雞傳染性喉氣管炎病毒微滴式數(shù)字PCR定量檢測(cè)方法的建立

曾婷婷 黃嬌玲 王盛 李丹 韋悠 李小鳳 任紅玉 阮志華

摘 要 旨在建立檢測(cè)雞傳染性喉氣管炎病毒（infectious laryngotracheitis virus，ILTV）絕對(duì)定量方法。根據(jù)已發(fā)表的雞ILTV的TK基因序列，針對(duì)其保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)1 對(duì)特異引物和1 條探針，建立檢測(cè)雞ILTV的微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）方法，并評(píng)價(jià)其特異性、敏感性和重復(fù)性。結(jié)果顯示，建立方法的最佳引物濃度為 20 μmol/μL，最佳探針濃度為10 μmol/μL，最佳退火溫度為56 ℃。特異性檢測(cè)結(jié)果顯示，建立的方法只檢出ILTV，沒有檢出其他病原株。敏感性檢測(cè)結(jié)果顯示，采用建立的方法定量檢出ILTV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低限為4.6 拷貝/μL。對(duì)3個(gè)連續(xù)稀釋的pMD18-ILTV重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行檢測(cè)，3次重復(fù)檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)均小于5%。對(duì)83份病雞喉拭子、肺及脾組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，采用建立的ddPCR檢出ILTV陽(yáng)性樣品10份，熒光定量PCR檢出ILTV陽(yáng)性樣品9份，ddPCR的陽(yáng)性檢出率（12.05%）高于熒光定量PCR的陽(yáng)性檢出率（10.84%）。結(jié)果表明，建立的ddPCR方法定量檢測(cè)ILTV特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好，為絕對(duì)定量檢測(cè)ILTV提供更好的技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞 雞傳染性喉氣管炎病毒；微滴式數(shù)字PCR；定量檢測(cè)

雞傳染性喉氣管炎病毒（ infectious laryngotracheitis virus，ILTV）主要感染不同品種的雞，引起雞發(fā)生上呼吸道疾病，如流鼻涕、咳嗽等，通常會(huì)出現(xiàn)呼吸啰音，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)呼吸困難及咳出帶血液的滲出物，蛋雞感染還會(huì)引起產(chǎn)蛋下降［1-3］。ILTV一旦感染雞群，傳播速度很快，在很短時(shí)間內(nèi)可導(dǎo)致全部雞感染。ILTV感染除引起雞發(fā)病外，還可導(dǎo)致雞特別是雛雞死亡，病死率10%～70%不等，導(dǎo)致的直接經(jīng)濟(jì)損失巨大［4-6］。

近年來，隨著雞場(chǎng)中普遍使用ILTV疫苗進(jìn)行免疫，雞群中出現(xiàn)大面積暴發(fā)ILTV感染的病例有所降低，但仍有ILTV感染病例的發(fā)生，主要以呼吸道癥狀為主，特征性的癥狀如咳出帶血液的滲出物較少，所引發(fā)的呼吸道癥狀與新城疫、低致病性禽流感、傳染性支氣管炎等表現(xiàn)的呼吸道癥狀類似，單憑臨床癥狀很難作出判斷，需要進(jìn)一步借助實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行確診。目前實(shí)驗(yàn)室常用鑒別診斷ILTV的方法有多種，如普通PCR［7-8］、金標(biāo)試紙條［9］、熒光定量PCR［10-11］等，這些方法中還沒有一種方法能絕對(duì)定量檢測(cè)ILTV，尤其是缺乏針對(duì)低拷貝數(shù)ILTV（如感染早期）的絕對(duì)定量檢測(cè)方法，因此需要建立一種敏感性好的絕對(duì)定量檢測(cè)ILTV方法。

微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是近幾年發(fā)展起來的一種技術(shù)，該方法是將反應(yīng)液通過油包水方式分為獨(dú)立的數(shù)萬個(gè)納米微滴，每個(gè)微滴就是一個(gè)PCR反應(yīng)單元，包含一個(gè)模板拷貝數(shù)，反應(yīng)結(jié)束后讀取逐個(gè)微滴的信號(hào)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法（泊松分布原理）自動(dòng)統(tǒng)計(jì)反應(yīng)的陽(yáng)性微滴與陰性微滴的個(gè)數(shù)，并根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)得出模板的拷貝數(shù)（濃度），從而實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的絕對(duì)定量檢測(cè)。目前該技術(shù)在很多領(lǐng)域包括動(dòng)物疫病病原檢測(cè)方面已有很多成功應(yīng)用的案例［12-14］。

