱于阿卡波糖，但抑制劑質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，二者抑制率差異不顯著，分別為（76.25±3.79）%和（82.75±2.29）%，因此，香蕉多酚對(duì)α-淀粉酶具有較好的抑制效果，可作為潛在的α-淀粉酶抑制劑。

圖3 香蕉多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of banana polyphenols on α-amylase

在不同質(zhì)量濃度香蕉多酚的雙倒數(shù)圖中（圖3B），各直線相交于第3象限。文獻(xiàn)報(bào)道，隨著抑制劑質(zhì)量濃度的增加，vm和Km均減小，為反競(jìng)爭(zhēng)性-非競(jìng)爭(zhēng)性混合抑制作用特征[49]。香蕉多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制作用與上述特征相符，推斷為反競(jìng)爭(zhēng)性-非競(jìng)爭(zhēng)性混合抑制。以Lineweaver-Burk方程（表3）的縱截距（1/vm）和斜率（Km/vm）對(duì)香蕉多酚質(zhì)量濃度作圖（圖3C、D），結(jié)合公式（5）計(jì)算得到香蕉多酚對(duì)酶-底物復(fù)合物的解離常數(shù)（KIS）及對(duì)α-淀粉酶的解離常數(shù)（KI）分別為0.705、2.823 mg/mL。研究表明，解離常數(shù)越小，復(fù)合物的結(jié)合越緊密[22]，本研究中香蕉多酚KIS＜KI，說(shuō)明香蕉多酚對(duì)酶-底物復(fù)合物的親和力強(qiáng)于對(duì)游離α-淀粉酶的親和力，能夠通過(guò)與酶-底物復(fù)合物結(jié)合阻止淀粉分解為葡萄糖，從而產(chǎn)生降血糖效果。

表3 不同質(zhì)量濃度香蕉多酚對(duì)α-淀粉酶抑制作用的Lineweaver-Burk方程Table 3 Lineweaver-Burk equation for the inhibition effect of banana polyphenols at different mass concentration on α-amylase

2.2.2 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

香蕉多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果如圖4A所示，隨著質(zhì)量濃度的增加，香蕉多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率呈先上升后平緩的趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量濃度相同時(shí)，阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率高于香蕉多酚，但隨著質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，二者差距逐漸減小。經(jīng)計(jì)算，阿卡波糖和香蕉多酚的IC50分別為3.41、35.76 μg/mL，阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力優(yōu)于香蕉多酚，但質(zhì)量濃度為160 μg/mL時(shí)，二者抑制率分別為（96.59±0.01）%和（92.54±0.69）%，無(wú)顯著差異，因此，香蕉多酚是潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

圖4 香蕉多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of banana polyphenols on α-glucosidase

隨著抑制劑質(zhì)量濃度的升高，Km升高，而vm降低，各濃度的抑制直線相交于第2象限，為競(jìng)爭(zhēng)性-非競(jìng)爭(zhēng)性混合抑制的典型特征[50]，香蕉多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制曲線符合該特征（圖4B），由此推測(cè)為競(jìng)爭(zhēng)性-非競(jìng)爭(zhēng)性混合抑制。香蕉多酚抑制α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk方程見表4，以Km/vm和1/vm對(duì)抑制劑濃度作圖，得到圖4C、D，并計(jì)算得到相關(guān)解離常數(shù)。香蕉多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的解離常數(shù)KI為29.89 μg/mL，對(duì)酶-底物復(fù)合物的抑制常數(shù)KIS為44.20 μg/mL，該抑制體系中KI＜KIS表明香蕉多酚對(duì)游離α-葡萄糖苷酶的親和力大于對(duì)酶-底物復(fù)合物的親和力，通過(guò)與酶緊密結(jié)合減少酶促反應(yīng)的發(fā)生。

表4 不同質(zhì)量濃度香蕉多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk方程Table 4 Lineweaver-Burk equation for the inhibition effect of banana polyphenols at different mass concentrations on α-glucosidase

3 結(jié)論

在青香蕉果肉多酚提取物中共鑒定出21 種多酚類化合物，包含7 種酚酸類化合物、11 種黃酮類化合物和3 種單寧類化合物。其中，單寧是青香蕉多酚的重要組成部分，并檢測(cè)出秦皮乙素、金絲桃苷、紫云英苷3 種多酚類化合物。香蕉多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制效果良好，對(duì)α-淀粉酶為反競(jìng)爭(zhēng)性-非競(jìng)爭(zhēng)性混合抑制，IC50為0.53 mg/mL；對(duì)α-葡萄糖苷酶為競(jìng)爭(zhēng)性-非競(jìng)爭(zhēng)性混合抑制，IC50為35.76 μg/mL。香蕉多酚對(duì)淀粉消化酶的抑制作用說(shuō)明其可能是青香蕉降血糖功能的活性成分之一。