綠豆球蛋白淀粉樣纖維的形成、結(jié)構(gòu)表征及乳化特性

白 露，李志明，張 舒，馮玉超，富天昕，劉宇航，王長遠(yuǎn),2,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

綠豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)膳食蛋白，是綠豆的重要組分（占24%～28%），芳香族氨基酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的含量與聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織參考蛋白相當(dāng)[1]，極具開發(fā)潛力。綠豆球蛋白（mung bean globulin，MBG）是綠豆蛋白的主要儲藏蛋白質(zhì)，占比達(dá)60%，按照不同的重量沉降系數(shù)，MBG分為7S、8S和11S球蛋白[2]。MBG具有優(yōu)良的溶解性、乳化性、凝膠性等特性，在食品工業(yè)中應(yīng)用較為廣泛[3]。其中，MBG的乳化性能可與大豆蛋白相媲美，Liu Hong等[4]研究表明，MBG的乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）分別為3.38 m2/g和77.23%，綜合乳化能力優(yōu)于大豆7S球蛋白（EAI和ESI分別為4.87 m2/g和57.50%），可作為一種高效的天然乳化劑。然而，MBG獨(dú)特的分子構(gòu)造及柔性不足等局限[4]制約了其高值化利用。通過有效的改性手段實(shí)現(xiàn)MBG的功能（尤其是乳化性）增效極具現(xiàn)實(shí)意義。

食源性蛋白質(zhì)淀粉樣纖維是由食品蛋白質(zhì)在酸性（pH 2～3）、高溫（80～90 ℃）和低離子濃度下獲得的一種富含交叉β-折疊的蛋白聚集體[5]。蛋白質(zhì)淀粉樣纖維是一種高度有序、無支鏈、分子尺寸為納米級的大分子結(jié)構(gòu)[6]，具有天然的高剛度、極高的長寬比，在乳液中表現(xiàn)出優(yōu)異的不可逆界面吸附能力和抗聚集性能，是良好的乳化劑[7]。米糠蛋白[8]、大豆蛋白[9]、乳清蛋白[10]等食品蛋白質(zhì)在淀粉樣纖維化后乳化和界面性能均得到顯著提升。因此，蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化被認(rèn)為是一種提升食源蛋白質(zhì)乳化性能的新方法。已有報(bào)道顯示，酸熱加工能夠使MBG具有形成淀粉樣纖維的潛能，如Liu Jing等[11]研究發(fā)現(xiàn)，MBG在pH 2.0、85 ℃條件下加熱24 h能形成大量短棒狀形態(tài)的纖維聚集體。綠豆8S球蛋白與β-伴大豆球蛋白（即大豆7S球蛋白）結(jié)構(gòu)相似；Tang Chuanhe等[12]發(fā)現(xiàn)，β-伴大豆球蛋白在蛋白含量1%、pH 2.0條件下加熱12 h，形成輪廓長度為600～800 nm、高度為1.4～1.8 nm的蠕蟲狀淀粉樣纖維。因此，應(yīng)用MBG制備淀粉樣纖維具有可行性。雖然已有相關(guān)研究報(bào)道MBG在酸熱環(huán)境下會出現(xiàn)纖維化聚集行為，但其纖維化的動(dòng)力學(xué)特征和分子機(jī)制尚不清晰，綠豆球蛋白淀粉樣纖維（mung bean globulin amyloid fibrils，MBGFs）的乳化性能也有待探究。