本研究以ILTV TK基因序列為靶序列，針對(duì)其保守區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)引物和1條探針，并在探針的5′端添加FAM熒光基團(tuán)，在3′端添加 ?BHQ1淬滅基團(tuán)。通過優(yōu)化引物濃度、探針濃度和退火溫度等，建立絕對(duì)定量檢測(cè)ILTV的ddPCR方法，為ILTV的定量檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材? 料

1.1.1 試驗(yàn)用毒株 雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）北京（BJ）株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，ILTV K317疫苗株購(gòu)自廣東永順生物制藥有限公司，ILTV CHP50疫苗株購(gòu)自南京寧成生物科技有限公司。雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）Mass 41株、雞新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）LaSota株、禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）S1133株、H9N2亞型禽流感病毒（H9N2 subtype avian influenza virus，H9N2AIV）066C株由廣西獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)研究室保存［15］。雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum，SP）C79-13株和雞大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）O2株購(gòu)自中國(guó)國(guó)家獸醫(yī)微生物菌株保藏管理中心。禽腦脊髓炎病毒（Avian encephalomyelitis virus，AEV）Van株、禽偏肺病毒（Avian metapneumonia virus，aMPV）MN-10株、雞滑液囊支原體（Mycoplasma synovial，MS）K1415株、雞毒支原體（Mycoplasma gallinis，MG）S6株由美國(guó)康涅狄格洲州立大學(xué)Khan教授惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 Supermix for Probe ddPCR （No dUTP）、droplet generation oil for Probes ddPCR、Droplet Reader Oil、DG8Cartridges、DG8gaskets、Pierceable Foil Heat Seal購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司。EasyPureVirual DNA/RNA Kit、Gel Extration Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。TIANamp Bacteria DNA kit購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。RT-PCR擴(kuò)增試劑盒、Premix Ex Taq試劑盒、100 bp DNA? Ladder、pMD18-T、大腸桿菌DH5α、T4連接試劑盒、凝膠回收試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)用雞胚 試驗(yàn)用SPF種蛋購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通公司，SPF雞胚由廣西獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)研究室孵化至所需日齡。

1.1.4 主要儀器 微滴生成儀（QX200 Droplet generator）、熱封儀（PX1）、微滴數(shù)字讀取儀（QX200 Droplet Reader）、梯度PCR擴(kuò)增儀（T-100）購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司。熒光PCR儀（quant Studio 5）、分光光度計(jì)（Nanodrop 2000）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)已發(fā)表的ILTV TK基因（No.S83714.1）保守序列，利用在線https：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/軟件設(shè)計(jì)ddPCR的引物和探針，應(yīng)用BLAST在線比對(duì)設(shè)計(jì)的引物和探針序列，經(jīng)綜合分析后挑選1 對(duì)引物和1 條探針，在探針序列的5′端添加FAM熒光基團(tuán)，3′端添加 ?BHQ1淬滅基團(tuán)。引物及探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并經(jīng)HPLC純化，所設(shè)計(jì)的引物和探針序列見表1。

1.2.2 病毒核酸提取 按EasyPure? Virual DNA/RNA試劑盒說明書提取試驗(yàn)用病毒株的DNA/RNA，按TIANamp Bacteria DNA kit 說明書提取MS、MG、SP及E.coli的DNA，提取的DNA/RNA直接用于擴(kuò)增或于-80 ℃保存，備用。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)模板的制備 用ILTF/ILTR引物擴(kuò)增ILTV? BJ株的TK基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后，將含約243 bp的目的片段切下，按凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行目的片段回收純化，然后與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)染到大腸桿菌DH5α中。轉(zhuǎn)染后的質(zhì)粒DNA經(jīng)PCR鑒定并送寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序正確的質(zhì)粒DNA用分光光度儀測(cè)定濃度，并按公式計(jì)算拷貝數(shù)=（濃度×阿伏加德羅常數(shù)）/（1個(gè)堿基對(duì)的平均分子質(zhì)量×總長(zhǎng)度），所得的重組質(zhì)粒DNA即為標(biāo)準(zhǔn)品，小管分裝并保存于-80 ℃，備用。