基于此，本研究擬先對MBG進(jìn)行0～24 h的酸熱處理（pH 2.0、95 ℃），然后對不同階段形成的MBGFs進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，明晰其纖維化過程中的結(jié)構(gòu)演變規(guī)律；同時(shí)利用MBGFs構(gòu)建乳液體系，探究不同酸熱處理時(shí)間對MBGFs乳化特性的影響，旨在揭示MBGFs的形成機(jī)理，為MBG源乳化劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆購自山西東方亮生命科技股份有限公司；金龍魚大豆油購自黑龍江省大慶市北京華聯(lián)生活超市。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）凝膠制備試劑盒、蛋白Marker（SM0431）、牛血清蛋白 北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250、溴化鉀、硫磺素T（thioflavin T，ThT）、8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）上海麥克林生化科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海力辰邦西儀器科技有限公司；RF-6000熒光光譜儀 上海滴冠實(shí)業(yè)有限公司；TENSOR II傅里葉變換紅外光譜（Fouriertransform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 天津市金貝爾科技有限公司；ZEN3700納米粒度電位儀 英國Malvern公司；FJ300-SH實(shí)驗(yàn)室數(shù)顯高速剪切均質(zhì)機(jī)上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；JEM-1200EX透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）日本電子株式會社；MARS60流變儀 上海珩澤科技有限公司；BX53F顯微鏡 山東因斯綽科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MBG及MBGFs的制備

MBG的制備：首先將脫脂綠豆粉與氯化鈉溶液（0.5 mol/mL）按照料液比1∶10配制成混合溶液，用HCl溶液調(diào)整混合溶液pH值至3.5，室溫?cái)嚢? h后，取懸浮液離心（4 ℃、7 500×g、25 min），上清液與蒸餾水按1∶3的體積比混合，在冰水浴中靜置2 h后離心取沉淀，然后將沉淀進(jìn)行透析（24 h），重復(fù)3 次后冷凍干燥備用。

MBGFs 的制備參考Liu Jing 等[11]的方法。將1 g/100 mL的MBG分散于去離子水中，室溫?cái)嚢? h使其充分水化，并將溶液pH值調(diào)整至2.0，磁力攪拌20 min后過濾膜（0.45 μm），將濾液于油浴鍋中95 ℃加熱0、2、4、6、8、10、12、16、20、24 h后取出，立即冰水浴20 min，冷凍干燥后獲得MBGFs樣品。

1.3.2 MBGFs的結(jié)構(gòu)表征

1.3.2.1 TEM形態(tài)分析

MBGFs用水稀釋至1 mg/mL，超聲使樣品分散，取10 μL樣品滴在銅網(wǎng)上靜置10 min后吸除多余樣品，再滴10 μL負(fù)染液在原銅網(wǎng)上2 min后吸除多余染液，晾干后用TEM觀察。加速電壓100 kV，分辨率1.60 nm。

1.3.2.2 SDS-PAGE測定

參考梁征等[13]的方法。用0.1 mol/L NaOH溶液配制樣品混合液（0.5 mg/mL），加入等量的上樣緩沖液后沸水浴5 min。5%濃縮膠，12%分離膠，上樣量10 μL，電壓80～120 V。當(dāng)條帶移動(dòng)至膠最底端后停止加壓，結(jié)束后對膠面依次進(jìn)行染色和脫色，并拍照觀察。

1.3.2.3 ThT熒光光譜測定

參考Wang Yajuan 等[6]的方法并稍作修改，用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0，含150 mmol/L NaCl）配制質(zhì)量濃度8 mg/mL的ThT濃縮液，過濾膜后得到ThT儲備液。實(shí)驗(yàn)前，用上述磷酸鹽緩沖液將濃縮液稀釋50 倍，將50 μL 1 g/100 mL待測樣品溶液與5 mL ThT稀釋液混合，混勻后靜置2 min，使用熒光光譜儀測定熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長430 nm，發(fā)射波長450～600 nm，縫隙5 mm，掃描速率200 nm/min）。

1.3.2.4 FTIR測定

參考Xiang Ning等[14]的方法并作一定修改。取2 mg MBGFs和200 mg KBr混合后研磨、壓片。在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，分辨率4 cm-1，波數(shù)精度0.01 cm-1，掃描次數(shù)64。使用Peakfit 4.12軟件對光譜中酰胺I帶進(jìn)行基線校正、平滑、去卷積和二階導(dǎo)數(shù)擬合等處理，計(jì)算每個(gè)亞峰面積，獲得二級結(jié)構(gòu)的相對含量。