1.2.4 ddPCR反應(yīng)的建立及優(yōu)化 20 μL反應(yīng)體系：2×Supermix? 10 μL，5～40 μmol/μL的ILT F/ILT R引物各1 μL，2.5～40 μmol/μL的ILT Pro? 1 μL，標(biāo)準(zhǔn)模板2 μL，加滅菌 ddH2O補(bǔ)足至20 μL。微滴生成：在DG8Cartridges的第二排孔分別加入上述反應(yīng)液20 μL，第三排每孔加入droplet generation oil 70 μL，蓋上DG8gasket，置微滴生成儀上自動(dòng)生成微滴于第一排孔。封膜：吸取生成的微滴至96 孔板內(nèi)，加鋁膜Pierceable Foil Heat Seal置 PX1 熱封儀上，180 ℃? ?10 s進(jìn)行封膜。PCR擴(kuò)增：封膜的96 孔板放入PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，退火溫度為50 ℃ ～60 ℃ 1 min ?（2 ℃/S），共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)；98 ℃ 10 min；4 ℃ 結(jié)束。數(shù)據(jù)讀取及分析：反應(yīng)結(jié)束后將96孔板置QX200 Droplet Reader上讀取信號(hào)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 ddPCR特異性測(cè)定 將H9N2? AIV、IBV、NDV、aMPV、ARV、AEV的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后分別與ILTV BJ、ILTV? K317、ILTV? CHP50、MS、MG、SP、E.coli的DNA加入已優(yōu)化好的ddPCR反應(yīng)體系中進(jìn)行特異性檢測(cè)。

1.2.6 ddPCR靈敏性及重復(fù)性測(cè)定 測(cè)定ILTV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度后，以10倍梯度稀釋，為10-3～10-10，每個(gè)梯度取2 μL加入已優(yōu)化好的ddPCR反應(yīng)體系中，以檢測(cè)ddPCR方法的敏感性。同時(shí)用同樣的引物探針以及同一模板濃度進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，比較兩種方法的敏感性。取10-5～10-7? 3 個(gè)連續(xù)稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，以檢測(cè)ddPCR方法的重復(fù)性。

1.2.7 臨床樣品檢測(cè) 將2020年5月至2021年12月采集的83份病雞喉拭子、肺及脾組織樣品，分別取肺及脾組織樣品約5 g按1∶8（質(zhì)量體積比）加入無血清的MDEM培養(yǎng)基進(jìn)行研磨，喉拭子加入2 mL 無血清的MDEM培養(yǎng)基， ?-70 ℃反復(fù)凍融3 次，4 000 r/min離心5? min，取上清，按Easy Pure Virual DNA/RNA說明書步驟提取樣品中的總DNA。用建立的ddPCR方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)按文獻(xiàn)［10］中熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)效果和符合率。

1.2.8 ILTV分離鑒定驗(yàn)證 對(duì)檢出為ILTV陽(yáng)性的樣品采用雞胚分離鑒定作進(jìn)一步驗(yàn)證，陽(yáng)性樣品經(jīng)“1.2.7”步驟離心后，取上清液，用0.22 μm的濾膜過濾。取濾液尿囊膜接種9日齡的SPF雞胚，每胚接0.2 mL，然后置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，收集24～120 h的死胚和活胚的尿囊膜和尿囊液作為1代分離毒。按照同樣方法繼續(xù)傳代至第3代，觀察尿囊膜及胚體的病變，并取第3代雞胚分離毒提取的核酸用文獻(xiàn)［7］中PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定結(jié)果

挑取的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，結(jié)果擴(kuò)增到大小約243 bp的片段，經(jīng)凝膠回收后送寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序，用MegAlign軟件將測(cè)定的序列與ILTV TK基因（No.S83714.1）序列進(jìn)行Clustal W Method分析，發(fā)現(xiàn)測(cè)定的序列與ILTV TK基因的相應(yīng)序列完全一致，將獲得的重組質(zhì)粒命名為pMD18-ILTV。用分光光度儀測(cè)定重組質(zhì)粒pMD18-ILTV標(biāo)準(zhǔn)品OD260nm/OD280nm的值為1.95，質(zhì)量濃度為46.5 mg/L，按公式計(jì)算拷貝數(shù)為1.44×1010拷貝/μL。

2.2 ddPCR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

由圖1可知，當(dāng)ILTF/ILTR引物濃度和ILTPro濃度分別為20 μmol/μL和10 μmol/μL時(shí)，即ILTF/ILTR終濃度為1 μmol/μL，ILTPro終濃度為0.5 μmol/μL時(shí)，陽(yáng)性微滴信號(hào)強(qiáng)，陽(yáng)性微滴與陰性微滴之間的熒光信號(hào)區(qū)分明顯，此時(shí)的引物、探針濃度為最佳反應(yīng)濃度。采用最佳引物濃度和探針濃度，退火溫度分別設(shè)為50 ℃、51 ℃、52 ℃、54 ℃、55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃、 ?60 ℃進(jìn)行ddPCR反應(yīng)，結(jié)果顯示退火溫度為 ?56 ℃時(shí)，陽(yáng)性微滴信號(hào)（顯示為藍(lán)色）和陰性微滴信號(hào)（顯示為黑色）之間的熒光信號(hào)區(qū)分明顯，擴(kuò)增獲得的陽(yáng)性微滴數(shù)最高，因此確定最佳退火溫度為56 ℃。

2.3 優(yōu)化后的ddPCR反應(yīng)體系及程序

20 μL反應(yīng)體系包括2×Supermix 10 μL，20 μmol/μL ILT F/ILTR引物各1 μL，10 μmol/μL ILTPro? 1 μL，模板DNA/RNA 2 μL，用ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；94 ℃? ?30 s，設(shè)置退火溫度56 ℃ 1 min ?（2? ℃/s），40個(gè)循環(huán)；98 ℃ 10 min；4 ℃結(jié)束。

2.4 ddPCR方法特異性測(cè)試結(jié)果

將H9N2AIV、IBV、NDV、aMPV、ARV、AEV的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后與ILTV? BJ、ILTV? K317、ILTV? CHP50、MS、MG、SP、E.coli的DNA分別作為模板，采用優(yōu)化的ddPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)溫度進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，每孔擴(kuò)增總微滴的生成量均達(dá)10 000以上，且較均衡，說明微滴擴(kuò)增反應(yīng)成立。出現(xiàn)陽(yáng)性微滴的毒株有ILTV BJ、ILTV? K317、ILTV? CHP50，其他毒株無陽(yáng)性微滴出現(xiàn)（圖1）。表明該方法的特異性較強(qiáng)。

2.5 ddPCR方法靈敏性測(cè)定結(jié)果

由圖2可知，ddPCR方法檢測(cè)重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測(cè)限為4.6 拷貝/μL（10-8稀釋，圖2-A），而熒光定量PCR方法最低只檢測(cè)到10-7稀釋的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（45.4 拷貝/μL，圖2-B），沒有檢出10-8稀釋的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。用4個(gè)連續(xù)稀釋的ILTV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)與檢測(cè)陽(yáng)性拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值繪制ddPCR檢測(cè)的絕對(duì)定量曲線，結(jié)果為線性，線性方程為y=-1.06x+ ?8.18，R2值為 0.997? 9。結(jié)果見圖3。

2.6 ddPCR方法重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

采用3 組不同拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品評(píng)估ddPCR方法的重復(fù)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3組3次重復(fù)檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)分別為0.54%、0.53%、 ?2.53%，重復(fù)檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)均小于5%（表2）。表明本方法的重復(fù)性良好。

2.7 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)83份病雞喉拭子、肺及脾組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，ddPCR方法檢測(cè)結(jié)果為ILTV陽(yáng)性的樣品有10份，分別為喉拭子樣品6份、肺組織樣品3份、脾組織樣品1份，檢出拷貝數(shù)為25.1～2 266拷貝/μL，陽(yáng)性檢出率為12.05%（10/83），73份樣品為ILTV陰性。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果為ILTV陽(yáng)性的樣品有9份，分別來自喉拭子樣品6份、肺樣品3份，陽(yáng)性檢出率為10.84%（9/83），ddPCR方法檢出ILTV的陽(yáng)性率高于熒光定量PCR方法。部分樣品檢測(cè)結(jié)果見圖4和表3。