1.3.2.5 粒徑分析

用pH 7.0、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解樣品至質(zhì)量濃度為1 mg/mL。采用粒度儀測定MBGFs粒徑，所有樣品均在25 ℃下進(jìn)行測定。

1.3.2.6 表面疏水性（H0）測定

參考Zhang Shu等[15]的方法并稍作修改，配制1 mg/mL樣品溶液（溶劑為pH 7.0、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液），10 744×g離心10 min后取上清液進(jìn)行梯度稀釋，將稀釋液與8 mmol/L ANS溶液以體積比100∶1混合，3 min后測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為468 nm。以熒光強(qiáng)度-蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度作圖，所得直線斜率為H0。

1.3.3 乳液的制備及性能測定

1.3.3.1 乳液的制備及EAI和ESI測定

參照劉興麗等[16]的方法并修改，向15 mL 1 g/100 mL MBGFs溶液中緩慢加入5 mL大豆油，使用高速剪切均質(zhì)機(jī)12 000 r/min均質(zhì)2 min，形成乳液，立即吸取乳液底部液體50 μL，并置于5 mL 1 g/100 mL SDS溶液中，混勻后立即在650 nm波長處測定其吸光度（A0），間隔10 min后重復(fù)操作測定吸光度（A10）。EAI和ESI分別按式（1）、（2）計(jì)算。

式中：ρ為樣品質(zhì)量濃度/（g/L）；φ為油相體積分?jǐn)?shù)；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.3.2 蛋白吸附率和界面蛋白吸附量測定

參照王可心等[17]方法并作一定的修改，吸取一定量乳液13 200×g離心30 min，緩慢吸取少量下層清液稀釋后于650 nm波長處測定其吸光度，代入牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算其蛋白質(zhì)量濃度，蛋白吸附率和界面蛋白吸附量分別按式（3）、（4）計(jì)算。

式中：ρ0為乳液中總蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρf為下層清液中蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；φ為油相體積分?jǐn)?shù)；D3,2為乳液表面積平均粒徑/nm。

1.3.3.3 光學(xué)顯微鏡觀察

取少量乳液置于載玻片上，緩慢蓋上蓋玻片，此過程防止氣泡產(chǎn)生，然后于光學(xué)顯微鏡下觀察其微觀形態(tài)并選擇標(biāo)尺進(jìn)行拍照。

1.3.3.4 流變學(xué)特性測定

利用流變儀對MBGFs乳液的表觀黏度、儲能模量（G′）和損耗模量（G″）進(jìn)行測定。吸取適量樣品于樣品臺上，轉(zhuǎn)子下降后擦凈多余的樣品，設(shè)置間隙0.048 mm，溫度25 ℃，測定樣品在0.1～10.0 s-1剪切速率范圍內(nèi)的表觀黏度。G′和G″的測定參數(shù)為：間隙0.048 mm，溫度25 ℃，頻率掃描范圍0～16 Hz。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)利用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s模式比較組間差異顯著性（P＜0.05），并用Origin 8.0軟件制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 MBGFs的形成和結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 MBGFs形態(tài)分析

如圖1所示，MBG主要由大小不均一、不規(guī)則的球狀納米顆粒組成（圖1A）。在pH 2.0環(huán)境下，MBG（0 h）發(fā)生了一定程度的聚集，但沒有線性聚集體存在（圖1B）。加熱2 h后，球狀結(jié)構(gòu)消失，轉(zhuǎn)化為中間粗兩端細(xì)的絮狀纖維絲，表明在此階段構(gòu)建單元（蛋白或多肽）已開始進(jìn)行有序的聚集排序，形成MBGFs初始形態(tài)。在4～12 h內(nèi)，MBGFs逐漸成熟，纖維呈現(xiàn)細(xì)直、柔性的長條狀，并且長短不一的纖維共存在同一體系。相較于其他處理組，加熱12 h形成的淀粉樣纖維體系中單個(gè)MBGFs間距較大，分布更為均勻。而酸熱處理24 h后重新出現(xiàn)絮狀纖維形貌，說明過度酸熱處理導(dǎo)致成熟MBGFs被破壞，這種現(xiàn)象與Wang Yajuan等[6]的研究結(jié)果一致。

圖1 加熱處理過程中MBGFs的TEM圖（×50 000）Fig.1 TEM images of MBGFs at different heating times (× 50 000)

溶液體系的pH值對MBGFs形成起關(guān)鍵作用。本研究中溶液體系pH 2.0，為后續(xù)MBG的纖維化聚集提供兩方面影響：一是促M(fèi)BG去折疊，釋放大量易誘發(fā)纖維化聚集的肽片段[18]；二是通過改變MBG電離狀況，暴露疏水基團(tuán)，為MGB纖維化聚集提供驅(qū)動(dòng)力[19]。酸熱處理2 h后，出現(xiàn)大量長度不一但取向相同、細(xì)小的MBGFs，其匯聚后形成了相對粗大、延長狀的淀粉樣纖維聚集中間體。在2 h酸熱處理初期，初始MBGFs發(fā)生典型的成核聚合反應(yīng)，釋放肽片段，這些纖維化聚集態(tài)的多肽在溶液體系中達(dá)到閾值水平后，會為組裝更長、更柔性的MBGFs提供物質(zhì)基礎(chǔ)[20]。12 h MBGFs的形貌與現(xiàn)有報(bào)道存在差異，Liu Jing等[11]研究發(fā)現(xiàn)，MBG在含量0.5%、pH 2.0、85 ℃條件下處理12 h后會形成短棒狀纖維聚集體，而本研究得到的是細(xì)直的長纖維，這可能與制備時(shí)蛋白質(zhì)含量和溫度的不同有關(guān)[21]。綜上，在整個(gè)酸熱處理過程中（0～24 h），MBGFs呈現(xiàn)“纖維前體形成→組裝→延伸→成熟→重新解離”的形成規(guī)律。

2.1.2 加熱處理過程中MBG的降解

由圖2可知，MBG泳道的條帶分布符合MBG亞基組成特征（60、48、32、26 kDa）[4]。由于將溶液體系pH值調(diào)至2.0，MBG變性的同時(shí)發(fā)生聚集反應(yīng)，出現(xiàn)高分子質(zhì)量的亞基[22]，如出現(xiàn)多條＞66.2 kDa的新條帶。2 h的譜圖變化不明顯，但也出現(xiàn)了14.4～25.0 kDa的肽段。研究表明，在初始酸熱水解階段（2 h以內(nèi)），2 h時(shí)MBG的水解程度高于一般谷物蛋白，如米谷蛋白[23]和蕓豆球蛋白[11]，這與MBG高含量的天冬氨酸（占比10.1%～12.3%）有關(guān)[24]，這種快速水解產(chǎn)生的MBG多肽片段有助于快速積累足夠數(shù)量的MBGFs結(jié)構(gòu)單元。4～12 h是MBGFs形成的主要構(gòu)建期，＜14.4 kDa的肽片段不斷積累，期間隨著纖維單元含量的不斷提升，MBGFs淀粉樣纖維化程度不斷提高[25]。上述分析表明，2～12 h是MBG成淀粉樣纖維化關(guān)鍵時(shí)段，與TEM的結(jié)果相對應(yīng)。然而酸熱處理16～24 h時(shí)，大部分大分子質(zhì)量亞基已水解成＜14.4 kDa的肽片段，提示長時(shí)間酸熱處理可能會導(dǎo)致前一階段生成的多肽類淀粉樣纖維單元遭到破壞，并影響纖維特性[26]。

圖2 加熱過程中MBGFs的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE patterns of MBGFs at different heating times