2.8 ILTV分離鑒定驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)ddPCR檢測(cè)為ILTV陽(yáng)性的10份樣品，其中包含熒光定量PCR檢測(cè)為陰性的1份脾樣品，經(jīng)尿囊膜接種9日齡SPF雞胚，并連續(xù)傳代3代。第3 代24 h至120 h的死胚及活胚經(jīng)剖檢后發(fā)現(xiàn)雞胚尿囊膜變厚，膜上出現(xiàn)病毒痘斑，雞胚胚體有出血點(diǎn)。提取第3 代分離毒的核酸，經(jīng)PCR檢測(cè)鑒定，10份都為ILTV陽(yáng)性，從而進(jìn)一步驗(yàn)證ddPCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

3 討? 論

ILTV可引起雞發(fā)病并導(dǎo)致雞死亡，嚴(yán)重危害雞的健康生長(zhǎng)。為了有效防控ILTV感染雞，目前最為有效的方法是采用ILTV疫苗進(jìn)行預(yù)防免疫，可以說疫苗免疫在防控ILTV感染中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，但是由于不同疫苗產(chǎn)生的保護(hù)力不同，在普遍免疫的情況下，雞群中還時(shí)常會(huì)出現(xiàn)ILTV感染的情況，其癥狀與IBV、AIV、NDV等病原引起的呼吸道癥狀相似，難以區(qū)分，確診需要借助實(shí)驗(yàn)室方法。而實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)鑒別的方法多是采用PCR或熒光定量PCR方法，但這兩種方法在病毒載量較低如ILTV感染早期的情況下，第一時(shí)間往往檢測(cè)不到病原，因此需要建立一種針對(duì)低病毒載量的檢測(cè)方法。本研究在ILTV TK基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，通過對(duì)引物濃度及反應(yīng)條件等進(jìn)行優(yōu)化，建立了ILTV? ddPCR檢測(cè)方法，滿足了對(duì)低拷貝病原檢測(cè)的需要，且能絕對(duì)定量。特異性檢測(cè)結(jié)果顯示本方法只檢出ILTV，沒有檢出常見的多種禽病病原且無交叉反應(yīng)，說明本研究建立的ddPCR方法檢測(cè)ILTV是特異的。

在建立ddPCR檢測(cè)方法時(shí)，引物和探針濃度以及退火溫度是影響ddPCR擴(kuò)增的關(guān)鍵條件，為了獲得更好的擴(kuò)增效果，必須對(duì)所用的引物和探針濃度以及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。本研究對(duì)引物和探針濃度以及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)引物和探針終濃度分別為1 μmol/μL和0.5 μmol/μL，即引物與探針濃度比為2∶1，退火溫度為56 ℃時(shí)，獲得ILTV陽(yáng)性微滴信號(hào)（藍(lán)色）最強(qiáng)，陽(yáng)性微滴與陰性微滴（黑色）之間區(qū)分明顯，說明本研究建立的方法獲得了最佳擴(kuò)增效果。

ddPCR方法是在熒光定量PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，且ddPCR方法在定量檢測(cè)和靈敏性兩方面要優(yōu)于熒光定量PCR方法。在定量檢測(cè)方面，熒光定量PCR是通過標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增的Ct值來計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，只能實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量檢測(cè)。而ddPCR方法則是通過直接計(jì)算反應(yīng)的微滴數(shù)來實(shí)現(xiàn)對(duì)拷貝數(shù)的絕對(duì)定量檢測(cè)，且受擴(kuò)增效率的影響較?。?6］，檢測(cè)的結(jié)果較準(zhǔn)確。在靈敏性檢測(cè)方面，已有很多報(bào)道證明ddPCR方法比熒光定量PCR方法靈敏，如劉洋等［17］和石磊等［18］建立的ddPCR檢測(cè)方法其靈敏度比熒光定量PCR方法高10倍。本研究經(jīng)靈敏性檢測(cè)也證明了ddPCR檢測(cè)方法比熒光定量PCR方法靈敏性高10倍，且從4個(gè)10倍倍比稀釋的ILTV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品與測(cè)得值的拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值之間呈良好的線性關(guān)系，進(jìn)一步說明本研究建立的方法是可靠的。本方法的建立將有助于對(duì)低拷貝數(shù)如ILTV感染早期的檢測(cè)診斷，為準(zhǔn)確診斷以及有效防控ILTV感染提供技術(shù)支撐。