2.1.3 ThT熒光光譜

與未處理的蛋白質(zhì)相比，成熟蛋白質(zhì)淀粉樣纖維有更多的β-折疊構(gòu)型，能被ThT特異性結(jié)合，結(jié)合后熒光強(qiáng)度會增加多個(gè)數(shù)量級，所以用該方法可有效監(jiān)測食源蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化的進(jìn)程[27]。由圖3可知，加熱2 h后，ThT熒光強(qiáng)度相較于MBG顯著增強(qiáng)，有明顯的交叉β-折疊結(jié)構(gòu)形成，表明MBG的自組裝纖維化已被觸發(fā)，符合MBG自組裝纖維化聚集的特點(diǎn)[11]，即水解與纖維化同步進(jìn)行。2～12 h內(nèi)，ThT熒光強(qiáng)度持續(xù)上升，表明MBGFs在有序形成，結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，并于12 h時(shí)ThT熒光強(qiáng)度最大，纖維化程度最高。已有報(bào)道表明，蛋白質(zhì)淀粉樣纖維的形成包括滯后期、生長期和固定期，呈現(xiàn)“S”型的生長模式[28]，本研究發(fā)現(xiàn)MBGFs形成過程中并未出現(xiàn)滯后期，初始時(shí)期（0～6 h）的ThT熒光強(qiáng)度迅速上升，這可能與MBG發(fā)生去折疊導(dǎo)致大量的β-折疊結(jié)構(gòu)暴露有關(guān)。ThT熒光強(qiáng)度在16～24 h持續(xù)下降，說明長時(shí)間的酸熱處理導(dǎo)致MBGFs的β-折疊結(jié)構(gòu)被破壞。目前研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)淀粉樣纖維的生長動(dòng)力學(xué)曲線在固定階段出現(xiàn)2 種不同的現(xiàn)象，一種是ThT熒光強(qiáng)度逐漸平穩(wěn)，另一種情況是成熟的淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生解離，ThT熒光強(qiáng)度發(fā)生衰退。例如，大豆蛋白質(zhì)淀粉樣纖維[6]和β-乳球蛋白淀粉樣纖維[29]在長時(shí)間（＞12 h）酸熱處理后，ThT熒光強(qiáng)度降低，而蕓豆蛋白淀粉樣纖維[11]卻沒有發(fā)生這一現(xiàn)象。這可能是蛋白質(zhì)來源和制備條件不同導(dǎo)致蛋白質(zhì)淀粉樣纖維的熱穩(wěn)定性存在差異，具體機(jī)理還需進(jìn)一步探討。

圖3 加熱過程中MBGFs的ThT熒光強(qiáng)度及最大ThT熒光強(qiáng)度（λ＝485 nm）Fig.3 ThT fluorescence intensity of MBGFs at different heating times (λ=485 nm)

2.1.4 FTIR光譜

由表1可知，在酸熱處理的0～12 h，MBGFs的有序結(jié)構(gòu)不斷形成，并趨于穩(wěn)定，表現(xiàn)為α-螺旋和β-折疊相對含量逐漸增大。其中β-折疊相對含量在12 h達(dá)到最大，為（53.61±1.15）%，表明β-折疊在MBGFs的淀粉樣纖維化進(jìn)程中大量存在，有助于MBGFs的形成[30]，與ThT熒光檢測結(jié)果相一致。已有報(bào)道均顯示出這類現(xiàn)象，即蛋白質(zhì)淀粉樣纖維的形成涉及二級結(jié)構(gòu)的破壞和重組，最明顯的特征是在淀粉樣纖維成熟時(shí)β-折疊結(jié)構(gòu)大量出現(xiàn)，而更具有靈活性和無重復(fù)的二級結(jié)構(gòu)（β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲）減少[30]。在酸熱處理后期（16～24 h），α-螺旋和β-折疊相對含量顯著下降，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對含量顯著上升（P＜0.05）。研究表明，蛋白質(zhì)中的α-螺旋構(gòu)型含量高有利于其纖維化聚集，對纖維長度的延伸起重要作用[31-32]。這些結(jié)果均證實(shí)，在MBGFs整個(gè)的纖維化進(jìn)程中，MBGFs結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)先有序后無序的變化。

表1 加熱過程中MBGFs的二級結(jié)構(gòu)相對含量
Table 1 Relative contents of secondary structures in MBGFs at different heating times %

注：同列小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

2.1.5 粒徑分布

由圖4A可知，顆粒粒徑大小呈現(xiàn)先上升后急劇下降的趨勢，其中12 h最大，為（226.90±7.95）nm；16～24 h粒徑減小。在酸熱處理0～12 h，顆粒粒徑增大主要是由于構(gòu)建體如蛋白單元或多肽單元的水解釋放，同時(shí)進(jìn)行積極的纖維化聚集，這個(gè)階段稱之為“纖顫準(zhǔn)備階段”；在長時(shí)間加熱后（16～24 h），已成型的纖維化聚集體因持續(xù)酸水解而出現(xiàn)降解，致使粒徑減小[26]，稱為“纖顫逆轉(zhuǎn)階段”。同時(shí)，隨著加熱時(shí)間的延長，MBG粒徑的分布狀態(tài)由三峰逐步轉(zhuǎn)變?yōu)殡p峰，且吸收強(qiáng)度明顯提升，粒徑分布更寬，分布峰向粒徑較大的方向偏移（圖4B），表明酸熱加工下的纖維化聚集反應(yīng)引起蛋白質(zhì)或多肽等構(gòu)建單元粒徑的增大，MBGFs的形態(tài)趨于規(guī)則且分布均勻。

圖4 加熱過程中MBGFs的平均粒徑（A）及粒徑分布（B）Fig.4 Average particle sizes (A) and particle size distribution (B) at different heating times

2.1.6H0分析

作為蛋白質(zhì)纖維化聚集的主要驅(qū)動(dòng)力，酸熱處理下MBG會在疏水相互作用、靜電相互作用和氫鍵的影響下發(fā)生成核聚合反應(yīng)，有序聚集的肽片段首尾相接形成具有高長寬比的淀粉樣纖維[5]。因此，H0提升有助于MBGFs的形成[33]。由圖5可知，隨加熱時(shí)間延長，H0呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，6 h達(dá)到最大。表明0～6 h是MBGFs快速形成的關(guān)鍵階段。H0的增大可能是由于酸熱處理使MBG水解而產(chǎn)生低分子肽，暴露了蛋白質(zhì)分子內(nèi)疏水基團(tuán)，同時(shí)這些疏水基團(tuán)可作為MBG聚集的活性結(jié)合位點(diǎn)[34-35]。當(dāng)加熱時(shí)間大于6 h后，H0逐漸下降，這可能是由于持續(xù)加熱后蛋白質(zhì)或多肽單元發(fā)生了更為劇烈的纖維化聚集，期間以自發(fā)成核的聚集反應(yīng)為主，使得暴露的疏水基團(tuán)被掩埋在纖維化聚集體中，造成H0下降[36]，這與Pang Shuxian等[8]的研究結(jié)果相一致。

圖5 加熱過程中MBGFs的H0Fig.5 H0 of MBGFs at different heating times

2.2 MBGFs乳化特性

2.2.1 MBGFs乳液的EAI及ESI

如圖6所示，將加工環(huán)境的pH值調(diào)整至2.0（0 h），MBG的EAI和ESI顯著提升（P＜0.05）。MBG的等電點(diǎn)在pH 5.0左右[37]，偏離等電點(diǎn)時(shí)表面靜電荷含量提升，溶解性增大，最終改善了MBG的EAI和ESI[38]。在酸熱處理中（2～24 h），MBGFs的EAI和ESI均顯著高于MBG（P＜0.05），表明淀粉樣纖維化提升了MBG的乳化性能，這得益于MBGFs在油-水界面優(yōu)異的不可逆界面吸附和抗聚集性能[7]。另外，隨酸熱處理時(shí)間延長，EAI和ESI呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，4 h MBGFs的EAI和ESI均達(dá)到最大，與MBG相比分別提高160.80%和103.07%。且4 h MBGFs的乳化性能顯著優(yōu)于12 h MBGFs，這可能是由于4 h MBGFs的柔韌性強(qiáng)于12 h MBGFs（圖1），使其易于附著在油滴表面；同時(shí)，持續(xù)酸熱處理后（6～12 h），數(shù)量更多、成熟度更高的MBGFs在乳液中發(fā)生絮凝，導(dǎo)致乳化性能的下降，這種現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在了Pang Shuxian等[8]的研究中。綜上，適度的纖維化（4 h MBGFs）有助于最大程度地提升MBG的EAI及ESI。