用本研究建立的ddPCR方法對(duì)臨床采集的樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用熒光定量PCR方法進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，比較兩者的符合性。通過對(duì)保存的已經(jīng)確定陰陽(yáng)性的83份病雞喉拭子、肺組織及脾組織樣品的核酸進(jìn)行檢測(cè)，ddPCR方法檢出ILTV陽(yáng)性樣品10份，熒光定量PCR方法檢出ILTV陽(yáng)性樣品9份。對(duì)10份ddPCR檢測(cè)為ILTV陽(yáng)性的樣品包含1份熒光定量PCR檢測(cè)為陰性的脾樣品采用雞胚增殖檢測(cè)驗(yàn)證，經(jīng)3代雞胚傳代增殖后，剖檢發(fā)現(xiàn)雞胚尿囊膜上出現(xiàn)病毒痘斑，雞胚胚體有出血點(diǎn)。第3代分離毒的核酸經(jīng)PCR檢測(cè)10份樣品均為ILTV陽(yáng)性，從而進(jìn)一步佐證了ddPCR方法的檢測(cè)靈敏性比熒光定量PCR方法靈敏。雞胚傳代增殖檢測(cè)雖然能獲得較準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，但是由于雞胚傳代增殖周期長(zhǎng)，對(duì)樣品要求高，不能及時(shí)快速作出判斷。在快速檢測(cè)方法中，能定量檢測(cè)ILTV的只有熒光定量PCR方法，而本方法的建立，為絕對(duì)定量檢測(cè)ILTV提供一種更加靈敏的方法。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ CRESPO R，WOOLCOCK P R，CHIN R P，et al.Comparison of diagnostics techniques in an outbreak of infectious laryngotracheitis from meat chickens［J］.Avian Disease，2007，51（4）：858-862.

［2］ GOWTHAMAN V，KOUL M，KUMAR S.Avian infectious laryngotracheitis： a neglected poultry health threat in India［J］.Vaccine，2016，34（36）：4276-4277.

［3］ CRAIG M I，ROJAS M F，VAN DER PLOEG C A，et al.Molecular characterization and cluster analysis of field isolates of avian infectious laryngotracheitis virus from Argentina［J］.Frontiers in Veterinary Science，2017，4：212-219.

［4］ SCHADLER J，SIGRIST B，MEIER S M，et al.Virus-like particles in a new vaccination approach against infectious laryngotracheitis［J］.The Journal of General Virology，2019，100（6）：1013-1026.

［5］ ZHAO Y，KONG C，WANG Y.Multiple comparison analysis of two new genomic sequences of ILTV strains from China with other strains from different geographic regions［J/OL］.PLoS One，2015，10（7）：e0132747［2015-07-17］.https：//doi：10.1371/journal.pone.0132747.

［6］ YAN Z，LI S，XIE Q.et al.Characterization of field strains of infectious laryngotracheitis virus in China by restriction fragment length polymorphism and sequence analysis［J］.Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2016， ?28（1）：46-49.

［7］ 劉加波，謝芝勛，謝志勤，等.應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增雞傳染性喉氣管炎病毒TK基因的研究［J］.中國(guó)獸醫(yī)科技，2000，30（4）：10-12.

LIU? J? B，XIE ZH? X，XIE ZH? Q，et al.Development and application of infectious laryngotracheitis virus by polymerase chain reaction［J］.Chinese Journal of Veterinary Science and Technology，2000，30（4）：10-12.

［8］ HUMBEND J，GARCIA M，RIBLET S M，et al.Detection of infectious laryngotracheitis virus in formalin-fixed，paraffin-embedded tissues by nested polymerase chain reaction［J］.Avian Disease，2002，46（1）：64-74.

［9］ YU J F，LIN Y，CAO Y，et al.Development and application of a colloidal gold test strip for the rapid detection of the infectious laryngotracheitis virus［J］.Poultry Science，2020，99（5）：2407-2415.

［10］ WANG W J，WANG C G，ZHANG Z C，et al.Rapid detection of avian infectious laryngotracheitis virus with real-time fluorescence-based recombinase-aided amplification［J］.Poultry Science，2020，99（10）：4809-4813.

［11］ MAHMOUDIAN A，KIRKPATRICK N C，COPPO M， ?et al.Development of a SYBR green quantitative polymerase chain reaction assay for rapid detection and quantification of infectious laryngotracheitis virus［J］.Avian Pathology，2011，40（3）：237-242.

［12］ 原 霖，董 浩，倪建強(qiáng)，等.非洲豬瘟病毒微滴數(shù)字 PCR 檢測(cè)方法的建立［J］.畜牧與獸醫(yī)，2019，51（7）：81-84.