圖6 MBGFs乳液的EAI及ESIFig.6 EAI and ESI of emulsions stabilized by MBGFs

2.2.2 MBGFs乳液的蛋白吸附率和界面蛋白吸附量

在乳液中，油滴表面吸附蛋白質(zhì)在降低界面張力的同時(shí)可增加相鄰油滴間阻力，因此吸附的蛋白質(zhì)含量高低直接影響油滴的界面形成，最終影響乳液體系穩(wěn)定性[39-40]。如圖7所示，MBG纖維化過程中，MBGFs的蛋白吸附率和界面蛋白吸附量總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但始終大于MBG。其中酸熱處理4 h時(shí)蛋白吸附率和界面蛋白吸附量最高，分別達(dá)到（80.03±0.30）%和（0.89±0.01）mg/m2。上述結(jié)果表明，淀粉樣纖維化能顯著提升MBG的蛋白吸附率和界面蛋白吸附量，從而有效降低油滴界面層的界面張力，使乳化體系更加穩(wěn)定。通常，與天然蛋白質(zhì)和一些小分子活化劑相比，蛋白質(zhì)淀粉樣纖維在油滴界面具有較高的分離能，吸附形成的界面層彈性強(qiáng)，穩(wěn)定性高，有助于形成更穩(wěn)定的乳液[41]。蛋白吸附效果與淀粉樣纖維的柔性密切相關(guān)，酸熱處理4 h時(shí)MBGFs已經(jīng)成型，柔韌性較高（圖1），這種形態(tài)有助于吸附在油-水界面[42]，從而導(dǎo)致較高的蛋白吸附率和界面蛋白吸附量，與EAI和ESI的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

圖7 MBGFs乳液的蛋白吸附率和界面蛋白吸附量Fig.7 Protein adsorption rates and interfacial protein adsorption quantity of emulsions stabilized by MBGFs

2.2.3 MBGFs乳液的微觀形態(tài)

如圖8所示，MBG乳液油滴體積較大且分布較為無序，這種狀態(tài)下油滴間發(fā)生聚集效應(yīng)，從而不利于乳液體系的穩(wěn)定[43]。pH值調(diào)至2.0時(shí)，絮凝的油滴發(fā)生分離，油滴間空隙加大，分散更為均勻。這主要是因?yàn)榈蚿H值提升了MBG表面正電荷含量，增加了乳液油滴之間的靜電排斥力，導(dǎo)致油滴間的聚集程度下降[38]。隨加熱時(shí)間延長（2～10 h），油滴尺寸減小，分布更加致密有序，尤其是4 h時(shí)，油滴體積較小，分布較為松散。由上述分析可知，加熱4～6 h后，MBGFs形狀更為柔軟，在油-水界面的蛋白吸附能力更強(qiáng)，這些情況將有助于乳液更小油滴的形成和更均勻的排布，提升乳液的均勻性和穩(wěn)定性。Mantovani等[10]的研究顯示，在乳清蛋白淀粉樣纖維所構(gòu)建的乳液中，更小的油滴尺寸和更均勻有序的分布有助于改善乳液的穩(wěn)定性。

圖8 MBGFs乳液的微觀形態(tài)（×200）Fig.8 Microstructures of emulsions stabilized by MBGF (× 200)

2.2.4 MBGFs乳液的表觀黏度

如圖9所示，不同酸熱處理時(shí)間MBGFs乳液樣品的表觀黏度均隨著剪切速率的增大而減小，表現(xiàn)出剪切稀化特性（假塑性流體）[44]。0 h時(shí)，同一剪切速率下，乳液的表觀黏度大于MBG組，原因是極酸性條件下MBG表面水合層被破壞后引起了聚集，最終增大了乳液的黏度[45]。MBGFs乳液的表觀黏度明顯高于MBG，表明MBG淀粉樣纖維化可提升其乳液的黏度，改善乳液穩(wěn)定性。不同加熱時(shí)間下MBGFs乳液的表觀黏度不同，表現(xiàn)為MBGFs（2～12 h）大于MBG組（尤其是4 h MBGFs），變化規(guī)律和EAI及ESI一致，這表明4 h MBGFs有助于乳液網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。另外，加熱時(shí)間為16～24 h的MBGFs乳液表觀黏度低于2～12 h，這可能是由于2～12 h處于纖維成型階段，大量未參與淀粉樣纖維構(gòu)成的纖維單元在乳液中定向聚集，形成了具有較高黏性的蛋白質(zhì)原纖維，最終乳液黏度增強(qiáng)[46-47]。

2.2.5 MBGFs乳液的黏彈性

如圖10所示，所有組別乳液的G′均大于G″，G′和G″未出現(xiàn)交叉點(diǎn)，表明在設(shè)定頻率范圍內(nèi)（0～16 Hz），乳液表現(xiàn)出了凝膠特性，且結(jié)構(gòu)致密、組成單一、富有彈性[48]。pH 2.0處理下MBG乳液的G′明顯增大，可能是調(diào)整pH值后MBG分子中的巰基發(fā)生氧化反應(yīng)，形成的二硫鍵提升了分子間相互作用，并增強(qiáng)了凝膠有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有利于改善G′[49]。與MBG相比，MBGFs乳液的G′和G″明顯增大，表明淀粉樣纖維化有助于改善乳液的黏彈性，進(jìn)而提高乳液穩(wěn)定性。其中4 h MBGFs乳液G′和G″均處于最大值，與上述結(jié)果相一致。乳液凝膠黏彈特性與油滴粒徑相關(guān)，較小的乳液油滴比較大的乳液油滴有更大的G′[50]。與其他組別相比，4 h MBGFs乳液油滴尺寸較小，更多MBGFs被油-水界面吸附，有助于形成均勻、致密的凝膠，從而增強(qiáng)乳液的凝膠性能。

圖10 MBGFs乳液的G′（A）和G″（B）Fig.10 G′ (A) and G″ (B) of emulsions stabilized by MBGFs

3 結(jié)論

本研究探討了MBGFs在形成過程中的結(jié)構(gòu)演變規(guī)律及乳化特性變化情況。酸熱處理下，MBG逐步水解，球狀蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)去折疊，并獲得大量具有自組裝能力的肽片段，期間肽片段發(fā)生定向的淀粉樣纖維化聚集，在疏水相互作用等驅(qū)動(dòng)力下，形成富含β-折疊構(gòu)型且“兩端細(xì)、中間粗”絮狀形態(tài)的長剛性MBGFs。但同時(shí)，長時(shí)間的酸熱處理（＞12 h）會對MBGFs的結(jié)構(gòu)造成破壞。與MBG相比，MBGFs具有更優(yōu)異的乳化性能（尤其是4 h MBGFs），4 h MBGFs將EAI、ESI、蛋白吸附率和界面蛋白含量分別提升了168.80%、103.07%、73.79%和61.57%，且4 h MBGFs乳液的油滴粒徑更小，分散更加均勻有序，具有更高乳液黏度，更易形成凝膠狀的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。本研究為進(jìn)一步理解MBGFs的形成和結(jié)構(gòu)提供了理論依據(jù)，為構(gòu)建新型、高效的植物蛋白基乳化劑提供了一定的方法指導(dǎo)。