YUAN L，DONG H，NI J Q，et al.Development of droplet digital PCR for detection of African swine fever virus ［J］.Animal Husbandry &Veterinary Medicine，2019，51（7）：81-84.

［13］ PINHEIRO L B，COLEMAN V A，HINDSON C M，et al.Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification［J］.Analytical Chemistry，2012，84（2）：1003-1011．

［14］ 譚建錫，禹思宇，唐連飛，等.H1亞型豬流感病毒微滴數(shù)字RT-PCR定量檢測(cè)方法的建立［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2019，36（11）：77-82.

TAN J X，YU S Y，TANG L F，et al.Establishment of a droplet digital RT-PCR? method for detection of H1 subtype swine? influenza virus［J］.China? Academic Journal，2019，36（11）：77-82.

［15］ 謝志勤，謝芝勛，鄧顯文，等.雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽肺炎病毒三重RT-PCR檢測(cè)方法的建立［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2017，53（2）：6-9，13.

XIE ZH Q，XIE ZH X，DENG X W，et al.Development of a rapid and sensitive test for identification of Newcastle disease，H9 subtype avian influenza virus and avian pneumovirus by triplex RT-PCR［J］.Chinese Journal of Veterinary Medicine，2017，53（2）：6-9，13.

［16］ 郭宏偉，趙緒永，李華瑋，等.數(shù)字PCR技術(shù)在動(dòng)物疫病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2021，42（2）：102-106.

GUO H W，ZHAO X Y，LI H W，et al.Progress on application of digital PCR in animal diagnosis［J］.Progress in Veterinary Medicine，2021，42（2）：102-106.

［17］ 劉 洋，李 翔，原 霖，等.鴨坦布蘇病毒微滴式數(shù)字RT-PCR定量檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用［J］.中國(guó)家禽，2021，43（8）：25-29.

LIU Y，LI X，YUAN L，et al.Development of droplet digital RT-PCR for the detection of duck tambusu virus［J］.China Poultry，2021，43（8）：25-29.

［18］ 石 磊，溫 雯，陳 洵，等.豬鏈球菌微滴數(shù)字PCR定量檢測(cè)方法的建立［J］.現(xiàn)代食品科技，2019，35（1）：233-238.

SHI L，WEN W，CHEN X，et al.Development of droplet digital PCR for the detection of streptococcus suis［J］.Modern Food Science and Technology， 2019，35（1）：233-238.

Establishment of Droplet Digital PCR Quantitative Detection Method? for Detection of Infectious Laryngotracheitis? Virus

Abstract The aim of present study is to develop and evaluate a droplet digital PCR （ddPCR） for detection of infectious laryngotracheitis virus（ILTV）. Specific oligonucleotide primers and probe were designed and synthesized to recognize the genomic sequences of the thymidine kinase （TK） gene of ILTV based on published reference sequences of ILTV. After the reaction conditions were? optimized ，the ddPCR was used to detect ILTV with the selected primers and probe. The specificity，sensitivity and reproducibility of ddPCR were subsequently evaluated. The results showed that the optimal concentrations of primers and probe were 20 μmol/μL and 10 μmol/μL，respectively. The annealing temperature was 56 ℃.Only ILTV strains were dectected? with the established? ddPCR，but other avian pathogens in the specificity tests were not detect . The minimum limit for quantitative detection of pMD18-ILTV recombinant plasmid DNA was 4.6 copies/μL. Three independently repeated experiments showed that the coefficients of variation were all less than 5% for detection of the three serially diluted pMD18-ILTV recombinant plasmid. Eighty three samplessuch as throat swabs，lungs and spleens collected from sick chickens were examined. Ten samples were tested positive for ILTV by ddPCR and the positive detection rate was 12.05%. Nine samples were tested positive for ILTV by fluorescent quantitative PCR and the positive detection rate was 10.84%. The sensitivity of ddPCR for the tested samples was slightly higher compared with that of the fluorescent quantitative PCR. The ddPCR described in this study was highly specific，sensitive and reproducible for detection of ILTV. The established ddPCR in our lab may provide an alternative means for absolute quantitative detection of ILTV.

Key words Infectious? laryngotracheitis virus （ILTV）; Droplet digital PCR （ddPCR）; Quantitative detection